專利名稱：免疫治療劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在延緩或防止腫瘤生長中有用的免疫治療劑。
已有人提出至少在一些病例中免疫系統(tǒng)能防止或延緩腫瘤生長，并且嘗試進(jìn)行一些研究以支持此觀點(diǎn)。因此柯雷(W.B.1894“利用丹毒毒素及靈桿菌治療不可手術(shù)的惡性腫瘤”)描述了一種顯示對(duì)中胚層來源的限制性范圍腫瘤有效的免疫治療方法，通過誘導(dǎo)類似于郭霍氏免疫治療對(duì)結(jié)核所誘導(dǎo)的壞死機(jī)制。從那時(shí)起，多種對(duì)癌癥免疫治療的嘗試以誘導(dǎo)類似于在柯雷的一些病例中獲得的快速組織壞死為目標(biāo)。
己知至少有兩型成熟輔助T細(xì)胞，稱為TH1和TH2。前者與白介素2(IL2)，γ干擾素(IFN-γ)， 細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTLs)的產(chǎn)生，降低的抗體產(chǎn)生和TH2細(xì)胞產(chǎn)生的下調(diào)有關(guān)。后者產(chǎn)生IL4，IL5，增加抗體產(chǎn)生并降調(diào)節(jié)TH1細(xì)胞。郭霍現(xiàn)象，很可能由柯雷氏毒素誘導(dǎo)，被認(rèn)為是TH1+TH2成熟細(xì)胞混合物的結(jié)果。
已發(fā)現(xiàn)至少2組免疫反應(yīng)可用于控制腫瘤，且兩者均可由卡介苗(BCG)引起。一種機(jī)制是組織破壞，如由郭霍的和柯雷的免疫治療和用TNFα的腫瘤免疫治療所舉例說明，并可能涉及在通過T細(xì)胞依賴性郭霍現(xiàn)象適當(dāng)制備的炎癥位點(diǎn)中的細(xì)胞因子介導(dǎo)的組織損傷。這種機(jī)制顯示對(duì)中胚層起源的腫瘤有效。第2種機(jī)制，基于腫瘤細(xì)胞本身的免疫識(shí)別，可能對(duì)任何起源的腫瘤有效。存在基于非特異性TH1的抗腫瘤機(jī)制的間接證據(jù)來自重組白介素，即一種強(qiáng)大的TH1誘導(dǎo)物，在實(shí)驗(yàn)癌癥中的成功。
據(jù)信，如果以避免誘導(dǎo)郭霍現(xiàn)象的方式應(yīng)用，分枝桿菌能通過熱休克蛋白(HSP)表位和具有高度保守序列的其它蛋白的表位激活應(yīng)激的自體細(xì)胞的識(shí)別，并從而導(dǎo)致選擇性腫瘤細(xì)胞破壞。我們得出結(jié)論，過去BCG免疫治療的多變的有效性是因?yàn)槲凑J(rèn)識(shí)到BCG趨向于促進(jìn)已用抗原激活的反應(yīng)類型，如在對(duì)結(jié)核和麻風(fēng)的保護(hù)中BCG有效性研究中所出現(xiàn)的。
BCG作為針對(duì)分枝桿菌疾病(結(jié)核和麻風(fēng))的疫苗非常多變，在不同研究中保護(hù)作用可為80％至0％。因此出生時(shí)給予BCG似乎通常只保護(hù)BCG被用于預(yù)防結(jié)核的那些地理位置的兒童免于白血病，這是頗具意味的(Grange JM，Stanford JL.BCG vaccination and cancer.Tubercle.(1990)；7161-64)。也就是說，在BCG引起對(duì)分枝桿菌抗原的非組織壞死性及非郭霍現(xiàn)象的反應(yīng)的那些地區(qū)，BCG對(duì)兩種疾病有保護(hù)作用。
很多腫瘤細(xì)胞在它們的表面呈遞細(xì)菌模仿物，碳水化合物，應(yīng)激蛋白和其它與1類和2類主要組織相容性復(fù)合物(MHC)相關(guān)的高度保守蛋白的抗原和表位。在高抗體產(chǎn)量環(huán)境下，原來針對(duì)細(xì)菌糖產(chǎn)生的抗碳水化合物抗體，可能為IgA類型，可覆蓋腫瘤細(xì)胞并阻斷它們的表面成分免受細(xì)胞免疫攻擊。
如我們已在我們的國際申請(qǐng)PCT/GB 93 00643中所示，用牝牛分枝桿菌的免疫治療誘導(dǎo)主要是TH1類型反應(yīng)伴隨巨噬細(xì)胞被IFN-γ激活和少量抗體產(chǎn)生。已知這種TH1反應(yīng)驅(qū)動(dòng)CTLs的產(chǎn)生。顯著的抗體產(chǎn)量下降，與CTLs數(shù)量增加一起將引起腫瘤細(xì)胞變得對(duì)攻擊開放，既可通過結(jié)合于腫瘤細(xì)胞表面上細(xì)菌模仿的糖后激活的巨噬細(xì)胞，也可通過識(shí)別由1類MHC呈遞的應(yīng)激蛋白或其它高度保守蛋白表位的CTLs。一般認(rèn)為通過郭霍現(xiàn)象的組織壞死機(jī)制，可通過使用牝牛分枝桿菌衍生的制劑的應(yīng)用被極大地抑制。
因此可以期待應(yīng)用牝牛分枝桿菌的免疫治療通過防止或延緩腫瘤細(xì)胞的生長或擴(kuò)散，可有效對(duì)抗中胚層，內(nèi)胚層和外胚層來源的腫瘤，包括乳腺和支氣管腫瘤。
本發(fā)明相應(yīng)地提供應(yīng)用來自牝牛分枝桿菌的抗原性和/或免疫調(diào)節(jié)性物質(zhì)用于制造延緩或防止腫瘤生長和擴(kuò)散有用的藥物。這種物質(zhì)可以以至少足夠延緩或防止腫瘤生長或擴(kuò)散的劑量試用于受治療者。
本發(fā)明的治療學(xué)制劑方便地，因而是優(yōu)選，包含牝牛分枝桿菌的死細(xì)胞，最優(yōu)選經(jīng)高壓熱滅菌殺死的細(xì)胞。該免疫治療學(xué)制劑通常包含每毫升稀釋液108以上個(gè)微生物，優(yōu)選每毫升稀釋液108至1011殺死的牝牛分枝桿菌微生物。本發(fā)明的范圍包含供在延緩或防止腫瘤的生長或擴(kuò)散的治療中使用的得自牝牛分枝桿菌的抗原性和/或免疫調(diào)節(jié)性物質(zhì)。
稀釋液可單為注射用的無熱原鹽水，或pH8.0的硼酸鹽緩沖液。該稀釋液應(yīng)被滅菌。一種適當(dāng)?shù)呐鹚猁}緩沖液是Na2B4O7.10H2O3.63gH3BO35.25gNaCl 6.19g
吐溫 0.0005％蒸餾水 至1升優(yōu)選的牝牛分枝桿菌株是從中部烏干達(dá)Lango區(qū)泥樣分離的一種命名為R877R者(J.L.斯坦福和R.C.保爾，Ann.Soc.Belge Med，Trop.1973，53，141-389)。該株是穩(wěn)定的粗糙型變異株并且按生物化學(xué)和抗原標(biāo)準(zhǔn)可鑒定為屬于牝牛分枝桿菌(R.勃尼克，S.E.朱哈茲.，Zentr albl.Bakteriol.Parasitenkd Infectionskr.Hgy，Abt.1.Orig.，1964，192，133)。
命名為R887的此株保存于國立典型培養(yǎng)物保藏中心(NCTC)中心公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室，Colindale街，倫敦NW9 5HT，英國，于1984年2月13日，保藏號(hào)為NCTC 11659。
為制備該免疫治療學(xué)制劑，微生物牝牛分枝桿菌可在適當(dāng)?shù)墓腆w培養(yǎng)基上培養(yǎng)。優(yōu)選改良的Sauton氏液體培養(yǎng)液(S.V.勃登和E.索金.，免疫學(xué)雜志，1955，75，15)用瓊脂固化。優(yōu)選該固體培養(yǎng)基含1.3％瓊脂。
對(duì)接種該微生物的培養(yǎng)基進(jìn)行有氧保溫以使微生物的生長能夠發(fā)生，通常在32C培養(yǎng)10天。收獲微生物，然后稱重并懸溶于稀釋液中。稀釋液可為未緩沖的鹽水但優(yōu)選硼酸鹽緩沖的并含有如上面所述吐溫80的表面活性劑。將該懸溶液稀釋以得到100mg微生物/ml。對(duì)于進(jìn)一步稀釋，優(yōu)選使用硼酸鹽緩沖鹽水以使懸溶液含10mg濕重的微生物/ml稀釋液。該懸溶液隨后可懸溶于5ml多次劑量瓶。雖然劑量瓶中的微生物可使用放射如得自60鈷，劑量為2.5兆拉德，或通過任何其它方法，如化學(xué)法，但優(yōu)選通過高壓熱滅菌殺死微生物，例如在10psi持續(xù)10分鐘(115-125℃)。已發(fā)現(xiàn)壓熱滅菌產(chǎn)生的制劑比放射產(chǎn)生的更有效。
該免疫治療劑通常以0.1～0.2ml，優(yōu)選0.1ml的體積通過皮內(nèi)注射給藥。單個(gè)劑量通常含107至1010個(gè)殺死的牝牛分枝桿菌微生物。優(yōu)選以含108至109個(gè)殺死的牝牛分枝桿菌的單個(gè)劑量給病人用藥。但是，根據(jù)病人的病情該劑量可以重復(fù)。
雖然該免疫治療劑通常通過皮內(nèi)注射給藥，但其它途徑，例如口服，也可被應(yīng)用。
在本方法范圍內(nèi)包含一種延緩或防止腫瘤生長或擴(kuò)散的方法，它包含向腫瘤患者施用來自牝牛分枝桿菌的劑量足以引起有效地延緩或防止腫瘤生長或擴(kuò)散的免疫反應(yīng)的抗原性和/或免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)。
在本發(fā)明范圍內(nèi)并且有利的是，可以使用多于一株牝牛分枝桿菌，和/或在治療學(xué)制劑中包括其它分枝桿菌抗原。結(jié)核菌素也可包括在內(nèi)。
該治療學(xué)制劑也可包含BCG(卡介苗)疫苗，特別是該疫苗的凍干形式，以促進(jìn)其作用。
該治療學(xué)制劑還可包含其它成分如佐劑，防腐劑，穩(wěn)定劑等?？梢詼缇目勺⑸湟后w形式提供或?yàn)樵谑褂们霸僦嘏涞膬龈尚问健?br> 牝牛分枝桿菌可如此應(yīng)用或作為該生物本的提取物或分級(jí)級(jí)分以按照本發(fā)明制備治療學(xué)制劑。
本發(fā)明通過下列實(shí)施例進(jìn)一步說明。實(shí)施例1牝牛分枝桿菌在包含用1.3％瓊脂固化的改良的Sauton’s培養(yǎng)基的固態(tài)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。用該微生物接種此培養(yǎng)基并在32C保溫10天以使微生物的生長能夠發(fā)生。然后收獲微生物并稱重和在稀釋液中懸溶以得到100mg微生物/ml稀釋液。該懸液隨后被進(jìn)一步用緩沖鹽水稀釋以得到含10mg濕重微生物/ml稀釋液的懸液并配制為5ml多劑量瓶。然后將含有活微生物的劑量瓶在10psi壓熱滅菌10分鐘以殺死該微生物并得到本發(fā)明的免疫治療劑，它可(如果需要的話)被進(jìn)一步稀釋以供應(yīng)用。
這種免疫治療劑可以已經(jīng)描述的方式經(jīng)皮內(nèi)注射給藥。實(shí)施例2已給予幾個(gè)腫瘤病人牝牛分枝桿菌注射。獲得的一些結(jié)果報(bào)告如下乳腺癌1)在越南河內(nèi)的衛(wèi)生和流行病學(xué)國立研究院，正在使用牝牛分枝桿菌作為免疫治療進(jìn)行幾項(xiàng)研究，工作人員之一患了乳腺癌并且已有腋窩轉(zhuǎn)移。在手術(shù)去除腫瘤后她被勸告進(jìn)行BCG免疫治療。由于已見到在其它病人中這種治療方案，該病人不愿接受BCG，并要求用牝牛分枝桿菌治療。該病人接受了109殺死的牝牛分枝桿菌的標(biāo)準(zhǔn)注射，至少3年情況很好，沒有腫瘤復(fù)發(fā)的跡象。
2)在為治療持續(xù)性糠疹接受牝牛分枝桿菌注射數(shù)周后，一名年齡50歲的婦女在常規(guī)乳腺X線攝影術(shù)檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)有一個(gè)乳腺包塊?；顧z顯示腫物為惡性的并通過包塊切除而去除。組織病理學(xué)顯示圍繞腋窩淋巴結(jié)有無腫瘤的顯著竇組織細(xì)胞增多病。約9個(gè)月后糠疹復(fù)發(fā)并再次給予一劑牝牛分枝桿菌，糠疹幾乎立即減輕。在去除腫瘤后21個(gè)月沒有繼發(fā)的跡象。
3)一名剛過70歲的婦女在數(shù)年前切除過一個(gè)乳腺腫瘤。她由于關(guān)節(jié)炎而有背痛多年的病史，并接受牝牛分枝桿菌以圖緩解。不久后脊柱X線顯示數(shù)個(gè)考慮為腫瘤繼發(fā)灶的病變，并要求她進(jìn)行放射治療。在延遲8周后她來進(jìn)行放射治療，并且再次放射攝影檢查發(fā)現(xiàn)沒有繼發(fā)灶的跡象；因而未給予放射治療。2年半后她情況很好，沒有腫瘤復(fù)發(fā)。
4)一名55歲的普通醫(yī)生呈現(xiàn)被認(rèn)為是急性乳腺膿腫的2天病史。切除顯示該包塊為一種非?？焖偕L的癌，在腋窩中已出現(xiàn)繼發(fā)灶。立即進(jìn)行了切除，并且在出院后立即給予了牝牛分枝桿菌注射。以3個(gè)月為間隔又進(jìn)行了2次注射。手術(shù)傷口愈合良好，并且一年后在這個(gè)害怕疾病迅速轉(zhuǎn)移的病人中，沒有繼發(fā)灶的證據(jù)。
5)一名主訴髖部疼痛1年的年齡50歲的護(hù)士被診斷為已有來自一個(gè)小的乳腺腫瘤的骨繼發(fā)。在初次注射牝牛分枝桿菌疫苗后她病情好轉(zhuǎn)，對(duì)化療耐受良好并進(jìn)行了第2次牝牛分枝桿菌注射。她情況很好。肺腫瘤1)一名55歲的婦女在1993年10出現(xiàn)氣短，發(fā)現(xiàn)是由于肺中數(shù)個(gè)不可手術(shù)的腫瘤所致。這些腫瘤被認(rèn)為是來自不明原發(fā)腫瘤的繼發(fā)灶。在得到腫瘤學(xué)家的同意后，給予了牝牛分枝桿菌注射并開始了1個(gè)療程的化療和放射治療。病人耐受良好，很少有副作用，并且當(dāng)6個(gè)月后向她提出進(jìn)行第2次牝牛分枝桿菌注射時(shí)不愿接受。在發(fā)病后10個(gè)月她的病情惡化了，改變了化療方案，但病人預(yù)后不好。在1994年10月始給予了牝牛分枝桿菌的第2次注射，隨后病人的病情改善并且她已經(jīng)又接受了2次注射，1次在1994年12月，別一次在1995年3月1日。此病人不但比預(yù)期情況良好，而且她還耐受了20個(gè)療程的化療而無不便。其它惡性腫瘤1)一名因惡性畸胎瘤而處于疾病終末期的30歲的牙醫(yī)在被送回家等死前接受了一次牝牛分枝桿菌注射。在一兩天之內(nèi)他已顯示好轉(zhuǎn)的跡象，3周后顯示可見的腫瘤大小縮小并在數(shù)周以來第一次開始吃飯。
2)一名36歲的婦女在幽門產(chǎn)氣螺旋桿菌感染所致潰瘍周圍的胃部發(fā)生了腺癌。雖然進(jìn)行了化療她還是出現(xiàn)了多個(gè)擴(kuò)散轉(zhuǎn)移灶。她已接受了第1次牝牛分枝桿菌注射并且還準(zhǔn)備以2個(gè)月為間隔繼續(xù)注射。HIV相關(guān)腫瘤1)一名有多發(fā)Kaposi氏肉瘤的AIDS病早期病人在1993年11月接受了1次牝牛分枝桿菌注射。他未發(fā)展新的腫瘤，并且已存在的腫瘤顯示消退的跡象。在他出現(xiàn)HLI相關(guān)的繼發(fā)感染后在1994年12月給予了第2次牝牛分枝桿菌注射。他準(zhǔn)備每隔2個(gè)月接受1次牝牛分枝桿菌重復(fù)注射。
2)一名幾乎無CD4+細(xì)胞，但無明顯AIDS病體征的患者在1994年6月接受了一次牝牛分枝桿菌注射，數(shù)周后發(fā)現(xiàn)在一側(cè)股部有一處約0.5cm直徑的小KS病變。以2個(gè)月為間隔造一步給予病人牝牛分枝桿菌注射，在1995年3月該病人顯示沒有新的病變并且他的首發(fā)病變大小未增加。
3)一名患有多發(fā)性復(fù)發(fā)性口咽癌的48歲病人在1994年6月被給予牝牛分枝桿菌注射，并以2個(gè)月為間隔被給予進(jìn)一步的注射。到1995年3月沒有腫瘤復(fù)發(fā)。
以上提供的逸事為牝牛分枝桿菌治療腫瘤提供支持。未發(fā)現(xiàn)使用牝牛分枝桿菌與任何副作用相關(guān)，事實(shí)上至少在2名病人中它可幫助減輕化療的毒性副作用。這些早期實(shí)踐觀察結(jié)果支持理論預(yù)期并提供了有價(jià)值抗腫瘤活性的最早跡象。實(shí)施例3使用用小鼠乳癌株MM3攻擊的Balb/c小鼠已進(jìn)行了初步實(shí)驗(yàn)。
將3組10只小鼠用107MM3細(xì)胞攻擊。1周后第一組用107牝牛分枝桿菌注射，第2組接受109牝牛分枝桿菌而第3組作為對(duì)照。在攻擊40天后處死動(dòng)物并檢查腫瘤的出現(xiàn)。
第1組第2組 第3組107牝牛分枝桿 109牝牛分枝桿 對(duì)照菌 菌出現(xiàn)腫瘤1 2 5p＝0.056無腫瘤 9 8 權(quán)利要求
1.來源于牝牛分枝桿菌的抗原性和/或免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)的應(yīng)用，用于制造可用于延緩或防止腫瘤生長或擴(kuò)散的藥物。
2.按照權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中來自牝牛分枝桿菌的抗原性和/或免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)包含牝牛分枝桿菌的死細(xì)胞。
3.按照權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中牝牛分枝桿菌細(xì)胞通過高壓滅菌被殺死。
4.按照前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的應(yīng)用，其中來自牝牛分枝桿菌的物質(zhì)得自保藏號(hào)為NCTC11659的菌株，該菌株于1984年2月13日保藏于英國，倫敦NW9 5HT，Colindale街，中心公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室，國立典型培養(yǎng)物保藏中心(NCTC)。
5.按照前述權(quán)利要求的任意一個(gè)的應(yīng)用，其中來自牝牛分枝桿菌的材料被包含在一種藥物中，該藥物含每劑量107-1010個(gè)微生物。
6.按前述權(quán)利要求的任意一個(gè)的應(yīng)用，其中腫瘤為乳腺或支氣管腫瘤。
7.一種延緩或防止腫瘤生長或擴(kuò)散的方法，它包括向受治療者施予劑量至少足以延緩或防止所述腫瘤生長或擴(kuò)散的來自牝牛分枝桿菌的抗原性和/或免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)。
8.按照權(quán)利要求7的方法，其中該腫瘤是乳腺腫瘤。
9.按照權(quán)利要求7或8的方法，其中來自牝牛分枝桿菌的該物質(zhì)按照權(quán)利要求2至5中任意一項(xiàng)所定義。
10.包含來自牝牛分枝桿菌用于延緩或防止腫瘤生長或擴(kuò)散的物質(zhì)的產(chǎn)品。
11.按照權(quán)利要求10的產(chǎn)品，其中來自牝牛分枝桿菌的物質(zhì)按照權(quán)利要求2至5中任意一項(xiàng)所定義。
12.一種包含來自牝牛分枝桿菌的抗原性和/或免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)的用于延緩或防止腫瘤生長或擴(kuò)散治療的免疫治療劑。
13.按照權(quán)利要求12的治療劑，其中所述來自牝牛分枝桿菌的物質(zhì)按照權(quán)利要求2至5中任意一項(xiàng)所定義。
全文摘要
本發(fā)明涉及得自牝牛分枝桿菌供延緩或防止腫瘤的生長或擴(kuò)散的抗原性和/或免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K39/04GK1150388SQ9519335
公開日1997年5月21日 申請(qǐng)日期1995年3月29日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月30日
發(fā)明者G·A·W·羅克, J·L·斯丹福 申請(qǐng)人:倫敦大學(xué)學(xué)院