專利名稱：化學修飾的干擾素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及對共有干擾素(consensus interferon)的修飾，更具體地說，涉及重組共有干擾素的新糖基化(neoglycosylated)類似物組合物，其中糖基配體結(jié)合于重組共有干擾素。
背景技術(shù)：
干擾素是細胞因子的一個亞類，既具有抗病毒活性，又具有抗增殖活性。根據(jù)其生物化學和免疫學特征，人干擾素可分為三類α-干擾素(白細胞干擾素)，β-干擾素(成纖維細胞干擾素)，及γ-干擾素(免疫干擾素)。通過對編碼這些多肽的DNA進行分離和測序，已經(jīng)確定了至少14種具有不同氨基酸序列的α-干擾素(又可分為亞型A-H)。α-干擾素由于其抗病毒和抗腫瘤生長的抑制作用，作為一種潛在的治療藥劑受到了相當大的關(guān)注。
目前在美國和其它一些國家已準許將α-干擾素用于治序多毛細胞白血病、性器官疣、卡氏肉瘤(一種通常折磨獲得性免疫缺損綜合癥(艾滋病)病人的癌)及慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染。α-干擾素的如下二種變異體已獲準用于治療以商品名Roferon-A銷售的α-干擾素-2a，以及以商品名INTRONA銷售的α-干擾素-2b。
除所標明的適應癥外，α-干擾素正用于通過單獨給藥或者與化學治療藥劑聯(lián)合用藥，治療其它多種細胞增殖性疾病，或?qū)ζ溥M行療效評定，這些疾病包括慢性骨髓性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、淺表膀胱癌、皮膚癌(基底細胞癌和惡性黑素瘤)、腎細胞癌、卵巢癌、低級淋巴細胞和表層T細胞淋巴瘤、以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤。通過與其它化學治療藥劑聯(lián)合給藥，α-干擾素可有效地治療由肺癌、結(jié)腸癌和乳房癌產(chǎn)生的實體腫瘤(見Rosenberg等，“生物治療原理和應用”，《癌腫瘤學原理和實踐》第3版，Devita等編，pp.301-547(1989)，Balmer DICP，AnnPharmacother24，761-768(1990))。
已知α-干擾素能影響多種細胞功能，包括在正常細胞和異常細胞中的DNA復制及RNA和蛋白質(zhì)合成。因此，干擾素的細胞毒性作用不局限于腫瘤細胞或病毒感染的細胞，它也對正常、健康的細胞也有同樣的影響。結(jié)果，在干擾素治療過程中，特別是需要用大劑量時，會產(chǎn)生不良的副作用。以干擾素給藥能導致骨髓抑制作用，引起紅血細胞、白血細胞和血小板數(shù)量減少。更高劑量的干擾素給藥通常會引起流感樣癥狀(例如發(fā)熱、疲勞、頭痛和寒戰(zhàn))，胃腸道紊亂(例如厭食、惡心和腹瀉)、眩暈以及咳嗽。
天然人類β-干擾素是一種糖蛋白，表觀分子量約22-23KDa，抗病毒比活性為2-5×108國標單位(IU)/毫克蛋白質(zhì)。人β-干擾素(IFN-β)已用于臨床治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑素瘤、病毒性皮膚病和肝炎，見《干擾素，原理及醫(yī)學應用》，第一版(1992，Univ of TexasMedical Branch of Galveston)P107-116。
美國專利4,695,623和4,897,471號公開了新的干擾素多肽，其氨基酸序列含有在天然存在的α-干擾素亞型多肽中各個位置發(fā)現(xiàn)的，常見的或者占優(yōu)勢的氨基酸，該多肽被稱為共有干擾素(IFN-con)。所公開的特異性IFN-con氨基酸序列，被定名為IFN-con1，IFN-con2和IFN-con3。編碼IFN-con的人工合成基因的制備和該基因在大腸桿菌中的表達也已公開。
Klein等(J.Chromatog.454，205-215(1988))描述了對大腸桿菌產(chǎn)生的IFN-con1的純化方法。據(jù)報導，按這種方法純化的IFN-con1，當用人T98G細胞系進行細胞病變效應抑制作用測定時，比活性為3×109單位/毫克蛋白質(zhì)(Fish等，J.Interferon Res.9，97-144(1989))。
美國專利5,372,808號公開了用共有干擾素治療疾病的方法。表明當IFN-con用于治療對α-干擾素治療敏感的疾病時，對病人不會引起與用α-干擾素同樣程度的副作用。并進一步表明，可用3-5倍更高劑量的IFN-con，得到了更好的治療效果，而不良副作用出現(xiàn)的頻率或嚴重程度基本上沒有相應增加。
因為可以達到最大治療效果而具有低不良副作用的干擾素劑型仍然不消楚，因此有必要開發(fā)改進型干擾素用于治療。開發(fā)改進型干擾素用于治療將具有很大的益處，可允許大劑量給藥而沒有不良副作用。因此，本發(fā)明的目的之一是提供含有與半乳糖殘基結(jié)合的干擾素改進型干擾素，用于治療對干擾素治療敏感的疾病。本發(fā)明的另一個目的是提供可以選擇性地將干擾素輸送至肝臟的組合物，由此在對如慢性HCV類疾病的抗病毒治療中增加干擾素與肝細胞表面受體結(jié)合的機會，并減少干擾素與其它器官不必要的結(jié)合。
發(fā)明概述本發(fā)明包括重組共有干擾素的新糖基化類似物。本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)，即多乳糖配體能夠與IFN-con結(jié)合，形成新糖基化型IFN-con(lac IFN-con)。優(yōu)選地，乳糖配體是通過IFN-con的賴氨酸ε-NH2和N-末端胺與之結(jié)合的。與天然共有干擾素相比較，lac IFN-con對肝臟有高度靶向作用。
優(yōu)選的情況是IFN-con是具有IFN-con1，IFN-con2或IFN-con3氨基酸序列的多肽，并且結(jié)合物的每個IFN-con具有1-10個糖殘基。最優(yōu)選的是，IFN-con具有IFN-con1氨基酸序列，新糖基化IFN-con的每個IFN-con分子具有4-7個乳糖殘基。
本發(fā)明還涉及到一種藥物組合物，它含有治療有效量的lac IFN-con，此外還含有適當?shù)南♂寗?、輔藥、載體、防腐劑和/或助溶劑。這些組合物對治療那些通常對IFN-con治療敏感的疾病可能有好處。
本發(fā)明還包括一種把干擾素直接輸送至病人肝臟的方法，包括給病人施用治療有效量的化學修飾的干擾素，該化學修飾的干擾素含有與至少1個糖基配體結(jié)合的干擾素，其中的配體含有末端半乳糖，并且所述干擾素選自IFN-α、IFN-β和IFN-con。
附圖詳述

圖1是顯示從IFN-con和乳糖通過還原性胺化作用制備lac IFN-con的示意圖。
圖2顯示在標示的時間間隔，在倉鼠肝臟中積累所注射的放射性標記的IFN-con(-L-)和lac IFN-con(-O-)的百分數(shù)。短線(bar)表示標準差(n＝3)圖3顯示大鼠體內(nèi)放射性標記IFN-con的生物分布。按標示的時間間隔測定的所注射劑量的百分數(shù)。
圖4顯示大鼠體內(nèi)放射性標記lac IFN-con的生物分布。按標示的時間間隔測定的所注射劑量的百分數(shù)。
圖5顯示倉鼠靜脈內(nèi)給藥(300μg/kg)后，IFN-con(-□-)和lacIFN-con(-O-)的血清藥物動力學。以血清中干擾素濃度對時間作圖。短線表示標準差(n＝3)。
圖6顯示倉鼠靜脈內(nèi)給予IFN-con(-□-)，lac IFN-con(-O-)，和磷酸鹽緩沖液賦形劑(-△-)后，在不同時間點測定的血清內(nèi)2-5A合成酶活性。短線表示標準差(n＝3)。
圖7顯示下述各組動物的存活率未治療的EMCV感染倉鼠(-O-)，預先注射IFN-con的EMCV感染倉鼠(-□-)，或預先注射lac IFN-con的EMCV感染倉鼠(-◇-)。對動物每天監(jiān)測2次，共27天。
發(fā)明詳述本發(fā)明所使用的人白細胞共有干擾素(IFN-con)，指的是一種非天然存在的多肽，它主要含有那些為所有天然存在的人白細胞干擾素亞型序列共有的氨基酸殘基，并且在一個或多個非所有亞型共有的氨基酸的位置，包含主要存在于該位置的氨基酸，而不含有在至少一個天然存在的亞型中的那個位置不存在的任何氨基酸殘基。IFN-con包括，但不局限于被定名為IFN-con1、IFN-con2和IFN-con3的氨基酸序列，在共有的美國專利4,695,623和4,897,471號中公開了這些序列，這些專利的全部公開內(nèi)容在此引入作為參考 編碼IFN-con的DNA序列可以按上述專利中所述，或者其它的標準方法合成。
IFN-con多肽優(yōu)選的是被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染進入細菌宿主(特別是大腸桿菌)的人工DNA序列的表達產(chǎn)物。也就是說，IFN-con優(yōu)選地是重組IFN-con。重組IFN-con優(yōu)選地在大腸桿菌中產(chǎn)生，并且通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進行純化，如在Klein等，同上(1988)中對IFN-con1的一般性描述，純化的IFN-con還可能含有同種型(isoform)的混合物，例如純化的IFN-con1可能含有甲硫氨酰基IFN-con1，去甲硫氨?；鵌FN-con1，如帶有被封閉的N-末端的去甲硫氨?；鵌FN-con1的混合物(Klein等，同上(1990)?？蛇x地，IFN-con可能含有特異性的，被分離的同種型?？赏ㄟ^本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的技術(shù)如等電聚焦法將IFN-con的同種型彼此分離。
本發(fā)明的化學修飾IFN-con每蛋白分子中將含有至少一個含末端半乳糖的糖基配體。這種糖基配體可選自半乳糖、末端糖基低聚糖、脫唾液酸糖肽和脫唾液酸糖蛋白。如果糖基配體是單糖，那么通常是半乳糖。本發(fā)明的低聚糖通常是那些至少具有二個糖基基元的，其中無論何種情況在低聚糖的末端應連接有半乳糖殘基。適于連接于IFN-con的某些代表性低聚糖是乳糖、N-乙酰乳糖胺和半乳聚糖。優(yōu)選地，新糖基化IFN-con類似物應含有4-7個配體，而糖基配體應該是低聚糖。最優(yōu)選的是，新糖基化IFN-con類似物含有4-7個配體，并且糖基配體是乳糖。多配體優(yōu)選地是相同的，但本發(fā)明也包括配體的混合物。
通過若干常規(guī)的方法可以得到本發(fā)明的新糖基化IFN-con類似物。對這些方法已被充分地總結(jié)，見Kataoka和Tavassoli，Jour.of Histochem.and Cytochemistry，321091-1098(1984)；Chipowsky and Lee，Carbohy，Research 31339-346(1973)和其中引用的參考文獻。優(yōu)選地借助于將多糖基配體，通過活性氨基酸殘基如賴氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或天冬酰胺與蛋白質(zhì)分子主鏈結(jié)合的方法來得到新糖基化IFN-con類似物。最優(yōu)選的是借助于將多糖基配體，通過IFN-con的賴氨酸ε-NH2和/或N-末端胺與之結(jié)合的方法，來得到新糖基化IFN-con類似物。這種化學修飾作用，是通過在一定的反應條件下，使糖基配體與IFN-con反應來實現(xiàn)，優(yōu)選的反應條件是不引起變性的條件，并且有足夠量的配體，使氨基易發(fā)生還原性胺化作用。在一個優(yōu)選的實施方案中，糖基配體是乳糖，反應在pH7.0進行，需要加入還原劑如氰基氫硼化鈉，其摩爾數(shù)大大過量，并控制反應條件，使得到的類似物每個蛋白質(zhì)分子含有4-7個乳糖配體。專業(yè)人員容易確定用于控制這種反應的措施。
因為本發(fā)明的方法提供了基本均一的被修飾的IFN-con制備物，所以本發(fā)明也包括提供一種藥物組合物，其含有治療有效量的lac IFN-con，所述lac IFN-con與藥用載體、稀釋劑、防腐劑、助溶劑、輔藥和/或乳化劑等構(gòu)成混合物。見Remington′s Pharmaceutical Sciences，18thEdition(1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA18042)P1435-1712，在此引入作為參考。所用“基本均一的”一詞，意指所發(fā)現(xiàn)的唯一新糖基化IFN-con類似物，是每個蛋白質(zhì)分子含有4-7個連接的配體。該制備物中還可能含有未反應的蛋白質(zhì)(即沒有糖基配體的)。優(yōu)選地，化學修飾的IFN-con至少占整個產(chǎn)物的90％(如下述實施例中的)，最優(yōu)選的是，化學修飾的IFN-con在整個產(chǎn)品中≥98％。
本發(fā)明試圖得到的化學修飾的IFN-con，是在如實施例1中所述的生物學測定法中有活性的一種類似物。與天然IFN-con的活性相比較，該類似物具有至少50％的活性。優(yōu)選地，該類似物具有至少60％的活性。在這些測定法中，專業(yè)人員能夠容易地評價這些類似物，并確定它們是否有活性。
一般來說，本發(fā)明的組合物可以象前述的IFN-con一樣被應用，并預期該組合物能用于治療IFN-con能治療的疾病。例示性的疾病包括，但不局限于細胞增殖紊亂和病毒感染。
IFN-con能治療的病毒性疾病包括，但不局限于甲型肝炎、丙型肝炎、其它非甲非乙型肝炎、乙型肝炎、皰疹病毒(EB病毒，CML病毒，單純皰疹病毒)，乳頭狀瘤，痘病毒，細小核糖核酸病毒，腺病毒，鼻病毒，HTLVI，HTLVII，以及人類輪狀病毒。IFN-con對治療常常與癌癥有關(guān)的細胞增殖紊亂也是有效的。這類疾病包括，但不局限于多毛細胞白血病和卡氏肉瘤。所治療的疾病優(yōu)選地是肝病。
IFN-con可以單獨使用，或者與一種或幾種刺激髓樣細胞增殖或分化的因子聯(lián)合使用，這些因子例如粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，白介素-1(IL-1)，白介素-3(IL-3)，白介素-6(IL-6)，促紅細胞生成素，干細胞因子(SCF)，以及巨核細胞生長和發(fā)育因子(MGDF)。
按本發(fā)明的意圖，用化學修飾IFN-con進行的治療與用α-干擾素進行的治療相比較，前者將具有更高的療效，并基本上減輕或消除了副作用。預期將出現(xiàn)的副作用的減輕或消除與所治療的疾病無關(guān)。更具體地說，因為以含有末端半乳糖殘基的配體修飾的IFN-con，將在肝細胞表面選擇性地與結(jié)合脫唾液酸-糖蛋白的受體相結(jié)合，所以可以進一步預期，被修飾的IFN-con對治療肝臟疾病如HCV將特別有用。
因為本發(fā)明的化學修飾干擾素是針對肝臟的，因此本發(fā)明也試圖提供一種直接將干擾素輸送至病人肝臟的方法，包括對病人施用治療有效量的本發(fā)明的化學修飾干擾素。試圖用于此方法的干擾素包括IFN-α、IFN-β和IFN-con。IFN-α和IFN-β含有賴氨酸殘基，該殘基能夠按照與在詳述的實施例中對IFN-con所述的相類似方法，用糖基配體進行化學修飾。
在治療一種具體的疾病時，化學修飾的干擾素的有效量將取決于該疾病的性質(zhì)和其它一些因素，可以通過標準的臨床技術(shù)，或者基于對干擾素已經(jīng)確立的劑量或規(guī)范來確定。
下述實施例將更詳細地闡述本發(fā)明的各個方面。
實施例1本實施例將對化學修飾的人重組共有干擾素進行說明。更具體地說，本實施例將對制備新糖基化IFN-con1均一制備物的方法，以及對該制備物鑒定的方法進行說明。
A.共有干擾素的制備將美國專利4,695,623號的圖2中描述的IFN-con1用于制備新糖基化的人重組共有干擾素，該專利被全部引入作為參考。IFN-con1是通過在細菌體內(nèi)表達外源性DNA而制備的，在其N-末端含有一個甲硫氨?；鶜埢?br> B.Lac IFN-con的制備Lac IFN-con是如在圖1中所描述，通過以IFN-con的賴氨酸ε-NH2和N-末端胺結(jié)合多乳糖配體而制備的。概括地說，該結(jié)合反應可按如下所述進行將β-D-乳糖(Sigma，St.Louis，Mo)溶解于含有IFN-con1的磷酸緩沖液(PBS)中，配制各種摩爾比的乳酸IFN-con溶液。反應在室溫下進行，攪拌反應不同的時間，并且每天對反應混合液加入二次氰基氫硼化鈉(NaBH3CN)(Sigma，St.Louis，Mo)。用16％SDSPAGE對反應的進程進行監(jiān)測。然后停止反應，使反應混合通過Sephadex G-25柱(Sigma，St.Louis，Mo)，以PBS洗脫除去未反應的乳酸和NaBH3CN。
對蛋白質(zhì)用Pharmacia HiLoad Superdex 75pg 26/60柱(Piscataway，NJ)通過FPLC作進一步純化，以PBS洗脫，流速1.2ml/min，并在280nm下監(jiān)測吸光度。收集2ml的級分，將含蛋白質(zhì)的級分合并在一起。用Pharmacia Superose 12 H/R 10/30柱(Piscataway，NJ)或PhenomenexBioSep SEC-2000柱( Torrance，CA)，通過凝膠過濾HPLC對純化的lac IFN-con制備物進行分析，以PBS洗脫，流速0.5ml/min。衍生的蛋白質(zhì)用16％SDS-PAGE凝膠(Novex，San Diego，CA)和pH3-10的等電聚焦凝膠(Novex，San Diego，CA)，以及質(zhì)譜分析法進行鑒定。
通過對各種因素如反應pH，反應時間和試劑的濃度等進行研究，可使反應條件最優(yōu)化。pH的效應是通過在室溫下，在pH4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5和7.0的PBS中，使反應進行三天來研究的?？山柚?6％SDS-PAGE監(jiān)測反應的進程。在較高的pH，由于氨基基團較少被質(zhì)子化，而更易受到醛式乳糖的親核攻擊，使衍生作用的程度較高。基于從凝膠過濾HPLC得到的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在所有的反應條件下，僅有不大于10％的衍生蛋白質(zhì)是二聚體或聚合體，除了在pH5.5下進行的反應外，因為IFN-con的等電點是5.7。
發(fā)現(xiàn)加入反應物中的還原劑的量會直接影響反應的進程以及蛋白質(zhì)變性的程度。為了維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，氰基氫硼化鈉在加入反應液之前，溶于水中配成10M的溶液，在反應過程中，每日二次加入高達20,000摩爾過量的還原劑，可加速反應進程，而在這種處理之下，可檢測出最小量的聚合作用。
C對lac IFN-con的鑒定測定了衍生蛋白質(zhì)糖基化的程度和在體外的生物活性。用于這個分析的lac IFN-con可按如下方法制備將1gβ-D-乳糖溶解于含有12.5mg IFN-con1的5ml PBS中。反應在室溫下攪拌進行4天，每天二次向反應混合物中加入50mg氰基氫硼化鈉(NaBH3CN)。
乳糖修飾的IFN-con的分子量可用Kracos Kampact MALDI-TOF質(zhì)譜儀，通過質(zhì)譜分析來確定。連接于IFN-con的乳糖分子數(shù)目可如下計算從近似分子量中減去19516，然后用326(乳糖-氧)除此得數(shù)。
可通過測定在培養(yǎng)細胞系中對病毒復制的抑制作用來評價其體外生物活性。將HeLa細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔15000個細胞，在加有10％FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Dulbecco′s改性Eagles培養(yǎng)基(DMEM))。中，5％CO2下，37℃培養(yǎng)24小時，DMEM含有如下成分青霉素100單位/ml，鏈霉素100mg/m，2mM L-谷氨酰胺，1重量％的非必需氨基酸，0.1重量％的硫酸谷氨酰胺和1％HEPES緩沖液)。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基和0.2％FBS中，將IFN-con和lac IFN-con配制成多個稀釋度。取標準的和適當稀釋度的IFN-con及l(fā)ac IFN-con各100ml加入每個孔中。再培養(yǎng)19-23小時之后，吸出培養(yǎng)基，以100ml攻擊的病毒，即腦心肌炎病毒(EMCV)代替，在含有1％FBS的DMEM中配制成稀釋度等于100-1000組織培養(yǎng)感染劑量(TCID)單位。將該培養(yǎng)板再培養(yǎng)22小時，除去培養(yǎng)基，以200ml無水甲醇將細胞固定5分鐘。除去固定液，使細胞在0.5％Gentian染料中染色30分鐘，然后漂洗去游離的染料，細胞在空氣中干燥1-2小時。再用200ml乙二醇一乙醚洗脫染料，振搖30分鐘。用88026型Vmax Kinetic微量培養(yǎng)板測定儀(MolecularDevices)在650nm測定每個孔的吸光度。作為標準的結(jié)果是以IFN-con的對數(shù)濃度對染料吸收度的百分數(shù)作圖，這樣可以確定IFN-con和lac IFN-con的生物活性。
對四個不同制備物的上述分析結(jié)果顯示在表I中。效力是以IFN-con的活性＝1時的比較結(jié)果。
表 1制備物乳糖數(shù)目效力IFN-con0 1lacIFN-con#1 4 55lacIFN-con#2 5 60lacIFN-con#3 6 62lacIFN-con#4 7 55表I數(shù)據(jù)顯示，在最佳反應條件下，得到的lac IFN-con平均有5-6個乳糖殘基連接于IFN-con。這些lac IFN-con類似物的體外平均生物活性為6.4×108U/mg，與之相比較，IFN-con的為11×108U/mg。
實施例2本實施例涉及用如實施例1中制備的IFN-con和lac IFN-con進行的生物分布研究。通過研究125I標記蛋白質(zhì)在倉鼠和大鼠體內(nèi)的整體分布，來確定乳糖結(jié)合的IFN-con的組織定向的能力。
A.IFN-con和lac IFN-con的碘化碘化作用方法是對Fraker和Speck，Biophys.Res.Comm.，80849-857(1978)中所述的方法稍加改變。在12×75mm硼硅酸鹽試管中稱取3mgIODO-GEN(Pierce)，然后溶于100μl CHCl3中，在緩慢的N2流中干燥，使之在試管內(nèi)形成一層薄膜。向該試管內(nèi)加入溶于PBS的(125I)碘化鈉(12μl，1.2mCi)(New England Nuclear)和600μg蛋白質(zhì)，在冰浴中反應10分鐘。再將此反應物轉(zhuǎn)移至含有20μl(110nmol)對羥基苯甲酸的1.5ml eppendorf試管中，在冰浴上反應10分鐘。碘化的蛋白質(zhì)用預先以25ml含有1％BSA和0.05％Triton X100的PBS以及25mlPBS逐步預平衡過的PD-10柱(Pharmacia)進行純化。收集0.5ml的級分并計數(shù)放射活性。將含有碘化蛋白質(zhì)的級分合并，并通過以6％三氯酸終溶液的沉淀作用，測定由于未結(jié)合的125I導致的放射性沾染。
B.在倉鼠體內(nèi)的生物分布分析雄性Syrian-Golden倉鼠(85-130g)得自Charles River實驗室，在21℃可控環(huán)境中維持12/12小時的光暗循環(huán)。Purina Chow飲食和水可隨意獲得。動物運來以后，分成2只一籠和5只一籠，喂養(yǎng)適應1周。對每組3只倉鼠(85-130g)，通過陰莖靜脈，以2mg/kg的劑量(2×107cpm/倉鼠)靜脈內(nèi)給予125I標記的蛋白質(zhì)。在給藥后的3，15，30，60和120分鐘，將動物活殺，測定與器官結(jié)合的放射活性。在不同的時間點，測定每克器官重量中的所注射劑量的百分數(shù)。數(shù)據(jù)歸納于表2中。
表2IFN-con和lac IFN-con在倉鼠體內(nèi)的生物分布1組織 3分鐘15分鐘 30分鐘 60分鐘 120分鐘血液218.4(1.18) 4.23(0.52) 2.63(0.25) 1.30(0.13) 1.14(0.33)4.94(0.8)2.37(0.34) 1.99(0.2)1.15(0.0)0.90(0.2)肝31.58(0.76) 1.42(0.18) 0.95(0.11) 0.75(0.51) 0.33(0.06)4.71(0.4)4.18(0.2)2.04(0.1)0.72(0.0)0.48(0.0)腎425.80(9.6) 67.54(11)23.08(2.5) 13.28(0.8) 5.09(0.8)20.9(3.6)36.8(3.9)23.2(5.2)11.1(0.2)5.28(0.2)脾 0.58(0.18) 0.44(0.18) 0.29(0.11) 0.28(0.01) 0.14(0.03)0.36(.05)0.62(.04)0.19(..2)0.26(.08)0.18(.02)肺 0.21(0.02) 0.24(0.01) 0.26(0.00) 0.16(0.05) 0.38(0.16)0.19(.01)0.20(.11)0.20(.02)0.08(.01)0.06(.01)十二指腸5 0.66(0.02) 0.59(0.05) 0.70(0.00) 1.04(0.13) 0.65(0.11)0.36(.04)0.49(.02)0.78(.09)0.48(.13)0.69(.37)腦 2.05(0.84) 1.11(0.06) 0.77(0.09) 0.76(0.04) 0.65(0.06)0.75(.11)0.34(.01)0.57(.03)0.25(.00)0.38(.28)心 1.75(0.29) 0.97(0.14) 0.99(0.19) 0.42(0.03) 0.47(0.02)1.29(.34)0.68(.15)0.61(.02)0.43(.05)0.27(.05)1上面的數(shù)字是對INF-con的測定值，下面的黑體數(shù)字是對lac INF-con的測定值。括號內(nèi)的數(shù)字是標準差(S.D)(n＝3)。
2計算值來自所收集的血液，并假定動物總體重的7.3％是血液。
3是從肝臟的一葉測定的放射活性，被計算為整個器官的放射活性。
4是從一側(cè)腎測定的放射活性，加倍計算為雙側(cè)腎的放射活性。
5是對10cm十二指腸測定的放射活性。
如在表2和圖2中所顯示的，靜脈注射后藥物立即分布于體循環(huán)內(nèi)，并且3-5分鐘之后lac IFN-con迅速積累在肝臟中。與lac IFN-con相比，天然IFN-con在肝臟中的積累量小于其1/3。并且，這種比天然IFN-con高的積累水平，可維持至少30分鐘。
C.大鼠體內(nèi)生物分布分析雄性Sprague-Dawley大鼠(250-300g)得自Charles River實驗室，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在21℃，維持12/12小時的光暗循環(huán)?？呻S意得到Purina Chow飲食和水。將動物分成2只一籠和5只一籠。對每組3只大鼠(250-300g)，通過陰莖靜脈，以12μg/kg的劑量(2×106cpm/大鼠)靜脈內(nèi)給予125I標記的蛋白質(zhì)。在給藥后的5，60和360分鐘將動物活殺，分離出完整的器官用于測定總的聯(lián)合放射活性。測定在不同的時間點，每克器官內(nèi)存在的所注射劑量的百分數(shù)。數(shù)據(jù)歸納于表3中。
表 3IFN-con和lac IFN-con在大鼠體內(nèi)的生物分布1組織 5分鐘 60分鐘360分鐘血液229.92(1.61)6.67(0.21)2.96(0.05)5.96(0.16) 4.56(0.27)2.29(0.13)肝311.01(0.45)3.30(0.20)1.46(0.06)40.14(1.73)4.85(0.37)1.64(0.12)腎418.81(2.11)2.42(1.91)0.68(0.02)6.69(0.33) 1.50(0.34)0.37(0.02)脾 0.66(0.03) 0.18(0.02)0.06(0.01)0.15(0.02) 0.11(0.02)0.05(0.01)肺 0.70(0.05) 0.32(0.04)0.10(0.00)0.21(0.03) 0.45(0.05)0.84(0.01)十二指腸50.31(0.01) 0.43(0.01)0.11(0.01)0.13(0.06) 0.22(0.02)0.18(0.04)
1上面的數(shù)字是對IFN-con的測定值，下面的黑體數(shù)字是對lac IFN-con的測定值。括號內(nèi)的數(shù)字是標準差(S.D)(n＝3)。
2計算值來自所收集的血液，并假定動物總體重的7.3％是血液。
3是從肝臟的一葉測定的放射活性，被計算為整個器官的放射活性。
4是從一側(cè)腎測定的放射活性，加倍計算為雙側(cè)的放射活性。
5是對10cm十二指腸測定的放射活性。
同用倉鼠進行的研究一樣，給藥3-5分鐘后，lac IFN-con迅速在肝臟中積累，并且，與lac IFN-con相比較。天然IFN-con在肝臟中的積累量小于其1/3(也見圖3和4)。并且，在脾、十二指腸、腦和心臟中的積累都小于給藥劑量的1％，而發(fā)現(xiàn)血清中l(wèi)ac IFN-con的量是天然IFN-con量的40％。因此，盡管有l(wèi)ac IFN-con體外生物活性較低的事實(見實施例1)，但是，由于lac IFN-con特異性地靶向于肝臟，并可能對某些肝臟疾病提供更有效的治療，所以仍然更優(yōu)越。實施例1中的體外測定是用EMCV作為標志物，而EMCN并不是肝臟病毒。
實施例3本實施例涉及用實施例1中制備的IFN-con和lac IFN-con，對倉鼠進行的藥物動力學分析。通過陰莖靜脈，以300μg/kg的劑量對雄性SyrianGolden倉鼠(85-130g)靜脈內(nèi)給予IFN-con和lac IFN-con。在給藥后的0.05，0.17，0.25，0.5，1，2，4，6和8小時，將各組三只動物活殺，并先通過心臟穿刺采集血樣品(100μl)。用血清分離管(BectonDickinson)制備血清樣品。
用夾心型ELISA測定法對血清進行分析。一級固定化抗體(由兔產(chǎn)生的抗-CIFN多克隆抗體)和第二級抗體(由小鼠產(chǎn)生的抗-IFNIgGl1單克隆抗體)均由Amgen Inc制備。對三個不同批次的兔抗-IFN多克隆抗體進行篩選。檢測抗體是由山羊產(chǎn)生的與辣根過氧化物酶(Boehringer Manmheim)結(jié)合的抗小鼠IgGl，通過以3，3′，5，5′-四甲基乙二胺(TMB)過氧化物酶底物處理產(chǎn)生的顯色反應，可測定血清樣品中CIFN和lac-CIFN的濃度。此檢測法的靈敏度對共有干擾素在0.156-10μg/ml之間的濃度具有線性關(guān)系。
天然的和與乳糖結(jié)合的IFN-con都能夠與抗IFN抗體結(jié)合，但具有不同的親和度。與IFN-con相比較，lac IFN對所有的多克隆抗體具有25％的結(jié)合親和度，對在0.156-2.0ng/ml之間的蛋白質(zhì)濃度存在線性關(guān)系。IFN-con和lacIFN-con顯示了相似的雙相清除機制，并發(fā)現(xiàn)T1/2無明顯的差異(見圖5)。當以相同劑量給藥時，注射3分鐘后倉鼠血清中l(wèi)ac IFN-con的濃度迅速下降至IFN-con濃度的大約50％，然后維持大致相同的下降速率，持續(xù)8小時之后。對于兩種蛋白質(zhì)的初始分布半衰期(α-T1/2)約為11分鐘，而最終清除半衰期(β-T1/2)對于IFN-con和lac IFN-con分別為1.3小時和1.0小時。但是，對于IFN-con和lacIFN-con其曲線下的面積(AUC)和表觀分布容積(Vss)卻差異很大。對于IFN-con和lac IFN-con的AUC分別為1817和691ng.hr/ml，Vss分別為198和434ml/kg。
實施例4此實施例是通過測定2′，5′-低聚腺苷酸合成酶(2-5A合成酶)的血漿濃度，來測定IFN-con和lacIFN-con在倉鼠體內(nèi)的生物活性。2-5A合成酶是對結(jié)合于其受體的干擾素直接反應產(chǎn)生的酶，并認為是其抗病毒活性機制的第一步，見《干擾素，原理及醫(yī)學應用》，第一版(1992，Univ of Texas Medical Branch of Galveston)P225-237。
對每組三只雄性Syrian Golden倉鼠(85-130g)，通過陰莖靜脈，以300μg/kg的劑量，靜脈內(nèi)給予IFN-con和lac IFN-con。賦形劑組給予100μl PBS。動物在給藥后6，12，24，48，72和96小時活殺，并通過心臟穿刺采集血液樣品。用2-5A RIA試劑盒(EIken，KitakuJapan)，按Sawai等，Biomed Res.，959-66(1988)所述的方法，測定血清中2-5A合成酶的活性。
對靜脈內(nèi)給予IFN-con和lac IFN-con后，倉鼠血清中產(chǎn)生的2-5A合成酶進行了比較(見圖6)。對于賦形劑對照組和“0”時間組倉鼠，僅發(fā)現(xiàn)極小量的2-5A合成酶活性，表明注射操作可誘發(fā)倉鼠產(chǎn)生非常低的背景酶水平。當注射IFN-con時。發(fā)現(xiàn)酶活性以雙相的方法升高。在注射后24小時發(fā)現(xiàn)第一個峰，發(fā)現(xiàn)其酶活性比賦形劑組高7倍。在注射后48小時，酶后性降低至基線水平，72小時再次升高，達到比賦形劑組高4倍的水平。到96小時，酶活性下降至基線水平。
對于lac IFN-con，發(fā)現(xiàn)酶活性在48小時時大大增加了，并持續(xù)到96小時。在48小時，2-5A合成酶的活性比賦形劑組高10倍。這些結(jié)果表明，IFN-con和lac IFN-con具有不同的產(chǎn)生酶的方式，表明與IFN-con相比較，lacIFN-con可能激活完全不同的抗病毒活性，并可能與此二種蛋白質(zhì)不同的生物分布表現(xiàn)有關(guān)。
實施例5此實施例對IFN-con和lac IFN-con的體內(nèi)抗病毒活性進行了研究，對已給予這二種蛋白質(zhì)的倉鼠以腦心肌炎病毒(EMCV)攻擊，然后比較存活率。
對每組10只雄性Syrian-Golden倉鼠(85-130g)以10μg/kg的劑量腹膜內(nèi)注射IFN-con和lac IFN-con。6小時后，向每只倉鼠腹膜內(nèi)注射100μl(2E+4 Pfu/ml)EMCV。每天檢測動物2次，以一肢麻痹作為終點的指示。存活達到27天的倉鼠被認為是受到了抗病毒保護。當用EMCV攻擊以干擾素給藥的倉鼠時，在攻擊后連續(xù)觀察27天，IFN-con可保護86％的動物，而lac IFN-con可保護57％的動物(見圖7)。沒有給予干擾素的對照組動物，在EMCV攻擊后的第4天或此前全部死亡。
權(quán)利要求
1.化學修飾的IFN-con，其由與至少一個糖基配體結(jié)合的IFN-con組成，其中所述配體含有末端半乳糖。
2.權(quán)利要求1的化學修飾的IFN-con，其中IFN-con選自IFN-con1、IFN-con2和IFN-con3。
3.權(quán)利要求2的化學修飾的IFN-con，其中IFN-con是IFN-con1。
4.權(quán)利要求1的化學修飾的IFN-con，其中糖基配體選自單糖、二糖、低聚糖、多聚糖、糖肽和糖蛋白。
5.權(quán)利要求4的化學修飾的IFN-con，其中糖基配體是低聚糖。
6.權(quán)利要求5的化學修飾的IFN-con，其中低聚糖具有至少2個糖殘基，并含有末端半乳糖殘基。
7.權(quán)利要求5的化學修飾的IFN-con，其中低聚糖是乳糖。
8.權(quán)利要求1的化學修飾的IFN-con，其中4-7個糖基配體與該IFN-con結(jié)合。
9.權(quán)利要求1的化學修飾的IFN-con，其中糖基配體是通過活性氨基酸殘基如賴氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或天冬酰胺與蛋白質(zhì)主鏈結(jié)合的。
10.權(quán)利要求1的化學修飾的IFN-con，其中糖基配體是通過IFN-con的賴氨酸ε-NH2和N-末端胺直接與IFN-con連接的。
11.一種藥物組合物，其含有基本上均一的新糖基化IFN-con制備物和藥用稀釋劑、輔藥或載體，所述新糖基化IFN-con包含4-7個與IFN-con連接的糖基配體。
12.一種基本上均一的新糖基化IFN-con制備物。
13.一種治療病人的方法，該病人患有可用IFN-con治療的疾病，所述方法包括對該病人施用治療有效量的，權(quán)利要求1的化學修飾的IFN-con。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述疾病是細胞增殖紊亂或病毒性疾病。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述病毒性疾病是肝病。
16.權(quán)利要求15的方法，其中肝病是甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎或δ型肝炎。
17.權(quán)利要求16的方法，其中肝病是丙型肝炎。
18.一種將干擾素優(yōu)選地輸送至病人肝臟的方法，其包括對病人施用化學修飾的干擾素，其中該化學修飾的干擾素由結(jié)合于至少1個糖基配體的干擾素組成，該配體含有末端半乳糖，所述干擾素選自IFN-α、IFN-β和IFN-con。
19權(quán)利要求18的方法，其中干擾素是IFN-α。
20.權(quán)利要求18的方法，其中干擾素是IFN-β。
21.權(quán)利要求18的方法，其中干擾素是IFN-con。
22.權(quán)利要求18的方法，其中對病人施用治療有效量的化學修飾的干擾素，以治療肝病。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述的肝病是丙型肝炎。
全文摘要
本發(fā)明涉及化學修飾的共有干擾素,它具有一個或多個結(jié)合于共有干擾素的糖基配體。本發(fā)明還提供了含有這種類似物的藥物組合物和用該組合物治療疾病的方法。
文檔編號A61K38/21GK1178554SQ96192521
公開日1998年4月8日 申請日期1996年1月11日 優(yōu)先權(quán)日1996年1月11日
發(fā)明者D·科林斯, J·L·C·劉 申請人:安姆根有限公司