專利名稱：：新的幽門卷旋桿菌膜蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的目的具體地是新近獲得的基本純化的幽門卷旋桿菌(Helicobacterpyloyi)蛋白，及含有該蛋白藥物組合物。卷旋桿菌是特征為革蘭氏陰性螺旋型細(xì)菌的細(xì)菌屬。幾個(gè)種定居于哺乳動物胃腸道中。應(yīng)特別提及的是幽門卷旋桿菌，H.heilmanii，H.felis和H.mustelae。雖然幽門卷旋桿菌是最常見的與人類感染相關(guān)的種，在一些稀有情形下表明，亦可能從人中分離H.heilmanii和H.felis。卷旋桿菌在發(fā)達(dá)國家感染多于50％成年人群，在發(fā)展中國家?guī)缀跏?00％，因而使之成為世界范圍內(nèi)一個(gè)主要感染因子。幽門卷旋桿菌至今排他性地發(fā)現(xiàn)于人胃粘膜表面上，特別是胃病灶和十二指腸潰瘍病灶周圍。該細(xì)菌目前被看做胃竇炎的致病因子，似乎是潰瘍發(fā)生所需的輔因子之一。而且，胃癌的發(fā)生可能與幽門卷旋桿菌的出現(xiàn)相關(guān)。因而看來開發(fā)一種用于預(yù)防或治療幽門卷旋桿菌感染的疫苗是令人想望的。這樣的疫苗最可能是亞單位性質(zhì)的。迄今已有多種幽門卷旋桿菌蛋白質(zhì)被表征和分離。具體地，它們是，脲酶，和兩個(gè)分別為30和67kDa的A和B亞基組成(Hu和Mobley感染免疫學(xué)(1990)58992；Dwn等人生物化學(xué)雜志(1990)2659464；Evans等人，微生物發(fā)病機(jī)理(1991)1015；Labigne等人，J.Bact.(1991)1731920)；87kDa的液泡細(xì)胞毒素(VacA)(Cover&amp;Blaser，生物化學(xué)雜志(1992)26710570；)Phadnis等，感染免疫學(xué)(1994)621557，WO93/18150)；與細(xì)胞毒素相關(guān)的128kDa的免疫優(yōu)勢抗原(CagA，亦叫TagA)(WO93/18150；USP5403924)；分別為13和58kDa的熱休克蛋白HspA和HspB(Suerbaum等，分子微生物學(xué)(1994)14959；WO93/18150)，54kDa過氧化氫酶(Hazell等，J.GenMicrobiol(1991)13757)，20kDa原纖維血細(xì)胞凝集素(HpaA)；15kDa的富含組氨酸的蛋白(Hpn)(Gilbert等，感染免疫學(xué)(1995)632682)；30kDa的外膜蛋白(Bolin等，臨床微生物學(xué)雜志(1995)33381)；20kDa的膜相關(guān)脂蛋白(Kostrcynska等，細(xì)菌學(xué)雜志(1994)1765938)，以及分子量在48至67kDa之間的孔蛋白家族HopA、HopB、HopC和HopD(Exner等，感染免疫學(xué)(1995)631567)。這些蛋白質(zhì)的幾種包被提議為潛在的疫苗抗原。具體地，脲酶已被承認(rèn)用于此用途的最優(yōu)選的抗原(WO94/9823；WO95/3824；WO95/22987；Michelti等，胃腸道學(xué)(1994)1071002)。事實(shí)仍然如此對于新抗原的研究必須持續(xù)下去，特別是因?yàn)闃I(yè)已發(fā)現(xiàn)為了獲得最佳疫苗效應(yīng)，可能必須將幾種抗原參入到疫苗之中?？傊?，似乎必須鑒定另外的抗原，以將其參入到高效力疫苗之中。因此，本發(fā)明的具體目的是提供一種基本純化形式的幽門卷旋桿菌，它能夠從幽門卷旋桿菌膜組分中獲得，其經(jīng)10％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳之后，其分子量看來是54，50，32-35或30kDa。另外，需特別指明的是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量是54kDa時(shí)，它不與抗一過氧化氫酶抗血清反應(yīng)。具體地，可采用如實(shí)施例6中所述的經(jīng)層析獲得的過氧化氫酶制備物，按從下實(shí)施例5的免疫方法制備抗幽門卷旋桿菌抗血清?！盎炯兓问健睉?yīng)被理解為意謂著該蛋白質(zhì)被從其天然存在的介質(zhì)中分離，換言之，它可能是缺乏具體的幽門卷旋桿菌的胞質(zhì)和周質(zhì)蛋白質(zhì)。其表觀分子量為大約54kDa的膜蛋白，能夠以以下方法獲得，該方法中i)用1％正辛基β-D吡喃葡糖苷萃取幽門卷旋桿菌細(xì)菌，然后離心ii)回收細(xì)菌沉淀，用溶菌酶處理并經(jīng)超聲處理，然后離心；iii)回收離心沉淀，經(jīng)20mMTris-HCl緩沖液pH7.5洗滌，然后離心；iv)回收由離心沉淀構(gòu)成的膜級分，將其重懸于水性培養(yǎng)基中，重懸于含有5％兩性離子洗滌劑3-14的碳酸鹽緩沖液pH9.5中是優(yōu)選的；v)膜級分在Q-Sepharose柱上用0-0.5MNaCl梯度進(jìn)行陰離子交換層析，該梯度被包含在含有0.1％兩性離子洗滌劑3-14的碳酸鹽緩沖液，pH9.5中是優(yōu)選的；然后用1MNaCl洗滌，該1MNaCl被包含在含有0.1％的兩性離子洗滌劑3-14中的碳酸鹽緩沖液pH9.5中是優(yōu)選的；vi)回收以1MNaCl洗滌開始時(shí)洗脫的級分，在DEAE-Sepharose上用0-0.5MNaCl梯度進(jìn)行陰離子交換層析，該梯度包含于含有0.1％兩性離子洗滌劑3-14的Tris·HCl緩沖液pH7.5中，是優(yōu)選的(優(yōu)選的，1MNaCl中的級分預(yù)先用含有0.1％兩性離子洗滌劑3-14的Tris·HCl緩沖液pH7.5透析；以及vii)回收以0.1-0.25MNaCl洗脫的級分。其表觀分子量大約50kDa的膜蛋白，能夠以以下方法獲得，該方法中i)用1％正辛基β-D吡喃葡糖苷萃取幽門卷旋桿菌細(xì)菌，然后離心；ii)回收細(xì)菌沉淀，用溶菌酶處理并經(jīng)超聲處理，然后離心；iii)回收離心沉淀，經(jīng)20mMTris-HCl緩沖液pH7.5洗滌，然后離心；iv)回收由離心沉淀構(gòu)成的膜級分，將其重懸于水性培養(yǎng)基中，重懸于含有5％兩性離子洗滌劑3-14的碳酸鹽緩沖液pH9.5中是優(yōu)選的；v)膜級分在Q-Sepharose柱上用0-0.5MNaCl梯度進(jìn)行陰離子交換層析，該梯度被包含在含有0.1％兩性離子洗滌劑3-14的碳酸鹽緩沖液，pH9.5中是優(yōu)選的；然后用1MNaCl洗滌，該1MNaCl被包含在含有0.1％的兩性離子洗滌劑3-14中的碳酸鹽緩沖液pH9.5中是優(yōu)選的；vi)回收以1MNaCl洗滌開始時(shí)洗脫的級分，在DEAE-Sepharose上用0-0.5MNaCl梯度進(jìn)行陰離子交換層析，該梯度包含于含有0.1％兩性離子洗滌劑3-14的Tris·HCl緩沖液pH7.5中，是優(yōu)選的(優(yōu)選的，1MNaCl中的級分預(yù)先用含有0.1％兩性離子洗滌劑3-14的Tris·HCl緩沖液pH7.5透析；以及vii)回收以0.3-0.4MNaCl洗脫的級分。其表觀分子量大約30kDa的膜蛋白，能夠以以下方法獲得，該方法中i)用1％正辛基β-D吡喃葡糖苷萃取幽門卷旋桿菌細(xì)菌，然后離心；ii)回收細(xì)菌沉淀，用溶菌酶處理并經(jīng)超聲處理，然后離心；iii)回收離心沉淀，經(jīng)20mMTris-HCl緩沖液pH7.5洗滌，然后離心；iv)回收由離心沉淀構(gòu)成的膜級分，將其重懸于水性培養(yǎng)基中，重懸于含有5％兩性離子洗滌劑3-14的碳酸鹽緩沖液pH9.5中是優(yōu)選的；v)膜級分在Q-Sepharose柱上用0-0.5MNaCl梯度進(jìn)行陰離子交換層析，該梯度被包含在含有0.1％兩性離子洗滌劑3-14的碳酸鹽緩沖液，pH9.5中是優(yōu)選的；然后用1MNaCl洗滌，該1MNaCl被包含在含有0.1％的兩性離子洗滌劑3-14中的碳酸鹽緩沖液pH9.5中是優(yōu)選的；vi)回收以0.28-0.35MNaCl洗脫的級分，在DEAE-Sepharose上用0-0.5MNaCl梯度進(jìn)行陰離子交換層析，該梯度包含于含有0.1％兩性離子洗滌劑3-14的Tris·HCl緩沖液pH7.5中，是優(yōu)選的(優(yōu)選的，1MNaCl中的級分預(yù)先用含有0.1％兩性離子洗滌劑3-14的Tris·HCl緩沖液pH7.5透析；以及vii)回收直接洗脫的級分(無NaCl)。其表觀分子量大約32-35kDa的膜蛋白，能夠以以下方法獲得，該方法中i)用1％正辛基β-D吡喃葡糖苷萃取幽門卷旋桿菌細(xì)菌，然后離心；ii)回收細(xì)菌沉淀，用溶菌酶處理并經(jīng)超聲處理，然后離心；iii)回收離心沉淀，經(jīng)20mMTris-HCl緩沖液pH7.5洗滌，然后離心；iv)回收由離心沉淀構(gòu)成的膜級分，將其重懸于水性培養(yǎng)基中，重懸于含有5％兩性離子洗滌劑3-14的碳酸鹽緩沖液pH9.5中是優(yōu)選的；v)將(iv)中獲得的懸液于大約200,000×g中離心，且回收上清；vi)將(v)中獲得上清的pH值降低到大約pH7，通過對磷酸鹽緩沖液pH7透析是優(yōu)選的；vii)將(vi)中獲得的制劑在SP-Sepharose柱上用0-0.5MNaCl梯度進(jìn)行陽離子交換層析，該梯度包含于磷酸鹽緩沖液pH7中優(yōu)選；以及viii)回收以0.26-0.31MNaCl洗脫的級分。本發(fā)明的54，50，32和30kDa蛋白質(zhì)可能是內(nèi)在的膜蛋白或膜相關(guān)蛋白。54kDa蛋白質(zhì)無論是在Western印跡，還是在斑點(diǎn)印跡中，都不與抗一過氧化氫酶抗體反應(yīng)。30kDa蛋白質(zhì)無論是在Western印跡，還是在斑點(diǎn)印跡中，都不與抗-脲酶A亞單位抗體反應(yīng)。32kDa蛋白質(zhì)被證實(shí)為堿性蛋白質(zhì)；在某些實(shí)驗(yàn)條件下，其分子量看來略微大于35kDa。一種幽門卷旋桿菌菌株(ATCC43579)的50kDa蛋白質(zhì)的N-末端序列如下(單字母密碼)MKEKFNRTKPHVNIGTIGHVDH.這一信息并不排除如下事實(shí)能夠按上述方法純化而得的等價(jià)蛋白可有略微不同的N末端序列，因?yàn)樗鼈兛梢匝苌谄渌?xì)菌菌株。這一差異確實(shí)反應(yīng)了同一種內(nèi)普遍發(fā)生的等位變異的現(xiàn)象。例如，細(xì)菌的種通常由細(xì)微等位特征彼此不同的一組菌株體現(xiàn)。在不同菌株中完成同一生物學(xué)功能的多肽可能具有不同于所有菌株的氨基酸序列。這一等位變異亦存在于DNA中。在氨基酸序列水平上的等位變異可由一個(gè)或多個(gè)不改變生物學(xué)功能的氨基胺替代，缺失，或加成組成?！吧飳W(xué)功能”被理解為意謂著參預(yù)了該蛋白質(zhì)天然存在于此的細(xì)胞的存活的蛋白質(zhì)功能(即使該功能不是絕對必需的)。例如，孔蛋白的功能是允許存在于外部基質(zhì)的化合物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，生物學(xué)功能不同于抗原功能。一種蛋白質(zhì)可以有不止一種生物學(xué)功能。本發(fā)明的目的是一種基本純化的蛋白質(zhì)，它可以按照上述方法之一從卷旋桿菌屬的細(xì)菌中如幽門卷旋桿菌，H.heilmanii，H.felis和H.mustelae中純化。本發(fā)明的另一目的是，能夠按照上述方法純化的卷旋桿菌蛋白的在抗原性意義上的類似物范圍內(nèi)的任一基本純化的蛋白質(zhì)或多肽。至于多肽，特別涉及將天然存在的且其純化形式可由上述方法獲得的蛋白質(zhì)進(jìn)行片段化或通過缺失，加成或替換而突變一個(gè)或多個(gè)氨基酸衍生而來的多肽。這些多肽具體地可借助于蛋白酶例如胃蛋白酶或胰蛋白酶酶促消化而得。就這些多肽而言，不需按上述方法純化。本說明書所用的術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“多肽”不依賴于分子的大小(氨基酸鏈長度)，亦不依賴可能的轉(zhuǎn)錄后修飾。在說明書的剩余部分，術(shù)語“多肽”意指由蛋白質(zhì)片段化或突變衍生的產(chǎn)物。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽能夠被制備用于抗可按上述方法純化的卷旋桿菌蛋白質(zhì)的單特異性抗體識別。具體的抗原性可按照一系列的方法揭示，例如通過Western印跡(Towbin等，PNAS(1979)764350)，斑點(diǎn)印跡和ELISA。在Western印跡中，待測產(chǎn)物如無論是以純化的制備物的形式或以細(xì)菌提取物的形式，按LaemmliU.K.，Nature(1970)227680描述的方法進(jìn)行SDS-Page凝膠電泳(10％聚丙烯酰胺)。轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜之后，將膜與稀釋范圍為1∶50至1∶5000，優(yōu)選1∶100至1∶500的稀釋的單特異性超免疫血清溫孵。在包括于上述范圍之一的稀釋度下，特異的抗原性一經(jīng)展示出對應(yīng)于測試產(chǎn)物的一條帶的反應(yīng)性便得以證實(shí)。在ELISA反應(yīng)中，待測產(chǎn)物優(yōu)選用于包被反應(yīng)孔。純化的制劑是優(yōu)選的，雖然總提取物亦可使用。簡言之，含10μg蛋白質(zhì)/ml的100μl制劑被分布于96孔板的孔中。該板于37℃溫孵2h，然后于4℃過夜。該板用含有0.05％Tween20的PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖液)(PBS/Tween緩沖液)洗滌。孔用含1％牛血清白蛋白的250μlPBS飽和。將其于37℃溫孵1小時(shí)然后用PBS/Tween緩沖液洗滌。單特異性兔抗血清在含有0.5％BSA的PBS/Tween系列稀釋。將100μl稀釋液加入每一孔中。按標(biāo)準(zhǔn)方法將板進(jìn)行可視化。例如，將抗兔免疫球蛋白的過氧化物酶偶聯(lián)羊免疫球蛋白加到孔中。溫孵于37℃持續(xù)90分鐘，然后洗滌板。將反應(yīng)物用合適的底物顯色。用比色法測量反應(yīng)(用分光光度計(jì)測量吸光度)。這種條件下，當(dāng)稀釋度為至少1∶50，優(yōu)選至少1∶500，而OD值為1時(shí)，便為陽性反應(yīng)。光密度測量的合適的波長依賴于底物。在斑點(diǎn)印跡中，純化的制劑是優(yōu)選的，雖然總提取物亦可使用。簡言之，含有100μg蛋白質(zhì)/ml的待測產(chǎn)物制備物在50mMTris-HCl，pH7.5中系列稀釋兩次。從每一稀釋液取100μl通過96孔斑點(diǎn)印跡儀(Biorad)點(diǎn)樣到0.45μm硝酸纖維素膜上。置于真空以除去緩沖液。加入50mMTris-HClpH7.5以洗滌孔，將膜空氣干燥。將膜用封閉緩沖液(50mMTris-HClpH7.5、0.15MNaCl，10g/l脫脂奶粉)飽和，然后用單特異性抗血清溫孵，該抗血清在1∶50至1∶5000，優(yōu)選1∶50至1∶500范圍內(nèi)稀釋。該反應(yīng)按標(biāo)準(zhǔn)方法可視化。例如，將抗兔免疫球蛋白的過氧化物酶偶聯(lián)羊免疫球蛋白加到孔中。溫孵于37℃持續(xù)90分鐘，然后洗滌板。反應(yīng)用合適的底物顯色。通過比色或化學(xué)發(fā)光測定反應(yīng)。此種條件下，當(dāng)硝酸纖維素片的斑點(diǎn)在通過比色法而可視化的水平上直接觀察到顏色，或通過化學(xué)發(fā)光法而于照相膠片上可視化，且這時(shí)稀釋度為至少1∶50，優(yōu)選為至少1∶500時(shí)，反應(yīng)為陽性。根據(jù)具體的實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)可從卷旋桿菌中純化獲得，或在異源系統(tǒng)中由重組途徑而表達(dá)(就根據(jù)本發(fā)明的多肽而言，情形亦如此)。在后一情形下，蛋白質(zhì)可以展現(xiàn)出的轉(zhuǎn)錄后修飾不同于來源于起始菌株的相應(yīng)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后修飾。根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽的治療或預(yù)防效力可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法評價(jià)，例如采用小鼠/H.felis模型和Lee等描述的方法(歐洲胃腸道學(xué)和肝學(xué)雜志(1995)，7303或Lee等傳染病學(xué)雜志(1995)172161)測量粘膜免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和具有治療和預(yù)防效應(yīng)的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)，其前提是已采取如下預(yù)防措施當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)來源于H.felis以外的種時(shí)，Hfelis菌株應(yīng)被屬于由此衍生蛋白質(zhì)的種的卷旋桿菌菌株替代，且適用于最終目的(其他實(shí)驗(yàn)條件是一致的)。例如，由幽門卷旋桿菌蛋白質(zhì)經(jīng)片段化而衍生的多肽誘導(dǎo)保護(hù)性或治療性效應(yīng)的能力通過替代幽門卷旋桿菌菌株而測試。這樣的菌株為Kleanthous等人提議，其摘要在1995年7月7-9日，蘇格蘭愛丁堡舉行的第8屆國際胃十二指腸病理學(xué)研討會上披露。與對照組相比，胃組織中的感染一經(jīng)減弱，但可以觀察到保護(hù)性效應(yīng)。感染通過檢測脲酶活性，細(xì)菌量或白細(xì)胞浸潤而評價(jià)。例如當(dāng)攻擊之后，觀察到胃組織中脲酶活性降低時(shí)，即使不能完全消除脲酶活性，也有理由斷言有不完全的保護(hù)。因此，本發(fā)明亦涉及(i)含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽及稀釋劑及載體的物質(zhì)的組合物；特別是(ii)含有治療或預(yù)防有效量的作為活性成分的本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽的，試圖具體用于卷旋桿菌感染預(yù)防或治療的藥物組合物；(iii)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽的作為治療或預(yù)防劑的應(yīng)用；(iv)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽在試圖用于卷旋桿菌感染預(yù)防或治療的藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用，以及(v)一種用于在動物體內(nèi)誘導(dǎo)針對卷旋桿菌，如，幽門卷旋桿菌，H.heilmanii，H.felis和H.mustelae的免疫應(yīng)答的方法，按照此方法，免疫有效量的本發(fā)明的蛋白質(zhì)和多肽被施用于所述動物以發(fā)生免疫應(yīng)答；特別是(vi)一種用于保護(hù)或治療卷旋桿菌感染的方法，向個(gè)體施用預(yù)防或治療有效量的本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽。本發(fā)明的方法和藥物組合物可治療和防止卷旋桿菌感染，因而，可治療和防止這一感染相關(guān)的胃腸疾病。具體地，它們是慢性和萎縮性急性胃炎；消化性潰瘍，如胃和十二指腸潰瘍；胃癌；慢性消化不良；難治性非潰瘍性消化不良；腸組織變形和一些淋巴瘤(如低級MALT淋巴瘤)。本發(fā)明的組合物可用疫苗領(lǐng)域內(nèi)任一傳統(tǒng)途徑給藥，特別是通過粘膜(如眼、鼻、口腔、胃、腸、直腸、陰道或尿道)表面或胃腸外(如，皮下，經(jīng)皮，肌內(nèi)，靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi))途徑。給藥途徑的選擇取決于很多參數(shù)，如與本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽相關(guān)的佐劑。例如，假如使用粘膜佐劑，鼻內(nèi)或口腔給藥是優(yōu)選的。假如使用脂質(zhì)制劑，將選擇胃腸外途徑，優(yōu)選皮下或肌內(nèi)途徑。本發(fā)明的組合物除包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽之外，還至少包含另一卷旋桿菌抗原例如脲酶脫輔基酶、或脲酶的亞單位，片段，同系物，突變體或衍生物。為用于本發(fā)明的組合物，根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可以配制于脂質(zhì)體中，或與脂質(zhì)體一同配制優(yōu)選中性或陰離子脂質(zhì)體，微球體，ISCOMS或病毒樣顆粒(VLPs)，以提高蛋白質(zhì)或多肽的尋靶機(jī)能，或增進(jìn)其免疫應(yīng)答。本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕松地獲得這些化合物。例如，參見脂質(zhì)體一種可行的探索，RRCNewED.IRLpress(1990)。除脂質(zhì)體之外，還可采用佐劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知很多佐劑。這些佐劑參見下述就胃腸外給藥而言，可特別提及鋁化合物例如氫氧化鋁，磷酸鋁和羥基磷酸鋁。按標(biāo)準(zhǔn)方法，抗原可以吸附到或沉淀到鋁化合物上。其它佐劑例如RIBI(購自Immunochem(Hamilton.MT))亦可用于胃腸外給藥。就粘膜給藥而言，可特別提及細(xì)菌毒素，例如，霍亂毒素(CT)，熱不穩(wěn)定大腸桿菌毒素(LT)難辨梭狀芽孢桿菌毒素和百日咳毒素(PT)以及這些毒素的解毒形式(亞基，類毒素或突變體)例如，含有CT的B亞基(CTB)和小量CT的制劑亦可使用。因?yàn)楸Ａ袅俗魟┗钚?，這些毒素的片段，同系物和衍生物看來是適用的。優(yōu)選地，采用具有減低的毒性的突變體。這些突變體在例如WO95/17211(Arg-7-LysCT突變體)，WO95/34323(Arg-9-Lys，Glu-129-GlyPT突變體)和WO96/6627(Arg-192-GlyLT突變體)。其他佐劑，例如，大腸桿菌，明尼蘇達(dá)沙門氏菌，傷寒沙門氏菌或弗氏志賀氏菌的主要脂多糖(MPLA)可用于粘膜給藥。可用于粘膜和胃腸外給藥的佐劑特別包括polyphosphazine(WO95/2415)，DC-膽(3-β-〔N-(N′，N′-二甲基氨基甲烷)氨甲?；衬懝檀?USP5283185和WO96/14831)和QS-21(WO88/9336)。給藥可以單劑量或一定時(shí)期之后，重復(fù)一次或幾次劑量進(jìn)行。合適的劑量依多種參數(shù)變動，例如受治療的個(gè)體(或人或兒童)，疫苗抗原本身，給藥的途徑與頻率，是否有佐劑出現(xiàn)，假如有的話，佐劑的類型和期望的效應(yīng)(例如，保護(hù)或治療)，這可由本領(lǐng)域技術(shù)人員決定。一般說來，本發(fā)明的抗原可以10μg至500mg，優(yōu)選1mg至200mg的量施用。特別是，已表明胃腸外劑量不應(yīng)超過1mg，優(yōu)選不超過100μg。較高劑量可以遵醫(yī)囑使用于例如口服應(yīng)用。不依賴于制劑，口服施用于人的蛋白質(zhì)的量是例如1至10mg每劑量數(shù)量級，且推薦在4周間隔內(nèi)至少3個(gè)劑量。本發(fā)明的組合物可用傳統(tǒng)方法生產(chǎn)。具體地，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可與可藥用的稀釋劑或載體組合使用，例如，當(dāng)組合物試圖用于口服或胃內(nèi)給藥時(shí)，可采用水或鹽溶液例如磷酸鹽緩沖液(PBS)，任選地補(bǔ)充碳酸氫鹽，例如碳酸氫鈉，例如0.1至0.5M。一般地，基于給藥的方式和途徑及標(biāo)準(zhǔn)的藥物學(xué)實(shí)踐而選擇稀釋劑或載體?？伤幱孟♂寗┖洼d體，以及所有藥物學(xué)制劑中所必需的都在Remington氏藥物科學(xué)中描述，這是該領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的教科書，及USP/NP中亦有描述。在更詳盡的描述方式中，提議例舉由口服途徑施用本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽，為此目的，本發(fā)明的蛋白質(zhì)和多肽可以單獨(dú)或者在其它幽門卷旋桿菌蛋白質(zhì)的出現(xiàn)情況下，包裝到明膠膠囊中，以保護(hù)抗原免受胃液降解，或者和碳酸氫鈉共同施用。這樣的制劑已用于藥物組合物。(Black等，Dev.Biol.Stand.(1983)，539)。該蛋白亦可根據(jù)別處描述的方法(Eldridge等，Curr.Top.Microbiol.Immuno(1989)14659)包裝到PLGA微球(羰基乙酸乳酸共聚物)；該蛋白質(zhì)亦包裝到按照廣泛描述的方法制備的脂質(zhì)體中(脂質(zhì)體一種可行的探索，D.Rickwood和B.D.Hame編，1990，牛津大學(xué)出版社，ISBN0-19-963077-1)。替代地，本發(fā)明的蛋白質(zhì)和多肽可經(jīng)胃腸外途徑給藥。為此目的，本發(fā)明的蛋白質(zhì)和多肽可按照完全傳統(tǒng)的方法吸附到氧化鋁凝膠上。在pH約為6.5的緩沖液中的1mg/ml蛋白質(zhì)溶液，與Al+++量為10mg/ml的氫氧化鋁接觸1小時(shí)。最終的制劑組合物如下蛋白質(zhì)5-μg/ml，Al+++250μg/ml，硫柳汞1/10,000，以上各組分均在PBS中。在口服施用時(shí)，推薦使用3次劑量，每一劑量與前一劑量相距4周。本發(fā)明的多肽可用做診斷試劑，例如，用于在生物學(xué)樣品中，如血樣中，檢測到抗-卷旋桿菌抗體的存在。為此目的，這樣的多肽優(yōu)選地包含5至80氨基酸，優(yōu)選10至50氨基酸。本發(fā)明的多肽試劑被標(biāo)記或者是，按診斷方法使用。診斷方法已在本文中前述部分描述。另一方面，本發(fā)明提供了能夠識別本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽的單特異性抗體。“單特異性抗體”應(yīng)理解為意味著一種能夠主要地與一種單一的卷旋桿菌蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體。這種抗體僅在使用基本純化的蛋白質(zhì)做為免疫原時(shí)才能獲得。本發(fā)明的抗體可能是多克隆的或單克隆的，單克隆抗體可以嵌合的(例如，由鼠的可變區(qū)與人的恒定區(qū)相聯(lián))，或者人源化的(僅有高變區(qū)是來源于動物的，如來源于鼠)和/或一條鏈。多克隆抗體，如同單克隆抗體，可以是免疫球蛋白片段的形式，例如F(ab)′2或Fab片段。本發(fā)明的抗體可以是任意同種型的，例如IgG或IgA；多克隆抗體可以是單一同種型，或者是所有的或某些同種型的混合物。下文中，術(shù)語“單特異性抗體”和“單特異性抗血清”可交互使用。一種抗本發(fā)明的蛋白質(zhì)的抗體可以被制備，然后用標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)試驗(yàn)鑒定，例如Western印跡，斑點(diǎn)印跡或ELISA分析(例如，參見Goligan等人，當(dāng)代免疫學(xué)方法(1994)JohnWiley和SonsInc.紐約，NY)；抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊，D.lane，(1988)Harlow編)。本發(fā)明的抗體可用于診斷，以及用于大規(guī)模親合層析純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽，在被動免疫過程中，這一抗體亦可潛在地用作治療劑。因而，本發(fā)明亦提供了(i)用于檢測生物樣品中卷旋桿菌出現(xiàn)的試劑，包含根據(jù)本發(fā)明的抗體和多肽，和(ii)一種用于檢測生物學(xué)樣品中卷旋桿菌出現(xiàn)的診斷學(xué)方法，按照此種方法，生物學(xué)樣品與本發(fā)明的抗體或多肽接觸，因而形成了免疫復(fù)合物；任選地，去除未結(jié)合物質(zhì)，檢測在樣品和本發(fā)明的抗體或多肽之間形成的免疫復(fù)合物，該復(fù)合物是樣品中，或樣品來源器官中卷旋桿菌出現(xiàn)的指征?？梢匀菀椎乩斫飧鶕?jù)本發(fā)明的抗體使得檢測胃提取液中卷旋桿菌的出現(xiàn)成為可能。就用于診斷測試而言，試劑可以游離的形式或固定化于固體支持物；支持物可以是本領(lǐng)域普遍應(yīng)用的任一支持物，例如試管，玻珠，或反應(yīng)孔。固定化可以直接或間接方式完成。直接方法包括被動吸附(非共價(jià)鍵)或支持物和試劑之間的共價(jià)鍵?！伴g接方式”意謂著能夠與試劑相結(jié)合的抗-試劑化合物首先與固體支持物相連。例如，如果采用一種多肽試劑，一種能夠與其結(jié)合的抗體可用作抗-試劑，其前提是該抗體結(jié)合到多肽的一個(gè)不參予出現(xiàn)于生物學(xué)樣品中的抗體識別的表位上。間接方式也可以通過配基-受體系統(tǒng)完成，例如將一個(gè)分子例如維生素移植到多肽試劑上，然后固定化到固體形式的相應(yīng)受體上。這可以由生物素-鏈霉抗生物素蛋白系統(tǒng)來說明。替代地，間接方法可采用，例如，向試劑加一肽尾，例如，床用化學(xué)方式，且通過被動吸附或通過共價(jià)鍵合肽尾而固定化移植產(chǎn)物。本發(fā)明亦涉及一種用于從生物學(xué)樣品中純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽的方法。按照此方法，采有本發(fā)明的單特異抗體將生物學(xué)樣品進(jìn)行親和層析處理。為此目的，抗體可能是多克隆或單克隆的，優(yōu)選地為IgG型。純化的IgG可按照普遍使用的方法制備(參見，例如Coligan等)。傳統(tǒng)的層析支持物，和移植抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法一樣，在例如抗體實(shí)驗(yàn)室手冊，D.Lane.Harlow編(1988)中被描述。簡言之，生物學(xué)樣品，優(yōu)選緩沖溶液，被加樣到層析材料上，該材料優(yōu)選地以用來稀釋生物學(xué)樣品的緩沖液平衡，致使本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽(抗原)吸附到材料上。這種層析材料，例如與本發(fā)明的抗體相聯(lián)的凝膠或樹脂可以床或柱的形式提供。未結(jié)合的組分被洗去，然后以合適的洗脫緩沖液洗脫抗原，例如甘氨酸緩沖液，或含離液劑的緩沖液，如鹽酸胍，或高鹽濃度(如3MMgCl2)。收集洗脫級分，檢測抗原的出現(xiàn)，例如，通過測量280nm吸光度。這一純化方法可以例如用于從總提取物中純化一種蛋白質(zhì)。然而，假如抗體不是完全單特異性的，建議將待經(jīng)免疫親合層析處理的材料以一定量的待純化蛋白質(zhì)的形式預(yù)先富集。例如這一方法可用于完善32kDa蛋白質(zhì)的純化，該蛋白質(zhì)是按上述的、包括在SP-Sepharose上純化的步驟的方法獲得的。本發(fā)明的抗體的治療或預(yù)防實(shí)用性可按Lee等人在上文中就本發(fā)明的蛋白質(zhì)和多肽提出的保護(hù)性實(shí)驗(yàn)得以證實(shí)。因而，本發(fā)明的目的還有(i)一種包含本發(fā)明的單特異性抗體，和一種稀釋劑或一種載體的物質(zhì)的組合物；特別是，(ii)一種含有治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的單特異性抗體的藥物組合物；(iii)本發(fā)明的單特異性抗體在用于治療或防止卷旋桿菌感染的藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用；以及(iv)一種用于治療或防止卷?xiàng)U菌感染(例如，幽門卷旋桿菌，H.heilmanii，H.feis或H.mustelae)的方法，按照此方法，治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的抗體被施用于需要此種治療的個(gè)體。為此目的，單特異性抗體可以是單克隆的或多克隆的，優(yōu)選IgA同種型(占優(yōu)勢的)。在被動免疫方法范圍內(nèi)，抗體通過粘膜途徑施用于動物，例如通過口服或胃內(nèi)途徑施用于胃粘膜，在碳酸氫鹽存在下施用是優(yōu)選的。本發(fā)明的單特異性抗體可以作為活性成分單獨(dú)施用，亦可作為含有至少一種特異于每一種卷旋桿菌多肽的單特異性抗體的混合物施用。本方法所采用的抗體劑量可由本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員輕松地決定。例如，提議的劑量特征如下，每日施用100至1000mg抗體一周，或每日施用三次含100至1000mg的抗體的劑量施用二至三天。根據(jù)上述含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽的組合物的制備原則，含有本發(fā)明的抗體的藥物組合物可按照上述原則制備。而且，采用同樣的藥物指標(biāo)。參考附圖，以在后文中說明本發(fā)明。圖1是制備幽門卷旋桿菌膜級分I，II，和III的方法概述。圖2表示膜級分I，II和III經(jīng)10％聚丙烯酰胺凝膠電泳和考馬斯藍(lán)染色的分析結(jié)果。上樣的樣品是膜級分I(泳道2)，膜級分II(泳道3)，膜級分III(泳道4)和分子量標(biāo)志物(泳道1)。圖3表示由制備膜純化的蛋白質(zhì)經(jīng)10％聚丙烯酰胺凝膠電泳和考馬斯藍(lán)染色的分析結(jié)果。上樣的樣品是HpP1級分(泳道3)，HpP2級分(泳道4)，HpP4級分(泳道5)，HpP5級分(泳道6)，HpP6級分(泳道7)，分子量標(biāo)志物(泳道1和8)和膜級分I(泳道2)。圖4表示級分7和9(于Q-Sepharose洗脫獲得)過DEAE-Sepharose柱獲得的級分的分析。該級分經(jīng)10％和12.5％聚丙烯酰胺凝膠電泳和考馬斯藍(lán)染色。上樣的樣品是級分7(泳道2A)，級分7.1(泳道3A)，級分7.2(泳道4A)，級分9(泳道2B)，級分9.1(泳道3B)，級分9.2(泳道4B)，級分9.3(泳道5B)和分子量標(biāo)志物(kDa)(泳道1A和1B)。圖5表示，經(jīng)10％聚丙烯酰胺凝膠電泳和考馬斯藍(lán)染色，膜級分III(泳道3)經(jīng)Q-Sepharose柱層析所得D級分和D級分經(jīng)S-Sepharose柱層析所得的級分D′的電泳圖譜。泳道1對應(yīng)于分子量標(biāo)志物，泳道2對應(yīng)于膜級分III。實(shí)施例1膜級分制備1A-培養(yǎng)幽門卷旋桿菌菌株ATCC43579在10升發(fā)酵罐中于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。一種于甘油中的冰凍微生物樣品用于接種含有所謂“兩相”培養(yǎng)基的75-cm2三角瓶(固相是含有6％新鮮綿羊血的哥倫比亞瓊脂，液相是含有20％胎牛血清的胰酶(trypcase)水解大豆)。在微需氧環(huán)境下培養(yǎng)24小時(shí)之后，培養(yǎng)物的液相用于接種幾個(gè)盛有缺乏平皿的兩相培養(yǎng)基的75-cm2三角瓶。培養(yǎng)24小時(shí)之后，液相能夠用于接種盛有含有10g/lβ環(huán)糊精的液體大豆胰酶水解培養(yǎng)基的21生物發(fā)酵罐。培養(yǎng)物達(dá)到OD1.5至1.8時(shí)，接種到盛有液體培養(yǎng)基的10升發(fā)酵罐。培養(yǎng)24小時(shí)之后，于4000×g，4℃離心30分鐘收集細(xì)菌。發(fā)酵罐中10升幽門卷旋桿菌ATCC43579培養(yǎng)物可獲得20至40g(濕重)細(xì)菌。1B-用正辛基β-D-吡喃葡萄糖苷(OG)萃取以上獲得的微生物沉淀用500mlPBS(磷酸鹽緩沖液；NaCl7.650g，磷酸氫二鈉0.724g，磷酸二氫鉀0.210g每升；pH7.2)/升培養(yǎng)物洗滌。在同樣條件下再次離心微生物。獲得的細(xì)菌沉淀(C1)重懸于1％OG溶液(Sigma)中(30ml/升培養(yǎng)物)。將細(xì)菌懸液在磁力攪拌下于室溫溫孵1小時(shí)，然后于4℃，17,600×g離心30分鐘。沉淀(C2〕被儲存，用于下一步處理。獲得的上清液(S2)在4℃透析(MWCO＝10000Da，Spectra/por)過夜，透析在磁力攪拌下，用稀釋到1/2的1升PBS進(jìn)行兩次。透析過程中形成的沉淀于4℃，2600×g離心30分鐘而收集，去除上清。含有膜蛋白的沉淀(Cs2d)貯存于-20℃。1C-破碎微生物OG處理的微生物離心后所得沉淀(C2)重懸于20mMTris-HCl緩沖液pH7.5和100μmPefabloc(緩沖液A)然后經(jīng)Ultraturrax(3821，Janke和Kungel)勻漿。獲得的勻漿經(jīng)溶菌酶(0.1mg/ml終濃度)和EDTA(1mM)處理。勻漿物于4℃超聲處理3次每次2分鐘(探頭φ＝0.5cm，功率＝20％，Sonifier450Branson，然后于4℃于210,000g超離心30分鐘。去除含有胞質(zhì)和周質(zhì)蛋白的上清液(S3)，回收沉淀。用緩沖液A洗滌，然后于4℃于210,000g超離心30分鐘。去除上清(S4)后，沉淀(C4)貯存于-20℃。該沉淀含有內(nèi)在的和周圍的膜蛋白。該方法可以通過兩次洗滌沉淀C4以除去周圍的膜蛋白而繼續(xù)。沉淀C4重懸于50mMNaCO3緩沖液pH9.5，100μMPefabloc(緩沖液B)。懸液于4℃于210,000g超離心30分鐘。去除上清液(S5)，然后在上述條件下對沉淀(C5)洗滌和超離心。去除上清液后，沉淀(C6)，其含有必需的內(nèi)在膜蛋白貯存于-20℃。在下文中級分C4、C6和Cs2d分別被稱為膜級分I、II和III。1D-膜級分分析按Laemmli方法(1970)，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析多種膜級分。蛋白質(zhì)經(jīng)考馬斯藍(lán)染色而可視。如果考慮每一級分的主要蛋白，其SDS-PAGE圖譜(圖2)表明膜級分I與膜級分II十分相似，另一方面，這兩者顯然不同于膜級分III。膜級分I的圖譜展示了7條蛋白主帶，其分子量分別是87、76，67，54、50，47和32-35kDa(泳道2)。用抗ureB抗體和抗-過氧化氫酶抗體進(jìn)行Western印跡，表明67kDa對應(yīng)于脲酶B亞基，54kDa的帶對應(yīng)于過氧化氫酶。而級分II(泳道3)中無這兩種蛋白質(zhì)，因?yàn)橛锰妓猁}緩沖液洗滌去除了與膜微弱結(jié)合的蛋白。就膜級分II的蛋白質(zhì)圖譜而言，其展示了76、67、50和30kDa的4條主帶的存在(泳道4)。實(shí)施例2通過制備性SDS-PAGE純化膜級分I蛋白按照Laemmli的方法(1970)用5％濃縮膠和10％分離膠進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。膜級分重懸于緩沖液A中，用2×樣品緩沖液對半稀釋。混合物于95℃加熱5分鐘。大約19mg蛋白質(zhì)上樣于16×12cm大小，5mm厚的膠。50V預(yù)遷移2小時(shí)，然后于65V遷移過夜。用考馬斯藍(lán)R250(0.05％于超濾水)染色凝膠，使帶清晰可見。用刀片切下HpP1，HpP2，HpP4，HpP5和HpP6主帶，置于盛有10或20ml萃取緩沖液的Ultra-turrax中，萃取緩沖液中含25mMTrisHClpH8.8，8M尿素，10％SDS，100μm苯甲基磺酰氟(DMSF)和100μmPeflabloc(緩沖液C)；然后助借于一個(gè)擠壓機(jī)于7巴壓力下，于室溫用MilliporeAP20預(yù)過濾器(φ濾器＝4.7cm，φ孔＝20mm)過濾；然后用5至10ml緩沖液C洗滌，如上述過濾。合并由這兩個(gè)基礎(chǔ)產(chǎn)物而得的兩份濾液。用3倍體積的50∶50的75％甲醇和75％異丙醇混合物沉淀每一份濾出液，然后用70TFT轉(zhuǎn)頭(J8-55，Beckman)，于240,000×g10℃離心16小時(shí)。將每一沉淀溶于2ml增溶緩沖液，增溶緩沖液含有10mMNaPO4pH7.0，1MNaCl，0.1％十二烷基肌酸鈉，100μmPMSF，100μmPefabloc和6M尿素(緩沖液D)。增溶樣品用100ml含4M尿素和0.1％十二烷基肌酸鈉的緩沖液D，100ml含2M尿素和0.5％十二烷基肌酸鈉的緩沖液D，2次100ml不含尿素和含0.5％十二烷基肌酸鈉連續(xù)透析。透析于室溫下磁力攪拌進(jìn)行1小時(shí)。最終的透析物于冰浴保溫30分鐘，然后于4℃，低速離心10分鐘(BiofageA，HeraeusSepatech)?；厥丈锨逡?，用0.45μmMillipore濾器過濾并于-20℃貯存。將每一級分進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖3)。每一級分的電泳圖譜分析表明，級分HpP1，HpP2和HpP4是純化的，這些級分各有一條帶(分別于87，76和54kDa)，級分HpP5于50kDa處有一條高密度帶，且被一條47kDa的帶輕微地污染；同樣級分HpP6于32kDa處有一條高密度帶，且被一條35kDa的帶輕微污染。實(shí)施例3來自于膜級分I的30，50和54kD膜蛋白的純化3A.在Q-Sepharose上進(jìn)行陰離子交換層析按制造商(Pharmacia)的推薦方案制備Q-Sepharose柱，柱體積是40ml(φ＝2.5cm，h＝8cm)。洗柱然后用含100μMPefabloc和0.1％兩性離子洗滌劑3-14的pH9.5的NaCO3緩沖液平衡。通過于280nmUV檢測柱流出物而監(jiān)測層析的進(jìn)行。將140mg預(yù)先增溶的級分I膜蛋白上樣于已用平衡緩沖液洗滌(50mMNaCO3pH9.5，100μMPefabloc和0.1％兩性離子洗滌劑3-14)直至280nm處的吸光度穩(wěn)定的柱上。蛋白質(zhì)用包含于平衡緩沖液中的0.1至0.5MNaCl梯度洗脫(10×VT)；然后用含有0.5和1MNaCl的平衡緩沖液洗滌(2×VT)。收集的級分進(jìn)行SDS-PAGE分析，且根據(jù)其電泳圖譜合并于不同的合并液(pool)，然后貯存于-20℃，級分如下</tables>蛋白質(zhì)洗脫表明53％的蛋白質(zhì)用0-0.5MNaCl梯度洗脫，14％蛋白質(zhì)未吸附于柱上，33％蛋白質(zhì)在用1MNaCl洗滌過程中被洗脫(表5)。未結(jié)合于柱上的蛋白質(zhì)對應(yīng)于堿性蛋白質(zhì)，其在pH7.5時(shí)帶正電荷，而用1MNaCl洗脫的蛋白質(zhì)對應(yīng)于酸性蛋白質(zhì)，在該pH下是高度帶電荷的。級分7和9的純化如下繼續(xù)進(jìn)行。3B-DEAE-Sepharose陰離子交換層析分離級分7和9的蛋白質(zhì)按制造商推薦方案(Pharmacia)制備DEAE-Sepharose柱，膠體積是10ml(φ＝1.5cm，h＝5cm)(最多10mg蛋白質(zhì)/ml膠)。洗柱然后用含有100μMPefabloc和0.1％兩性離子洗滌劑3-14的50mMTris-HCl緩沖液平衡。如前述于280nmUV檢測柱流出物而監(jiān)測層析進(jìn)行。含有10mg蛋白質(zhì)的，預(yù)先用平衡緩沖液(50mMTris-HClpH7.5，100μMPefabloc和0.1％兩性離子3-14)透析的級分7被上樣于DEAE-Sepharose柱。用平衡緩沖液洗柱，直至280nm處吸光度穩(wěn)定。蛋白質(zhì)用含于平衡緩沖液中的0至0.5MNaCl梯度洗脫(10×VT)，然后用含有1MNaCl的平衡緩沖液(2×VT)。收集的級分用SDS-PAGE分析，然后按照其電泳圖譜合并成不同的合并液，貯存于-20℃。通過SDS-PAGE顯示出級分7.1(直接洗脫)是最令人感興趣的。對于含有31mg蛋白質(zhì)的級分9進(jìn)行同樣的純化。通過SDS-PAGE，顯示出級分9.1，9.2和9.3，其分別用0.1-0.25MNaCl，0.3-0.4MNaCl和1MNaCl洗脫是最令人感興趣的。就級分7而言(圖4A)，結(jié)果表明僅有30kDa蛋白(泳道3；級分7.1)是富集的，經(jīng)DEAE-Sepharose柱后被部分分離，其他蛋白質(zhì)未被分離。就級分9而言(圖4B)，電泳圖譜表明54和15kDa的兩種蛋白質(zhì)被分離(泳道3和5，級分9.1和9.3)，50kDa蛋白質(zhì)被富集(泳道4，級分9.2)。級分9.1的54kDa蛋白質(zhì)不與抗過氧化氫酶抗體反應(yīng)。實(shí)施例4從膜級分I中純化32kDa膜蛋白膜級分I于50mMNaCO3pH9.5中，室溫?cái)嚢?0分鐘增溶。懸浮于+4℃，200,000×g離心30分鐘。上清液用50mMNaPO4pH7.4透析，然后上樣于預(yù)先用同一緩沖液平衡的SP-Sepharose柱。用同一緩沖液洗柱后，該柱用0-0.5MNaCl處理。在0.26-0.31M之間洗脫的級分含有32kDa蛋白質(zhì)。實(shí)施例5制備抗級分HpP5和HpP6的超免疫抗血清分別以制備性SDS-PAGE純化的HpP5和HpP6超免疫兔，獲得了特異于幽門卷旋桿菌主要膜蛋白的多克隆抗血清。在D0，用含有50μg乳化于完全弗氏佐劑的膜蛋白的制劑進(jìn)行首次注射(皮下多個(gè)位點(diǎn)和肌內(nèi))。然后于D21和D42通過注射25μg完全弗氏佐劑中的膜蛋白進(jìn)行加強(qiáng)免疫。于D60處死動物。獲得的血清于56℃，30分鐘去補(bǔ)體，通過用孔徑為0.22μm的濾膜(Millipore)過濾而滅菌?？笻pP5抗血清與實(shí)施例3的級分9.2分離的50kDa蛋白質(zhì)反應(yīng)?？笻pP6抗血清與實(shí)施例4中獲得的在SP-Sepharose柱上用0.26-0.31MNaCl洗脫的級分分離的32kDa蛋白質(zhì)反應(yīng)。明顯地，上述免疫方法可用于以同一方式制備抗實(shí)施例3中純化的任一種蛋白質(zhì)的抗血清。在這些實(shí)施例中獲得的制備物經(jīng)制備型SDS-PAGE凝膠電泳處理是優(yōu)選的。該蛋白帶將如上述處理，以獲得用于免疫的制備物。實(shí)施例6從幽門卷旋桿菌中純化過氧化氫酶如實(shí)施例1A所述進(jìn)行培養(yǎng)。洗滌的細(xì)菌沉淀重懸于50mM磷酸鹽緩沖液pH7.5中，該緩沖液含有100μMPMSF(苯甲磺酰氟，Sigma)(緩沖液A)，懸液的終濃度是0.1g(濕重)每升。懸液用Ultraturrax型混合器勻漿。細(xì)菌細(xì)胞用帶有直徑為1.8cm探頭的Sonifier-型儀(Branson)超聲破碎。超聲間歇地進(jìn)行，1分鐘超聲，1分鐘靜置冰上。10分鐘超聲足以完全破碎懸液中的5g微生物。獲得的溶胞產(chǎn)物于4℃，4,000g離心15分鐘。回收上清液然后于4℃，100,000g離心30分鐘?；厥盏诙坞x心的上清液(S2)用于層析純化?；虬碒azell等人描述的方法或Beers和Sizer的方法生化雜志(1952)195133)測得以此方法制備的S2級分保持了總的“過氧化氫酶”酶促活性的90％。級分S2上樣于預(yù)先用緩沖液A平衡的S-Sepharose柱。該柱用同一緩沖液洗滌。該層析過程中，以于280nmUV檢測來監(jiān)測蛋白質(zhì)，以酶促活性來監(jiān)測過氧化氫酶。除去未結(jié)合蛋白質(zhì)之后(280nm的吸光度返回基線)，然后用含于緩沖液A中的0至1MNaCl梯度洗滌?；厥諏?yīng)于過氧化氫酶活性峰的級分，在一裝備有截?cái)嘀禐?00,000道爾頓的膜的Amicon-type濃縮小室中濃縮。如此獲得的濃縮級分上樣于預(yù)先用PBS緩沖液平衡的SephacrylS-300HR柱。合并含有過氧化氫酶活性的級分，濃縮到1mg/ml，且用PBS緩沖液透析。終溶液用孔徑為0.22μm的膜過濾，貯存于-70℃。如此獲得的蛋白質(zhì)具有如下特征(i)典型的過氧化氫酶活性，而無過氧化物酶特性(ii)典型的血蛋白可見光吸光光譜(visiblespectrum)于406nm有一Soret峰，于520nm和550nm有α和β峰(iii)在SDS-PAGE中于54kDa處，有一單體，具有以下N-末端序列MVNKDVKQTTAFGAPVWDDNNVITAGPRG。實(shí)施例7用免疫親和層析純化50kDa膜蛋白7.A-IgG類的純化如實(shí)施例5制備的抗級分HpP5的超免疫血清上樣于預(yù)先用100mMTris·HClpH8.0平衡的ProteinASepharose4FastFlow柱(Pharmacia)。樹脂用10倍柱體積的100mMTris·HClpH8.0，然后10倍柱體積的10mMTris·HClpH8.0洗滌。IgG類以0.1M甘氨酸緩沖液pH3.0洗脫。IgG類以5ml級分收集，向其中加入0.25ml1MTris·HClpH8.0。于280nm處測量光密度然后合并含有IgG類的級分，如果需要，于-70℃冷凍。7.B柱制備Pharmacia生產(chǎn)的適量的CNBr活化的Sepharose4B凝膠(ref17-0430-01)(已知1g干膠給出3.5ml水化膠，膠的密量是5至10μgIgG/ml膠)懸浮于1mMNaCl緩沖液中。借助于buchner通過加入小量1mMHCl洗滌膠。所用1mMHCl的總體積是200ml每克膠。純化的IgG于20+5℃對50倍體積的500mM磷酸鹽緩沖液pH7.5透析4小時(shí)。然后稀釋于500mM磷酸鈉緩沖液pH7.5，終濃度為3mg/ml。IgG類與膠于5+3℃振搖保溫過夜。將膠裝入層析柱并用2倍柱體積的500mM磷酸緩沖液pH7.5洗滌。然后將膠轉(zhuǎn)移至試管中于100mM乙醇胺pH7.5于室溫下振搖保溫過夜。然后用2倍柱體積PBS洗滌。膠貯存于含1/10,000硫柳汞的PBS中。偶聯(lián)到膠上的IgG的量通過測量起始IgG溶液和直接洗脫物加洗滌物之間的280nm處光密度的差值而確定。7.C抗原的吸附和洗脫制備于50mMTrisHClpH8.0，2mMEDTA的蛋白制劑，如1C中獲得的級分I和II經(jīng)0.45μm膜過濾，然后加樣于預(yù)先用50mMTris-HClpH8.0，2mMEDTA平衡的柱上，流速為大約10ml/h。柱用20倍體積的50mMTris-HClpH8.0，2mMEDTA洗滌。另選地，吸附可發(fā)生于床，保溫于5+3℃持續(xù)保溫過夜，并振搖。膜用2至6倍體積10mM磷酸鈉緩沖液pH6.8洗滌。然后用100mM甘氨酸緩沖液，pH2.5洗脫抗原。洗脫物以3ml級分收集，向其中加入150mlpH8.0的磷酸鹽緩沖液。每一級分的光密度于280nm測量；合并含有抗原的級分并貯于-70℃。10％SDS-PAGE凝膠電泳分析表明，僅在50kDa處有一條帶。實(shí)施例8親合層析純化32kDa膜蛋白采用抗級分HpP6抗血清重復(fù)實(shí)施例7，以繼續(xù)純化實(shí)施例4所述的0.26-0.31MNaCl洗脫的級分。收集洗脫的級分，將含蛋白質(zhì)的級分合并為單一制備物，后者經(jīng)10％SDS-PAGE電泳分析。在32kDa處有一條單一的帶。實(shí)施例9凝集試驗(yàn)9A-培養(yǎng)用于-70℃凍存于甘油中的幽門卷旋桿菌No.ATCC43579(可從ATCC，12301ParklawnDrive，RockvilleMD-USA獲得)接種一盛有兩相培養(yǎng)基的25cm2三角瓶。兩相培養(yǎng)基包括由補(bǔ)充了6％新鮮綿羊血的10ml哥倫比亞瓊脂(BioMerieux)組成的固相，和由含有20％胎牛血清的3ml大豆胰酶水解肉湯(Difco)的液相。三角瓶置于稱為“generbag”(BBL)的密封袋中，在借助于MicroaerSystem(BBL)獲得的微需氧條件下(8-10％CO2，5-7％O2和85-87％N2)于37℃溫孵48小時(shí)。這一48小時(shí)的培養(yǎng)物被再次用于接種含有兩相培養(yǎng)基的三角瓶。該培養(yǎng)物的起始600nm吸光度應(yīng)為0.15至0.2。三角瓶在一致于上述條件下溫孵。48小時(shí)后，細(xì)菌懸液轉(zhuǎn)移到測試管中。測量培養(yǎng)物的600nm吸光度，其應(yīng)在3.0至3.5之間。革蘭氏染色后鏡檢微生物的出現(xiàn)。9.B抗血清在使用前，如實(shí)施例4獲得的抗血清經(jīng)0.45μm膜過濾，以去除小的聚集物。9.C凝集試驗(yàn)在一黑底免疫沉淀板上(Prolaboref.10050)，在第一孔中加入20μl生理鹽水，中央孔中加入20μl免疫前收集的血清，在第三孔中加入抗血清。向三孔中的每孔加入20μl幽門卷旋桿菌細(xì)菌懸液，將液滴借助于帶有密封吸頭的巴氏吸管混合?；旌虾?，至多5分鐘就可在放大鏡下觀察到凝集反應(yīng)的開始。當(dāng)混合物以含有大的聚集體的澄清溶液形式出現(xiàn)時(shí)，凝集反應(yīng)完成。陰性對照，無論是生理鹽水，還是免疫前血清，均保持混濁，表明細(xì)菌懸浮是完整的?？辜壏諬pP5和抗級分HpP6的抗血清具有強(qiáng)烈的凝集反應(yīng)。在測試條件下，幽門卷旋桿菌細(xì)菌快速凝集，而一分鐘后完成。結(jié)果表明50和32kDa蛋白質(zhì)可能暴露于卷旋桿菌表面。實(shí)施例1054，50，30和32kDa膜蛋白的保護(hù)效應(yīng)的證實(shí)用1、5、25、50或100μg抗原經(jīng)胃內(nèi)途徑免疫一組約10只6至8周齡SwissWebster小鼠(TaconicLabs，Germantown，NY)，其中54，50或30kDa抗原以實(shí)施例3所述層析方法純化，或者32kDa抗原按實(shí)施例4所述層析純化，或按實(shí)施例8所述免疫親合方法純化，或50kDa抗原按實(shí)施例7的免疫親合層析純化(優(yōu)選的)然后稀釋于PBS或含有0.24M碳酸氫鈉的PBS?？乖a(bǔ)充了5或10μg霍亂毒素(CT)(Calbiochem，SanDiego)或熱不穩(wěn)定毒素(BernaProducts，CoralGablesFL)。首先用異氟烷麻醉小鼠，然后借助于插管施用體積為0.5ml的劑量。以7-10天為間隔，給每只小鼠施用4個(gè)劑量。在未次施用抗原之后的兩周，用單劑量幽門卷旋桿菌ORV2002菌株(每200μlPBS中有1×107活菌；OD550約為0.5)經(jīng)胃內(nèi)途徑施用而攻擊小鼠，沒有接受抗原的對照組亦同樣攻擊。攻擊后兩周處死小鼠?；蛲ㄟ^測量尿酶活性，或通過組織學(xué)評價(jià)細(xì)菌荷載(如Lee等描述，見上文)，或直接定量培養(yǎng)幽門卷旋桿菌來確定保護(hù)百分比。在此種條件下，與對照組相比，可能觀察到就54，50，30和32kDa的每一種蛋白質(zhì)而言，多數(shù)以25μg免疫的小鼠中，感染性荷載的極大降低，由此可以得出結(jié)論，54，50，30和32kDa的卷旋桿菌抗原是至少部分保護(hù)性的最好的結(jié)果是用32kDa蛋白質(zhì)獲得的(100％保護(hù))。序列表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名PasteurMerieuxSerumsetVaccins(B)街道58avenueLeclerc(C)城市Lyon(D)國家法國(E)郵編69007(G)電話72737931(H)電傳72737850(ii)發(fā)明名稱新幽門卷旋桿菌膜蛋白(iii)序列數(shù)2(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類型帶(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQIDNO1信息(i)序列特征(A)長度22氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)的非(iv)反義非(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQIDNO1MetLysGluLysPheAsnArgThrLysProHisVal1510AsnIleGlyThrIleGlyHisValAspHis1520(2)SEQIDNO2信息(i)序列特征(A)長度29氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)的非(iv)反義非(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQIDNO1MetValAsnLysAspValLysGlnThrThrAlaPhe1510GlyAlaProValTrpAspAspAsnAsnValIleThrAla152025GlyProArgGly權(quán)利要求1.基本純化形式的幽門卷旋桿菌蛋白質(zhì)，它能夠從幽門卷旋桿菌膜級分中獲得，經(jīng)10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，其分子量看來是54，50，32-35或30kDa左右，其前提是當(dāng)分子量是54kDa時(shí)，蛋白質(zhì)不與抗過氧化氫酶抗血清反應(yīng)。2.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其表觀分子量是約54kDa左右，其可以按下述方法完成，在該方法中(i)用1％正辛基β-D吡喃葡糖苷萃取幽門卷旋桿菌細(xì)菌，然后離心；(ii)收集細(xì)菌沉淀且用溶菌酶處理，并經(jīng)超聲處理，然后離心；(iii)回收離心沉淀，經(jīng)20mMTris-HCl緩沖液，pH7.5洗滌，然后離心；(iv)回收由離心沉淀構(gòu)成的膜級分，將其重懸于水性介質(zhì)；(v)用0-0.5MNaCl梯度，將膜級分在Q-Sepharose柱上進(jìn)行陰離子交換層析，然后用1MNaCl洗滌；(vi)回收在用1MNaCl洗滌開始時(shí)洗脫的級分，用0-0.5MNaCl梯度將其在DEAE-Sepharose柱上進(jìn)行陰離子交換層析；以及(vii)回收以0.1-0.25MNaCl洗脫的級分。3.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其表觀分子量是約50kDa左右，其可以按下述方法完成，在該方法中(i)用1％正辛基β-D吡喃葡糖苷萃取幽門卷旋桿菌細(xì)菌，然后離心；(ii)收集細(xì)菌沉淀且用溶菌酶處理，并經(jīng)超聲處理，然后離心；(iii)回收離心沉淀，經(jīng)20mMTris-HCl緩沖液，pH7.5洗滌，然后離心；(iv)回收由離心沉淀構(gòu)成的膜級分，將其重懸于水性介質(zhì)；(v)用0-0.5MNaCl梯度，將膜級分在Q-Sepharose柱上進(jìn)行陰離子交換層析，然后用1MNaCl洗滌；(vi)回收在用1MNaCl洗滌開始時(shí)洗脫的級分，用0-0.5MNaCl梯度將其在DEAE-Sepharose柱上進(jìn)行陰離子交換層析；以及(vii)回收以0.3-0.4MNaCl洗脫的級分。4.權(quán)利要求3的蛋白質(zhì)，它具有如SEQIDNO1所示氨基酸序列的N末端。5.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其表觀分子量是約30kDa左右，其可以按下述方法完成，在該方法中(i)用1％正辛基β-D吡喃葡糖苷萃取幽門卷旋桿菌細(xì)菌，然后離心；(ii)收集細(xì)菌沉淀且用溶菌酶處理，并經(jīng)超聲處理，然后離心；(iii)回收離心沉淀，經(jīng)20mMTris-HCl緩沖液，pH7.5洗滌，然后離心；(iv)回收由離心沉淀構(gòu)成的膜級分，將其重懸于水性介質(zhì)；(v)用0-0.5MNaCl梯度，將膜級分在Q-Sepharose柱上進(jìn)行陰離子交換層析，然后用1MNaCl洗滌；(vi)回收在用0.28-0.35MNaCl洗脫的級分，用0-0.5MNaCl梯度將其在DEAE-Sepharose柱上進(jìn)行陰離子交換層析；以及(vii)回收對應(yīng)于直接洗脫的級分(無NaCl時(shí))。6.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其表觀分子量是約32-35kDa左右，其可以按下述方法完成，在該方法中(i)用1％正辛基β-D吡喃葡糖苷萃取幽門卷旋桿菌細(xì)菌，然后離心；(ii)收集細(xì)菌沉淀且用溶菌酶處理，并經(jīng)超聲處理，然后離心；(iii)回收離心沉淀，經(jīng)20mMTris-HCl緩沖液，pH7.5洗滌，然后離心；(iv)回收由離心沉淀構(gòu)成的膜級分，將其重懸于水性介質(zhì)，優(yōu)選采用碳酸鹽緩沖液pH9.5；(v)在(iv)中獲得的懸液于200,000×g離心，回收上清液；(vi)將(v)中獲得的上清液的pH降低到pH7，優(yōu)選地用磷酸鹽緩沖液pH7透析；(vii)用0-0.5MNaCl梯度將(vi)中獲得的制備物在SP-Sepharose柱上進(jìn)行陽離子交換層析，該NaCl梯度優(yōu)選地包含于磷酸鹽緩沖液pH7中；以及(viii)回收用0.26-0.31MNaCl洗脫的級分。7.基本純化形式的由所述蛋白質(zhì)經(jīng)片段化和/或突變衍生的卷旋桿菌蛋白質(zhì)或多肽，它能夠被制備用于抗權(quán)利要求1至6的蛋白質(zhì)的抗血清識別。8.用于防止或治療幽門卷旋桿菌感染的藥物組合物，它含有作為活性成分的權(quán)利要求1至7之一的蛋白質(zhì)或多肽。9.能夠識別權(quán)利要求1至7之任一的蛋白質(zhì)或多肽的單特異性抗體。10.試圖用于防止或治療幽門卷旋桿菌感染的藥物組合物，它包含作為活性成分的權(quán)利要求9的單特異性抗體。11.使檢測生物學(xué)樣品中卷旋桿菌的出現(xiàn)成為可能的診斷方法，根據(jù)此方法，生物學(xué)樣品與權(quán)利要求9的抗體或權(quán)利要求7的多肽相接觸，致使免疫復(fù)合物形成，未結(jié)合物質(zhì)被任選地除去，并檢測樣品和抗體或多肽間形成的免疫復(fù)合物。12.用于從生物學(xué)樣品中純化權(quán)利要求1至7之一的多肽或蛋白質(zhì)的方法，根據(jù)此方法，采用權(quán)利要求9的單特異性抗體將生物學(xué)樣品進(jìn)行親合層析。全文摘要本發(fā)明的目的是基本純化形式的幽門卷旋桿菌蛋白,能從幽門卷旋桿菌的膜部分得到,經(jīng)10%SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳后,其分子量看來是76,54,50,32—35或30kDa左右。文檔編號A61K39/00GK1173877SQ9619177公開日1998年2月18日申請日期1996年10月4日優(yōu)先權(quán)日1995年10月4日發(fā)明者L·利索羅申請人:巴斯德梅里厄血清及疫苗公司