專利名稱：冷凍紅血細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種冷凍紅血細胞(紅血球)的方法，使它能長時間儲存，并仍然適宜輸血。
為輸血目的而儲存血液是已知的，血液通常在4℃的冷凍條件下儲存，在這一溫度下，血液的最長有效期大約為5周。因此，為保持充分的供應，就需要獻血者連續(xù)不斷的合作。但是有些時候，如圣誕節(jié)前后，供應就會短缺。還有某些場合，嚴重的災難使某一特定的地區(qū)供應短缺。希望儲存自身血液的人數(shù)也在增加，例如在選擇的外科手術之前。于是，就需要一種長時間儲存血液供應品的方法。
將血液冷凍至很低的儲存溫度使血液的長期儲存成為可能。但是提供冷凍血液來輸血被證明是不可能的。通常以大約450ml為標準單位儲存血液，這是一位獻血者一次獻血的體積。病人通常以該單位的整數(shù)倍接受輸血。冷凍這樣一個體積的血液導致紅血細胞的溶血作用，這使血液不能用于以后的輸血。溶血作用導致對心臟有毒的鉀的釋放和基質(細胞碎屑)的釋放，而基質會導致腎臟損傷。一般認為，輸血可接受的血液中，紅細胞的溶血作用必須大體上不高于1%。在通過冷凍而儲存血液的方法中，血液被離心，使血漿和血小板與紅血細胞分離，將紅血細胞與低溫防護劑相混合，通常用液氮再將該混合物冷凍至一個很低的溫度，通常使用的低溫防護劑是甘油。但是甘油是有毒的，制備用于輸血的紅細胞需要洗滌幾次以除去甘油。這一方法涉及昂貴的設備，就負責的人員方面，需要高水平的技能，經驗和不斷的實踐，還需要高度無菌區(qū)。洗滌過程每個單位花費大約20分鐘，并且造成15%-20%的細胞損失。一種更有吸引力的低溫防護劑是羥乙基淀粉(HES)，即laevosan。美國專利US3，758，382描述了含有抗凝血劑(酸化檸檬酸葡萄糖)的55ml全血樣品如何與平均分子量為40，000-70，000的40%W/V的HES相混合，使其最后濃度為12-14%W/V HES。將該混合物浸入-190℃的液氮中，并以200次循環(huán)/分振動直至凍結。在-140℃儲存一周后，將混合物在47℃的水溶液中浸入60秒，并以160次循環(huán)/分搖動進行解凍，可得到恢復系數(shù)高達99%(平均97.4%)的紅血細胞。用于冷凍的體積，即55ml，只是標準體積的幾分之一，如果用于通常的輸血，會造成不希望的復雜性。
在該方法的改進中，考慮到標準單位血液的冷凍，美國專利US4，018，911描述了一種用平均分子量為150，000的HES冷凍血液的方法。將血液離心，使血漿和血小板與紅血細胞分離，將一些血漿與HES混合。加入血漿的原因是，認為這對保護紅血細胞是必需的。血漿和HES的混合物然后與大致相同體積的細胞混合，使最后混合物中HES的比例約為14%數(shù)量級。450ml的獻血標準單位到那時候已被減少至大約405ml。把血漿和HES的混合物加入到冷凍袋中的紅細胞中，在進一步混合之后，把冷凍袋放入與擺式搖動器相連的夾架中，該夾架是由鉸接的并用螺栓固定在一起的兩個鉆孔的金屬側板做成。血袋靠不銹鋼制成的側板所賦予的剛性被夾持在它們之間，使得在冷凍時保持一個大致均勻的橫截面。均勻的橫截面可實現(xiàn)最快速度的冷凍，鋼板使血袋在搖動時基本上保持剛性。血袋和夾架垂直地浸入液氮中，并在其內容物冷凍時使其搖動。在一個405ml單位正被冷凍時，由于這樣一個單位的體積，又由于必須保持一個快速的冷卻速率而使紅血細胞的溶血作用減至最小，搖動過程是必需的。為輸血目的而解凍血液時，在機械攪動下將其浸入大約54℃的水浴中1分鐘左右。這樣處理后的血液可立即用于輸血(只要溶血的程度是可以容許的)，這就是優(yōu)于用甘油冷凍血液單位的主要好處。這是因為細胞外的低溫防護劑HES是無毒的和不致免疫的，類似體糖原，所以不需要將其除去。
美國專利US4，018，911描述了一種用該方法冷凍僅25ml樣品的試驗方法。在該方法中，在解凍后狀態(tài)下，平均99.2%的紅血細胞恢復，在半小時后在等滲壓鹽水中87.3%是穩(wěn)定的。但是，全量的標準單位體積的結果要差得多，細胞恢復率下降為97.2%，鹽水穩(wěn)定率下降為75.7%。
使用HES作為低溫防護劑用于冷凍保存紅細胞、血小板、白細胞、骨髓細胞以及其它器官細胞在英國專利申請GB2046772A中被描述。這些細胞通過例如離心、細胞分離、過濾或吸附被分離。紅細胞冷凍過程的簡要描述涉及通過細胞分離(與離心不同，估計可能會留下一些有細胞的血漿)和以2/3(HES/紅血細胞濃度)的比例加入10%的HES溶液來分離細胞?；謴吐事暦Q在95%-98%。這些現(xiàn)有技術文件表明有可能采用HES作為低溫防護劑以非常小的批量(美國專利US4，018，911中為25ml)、在可接受的溶血水平下儲存和恢復紅細胞。然而，至今尚不能以與輸血技術相協(xié)調的量來儲存和恢復紅細胞。此外，名義上相同的樣品其恢復系數(shù)變化之高不能容許。于是，雖然長期以來已知有關用HES低溫防護冷凍紅血細胞的輸血服務的潛在價值，但是，至今還不能設計出一種方法，給出可容許的溶血程度，而且恢復系數(shù)的變化范圍又很小。
根據(jù)本發(fā)明，一種采用HES作為低溫防護劑的冷凍紅血細胞的方法包括下述步驟將一個單位的血液離心，使血漿和血小板與紅血細胞分離，將紅血細胞與HES混合，冷凍該混合物，其特征在于混合前的紅血細胞的細胞壓積不小于90%，混合物中存在的HES不大于7%W/V HES/紅血細胞。細胞壓積、或haemocrit是一個該技術中已知的函數(shù)，其定義如Sir John V Davie和S M Lewis所著《實用血學》第6版、第32頁，Churchill Livingstone 1984，ISBN 044301981-9。應注意到，采用本發(fā)明的方法，和現(xiàn)有技術對照，在混合物中大體上不存在血漿。并且，盡管喪失了由血漿提供的保護作用，本發(fā)明的方法采用了更加低得多的HES/紅血細胞的W/V百分比。除了達到可容許的溶血程度外，本方法的另一個優(yōu)點是由不存在血漿和HES的降低所致。血漿中含有許多不同的蛋白質，包括與凝血有關的因子，其中之一是因子8，已發(fā)現(xiàn)當HES與血漿混合時，當HES增加時，對某些蛋白質，特別是凝血因子，補體成分，免疫蛋白和fibronectin有愈來愈不溶解的趨勢(S Bell理科碩士論文，Brunel大學圖書館)。這些蛋白質形成聚集物，導致血漿呈牛奶色。遇到未處理的血漿時，不論在體內或是在試管里，這些聚集物起蛋白質進一步聚集的中心的作用，而同時HES能和新鮮血漿中更多的蛋白質發(fā)生作用。結果生成的碎屑由巨噬細胞除去，所以可能暫時地降低病人的免疫球蛋白。由于凝血因子和fibronectin受了影響，流血時間可被延長，且與HES的“劑量”成比例。HES最好是40%W/V的溶液形式，HES的平均分子量范圍為150，000-200，000，一個優(yōu)選的單位是以450ml的標準獻血單位為基礎的，讓大約200ml紅血細胞與35ml 40%HES溶液相混合，給出一個總的用于冷凍的單位為大約235ml。
紅血細胞在同HES混合之前，用抗凝血劑和防腐劑(例如，CPDA，CPD或肝素)來處理更加有益。
冷凍過程最好在液氮中進行，冷凍袋中的混合物夾在一個框架中，該框架由兩個平行的鉆孔板組成，冷凍袋置于其間。兩個板可以在彼此重直方向上略作移動而仍保持相互平行。
優(yōu)選的框架是曲面形式的鋁板，曲面是或者圓柱形、或者最好是球形的一部分。
已發(fā)現(xiàn)冷凍袋中的混合物在冷凍過程中對冷凍袋的局部增厚很敏感。冷凍時，混合物有膨脹的趨勢?，F(xiàn)有技術的冷凍框架或者變形給出局部的膨脹，來適應這種膨脹;或者阻止充分的膨脹，從而造成破碎損壞。通過允許平行板的垂直方向運動可避免冷凍混合物的局部增厚。采用本發(fā)明的方法，用于冷凍的一個標準單位的體積(235ml)，可使混合物以足夠的速度冷凍，而無需象原有方法那樣搖動冷凍袋。這就顯著降低了對設備的要求，以及操作上的復雜性，也避免了溶血的潛在原因。(因搖動造成的細胞的機械損傷)。
離心后的紅血細胞最好直接放入已裝有HES的冷凍袋中。
用上述方法的冷凍血用于輸血時，最好浸入43.5℃左右的熱水中，不要搖動(避免溶血另一個可能的原因)，保持將近10分鐘，直至達到接近人體的溫度。
已發(fā)現(xiàn)采用上述方法冷凍和解凍一個血液單位，可以實現(xiàn)以一個標準獻血單位為基礎，半小時后，鹽水穩(wěn)定細胞的產率為91%SD±0.75%，解凍的平均恢復率為99.1%±0.12%?？稍趶囊旱A存取出后11分鐘內，血液可準備好給病人輸血。
來自獻血者的血液 通過管 送入含有抗凝血劑和防腐劑(CPDA)的儲存袋 ，密封該袋并置于一個離心上 。離心袋 分離出血漿和血小板，壓擠并送入袋。堆積到細胞積壓不小于90%的紅血細胞，送入冷凍袋 ，其中裝有大約35ml的羥乙基淀粉(HES)，最好為40% W/V，平均分子量為150，000-200，000。這在紅血細胞外部浸泡它的流體中，給出大約25.5%的HES，使得HES總的百分比不大于7%W/V(優(yōu)選為6%W/V)。
冷凍袋 是扁、薄、方形。在擠出空氣后袋 移開并密封，例如通過手工顛倒或旋轉幾分鐘將HES和紅血細胞混合。
從輸血到密封袋 的過程必須在無菌條件下進行，這一步驟最好被安排得從管 到冷凍袋 的連接是連續(xù)的并且是不斷開的，并使得任何脫開可由任何連接處的同時分開的密封實現(xiàn)。離心的一般方法以及紅血細胞與溶劑(HES)混合的一般方法在現(xiàn)有技術中是眾所周知的，例如美國專利US4018911，在這里就不作更詳細的描述了。
冷凍框架 有兩個板 。每個都大體上是方的，彎曲成球表面的一部分，這些球是同心的，外層球的半徑比內層球大3mm，球度的數(shù)量級使得例如在大約33cm長的冷凍框架的弦的中心有2cm的位移。(已發(fā)現(xiàn)這個尺寸的冷凍框架適合于冷凍一個標準單位的血液)每個板 的邊緣，都有凸緣 ，使兩個板可彼此相關地固定。
每個板都是由良導熱性的材料制成，最好用鋁制。每個板上都有許多穿孔 ，占據(jù)了大約50%的表面積。冷凍袋 放在板 上，使它能完全被板上的穿孔部分完全包圍 。第二個板 然后被放在第一個板 和袋 之上，用一些夾具 夾持以固定其位置。每個夾具 的夾臂 都具有一定程度的撓性，并且它們固定的位置使它們夾住框架。
不覆蓋及冷凍袋 的邊緣。
框架 和冷凍袋 垂直地浸入一桶液氮中 ，HES和紅血細胞的混合物在大約30秒鐘內迅速冷凍。冷凍時混合物有膨脹的趨勢，夾具 夾臂 的撓性使板 可略微地分開方向移動，以補償這種膨脹。但是，板 的曲率使它們的變形的結果使它們在所有點上彼此保持平行，于是在冷凍袋全部面積范圍內保持了它的厚度恒定。已發(fā)現(xiàn)這一點是很重要的，因為冷凍袋的局部膨脹會導致局部溶血增加。
上述的冷凍血液可在液氮溫度下儲存相當長的時間，當從冷凍器中取出時，在用于輸血之前，最好將它浸入大約43.5℃的熱水中，不要搖動，保持大約10分鐘。在這段時間內，最好使它的溫度上升至人體血液的溫度。
已發(fā)現(xiàn)采用這種方法，溶血程度的量級不會比1%更差，和原有的冷凍和制備方法相比，這是一個相當好的紅血細胞的回收率。
下面的表1給出了采用上述方法冷凍和恢復的10個樣品的詳細情況。所用的冷凍框架是厚度為0.9mm的鉆孔板，邊緣厚度為1.2mm。
表2列出了一些重要參數(shù)，說明氧氣遷移率和紅細胞存活率沒有變化或者受上述方法的影響不大。
表110包235ml HES(LAEVOSAN)／血液的解凍后質量控制結果％鹽水穩(wěn)定率％恢復率1/2小時2小時91.5 88.599.3 第1包00.1 87.599.1 第2包9289 99.0 第3包92.5 90 99.2 第4包90.3 87.899.1 第5包90.4 87.899.1 第6包91.3 88.999.1 第7包91.1 88.899.1 第8包90.6 88.298.9 第9包90.5 88.298.9 第10包平均1/2小時穩(wěn)定率平均恢復率＝99.1%在鹽水中＝91.0%, SD 0.12%SD 0.75%平均血漿穩(wěn)定率比鹽水穩(wěn)定率高4％
因此，可以看出，本方法可保存和恢復標準單位的紅細胞，并具有可重復的為輸血目的所容許的溶血程度。標準單位的體積減小到大約235ml是一個附加的優(yōu)點。因為它使更多的單位(即更多的紅血細胞)能一次輸給病人。
輸血混合物中，基本上沒有會傷害病人的雜質，并且，HES的量減小至現(xiàn)有技術冷凍方法的用量的25%左右。而且，整個過程比現(xiàn)有技術所描述的冷凍方法過程更簡單，因為它不需要機械，例如在冷凍過程中用于振動冷凍框架和冷凍袋的機械。實際上，操作者除了保護性長統(tǒng)手套和一副夾鉗之外，不需要更多的設備就能夠冷凍血液。而且，解凍步驟可由未經訓練的志愿者來完成，除了一桶他為判斷為“燙手”的水，并估計10分鐘時間之外，沒有任何更復雜的事情，仍然能獲得很好的效果。
應當認識到，在本發(fā)明的范圍內，可以采用上述方法和設備的各種改進都可以。例如，板 已描述為球形，這當然是一種理想的情形。單單圓柱形的彎曲，或者某些成角度的形狀，也是可以的。只要它在冷凍過程中，在允許垂直的相對運動時能保持2個板的平行性。另外，除鋁之外的其它材料也可以用來制造板。
還應當認識到，雖然本方法的意圖是要用標準單位的血液，以便與常規(guī)的獻血和輸血實際相適應，但是，也可采用更小的單位。例如可用于Sachets的準備中(即小尺寸的袋，例如，5cm2的尺寸)用于實驗目的的儲存，或者用于稀有血型樣品的儲存。
權利要求
1.一種采用HES作為低溫防護劑冷凍紅血細胞的方法，包括下列步驟將一個單位的血液離心，使血漿的血小板與紅血細胞分離開來，將紅血細胞與HES混合，并冷凍該混合物。其特征在于，混合之前的紅血細胞的細胞壓積不小于90%，混合物中存在的HES不大于7%W/V的HES/紅血細胞。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于HES以6%W/V HES/紅血細胞的比例存在。
3.按照權利要求1或2所述的方法，其特征在于HES是40%W/V/HES的溶液形式。
4.按照權利要求1至3中任何一個所述的方法，其特征在于HES的平均分子量在150，000-200，000的范圍內。
5.按照權利要求1至4中任何一個所述的方法，其特征在于血液單位是以450ml的標準獻血單位為基礎。
6.按照權利要求1至5中任何一個所述的方法，其特征在于，紅血細胞在與HES混合之前，用抗凝血劑進行處理。
7.按照權利要求1至6中任何一個所述的方法，其特征在于冷凍在液氮中進行。
8.按照權利要求1至7中任何一個所述的方法，其特征在于該混合物置于一個冷凍袋中。
9.按照權利要求8所述的方法，其特征在于在冷凍過程中，冷凍袋被夾在一個具有兩個平行的鉆孔板的冷凍框架上。
10.按照權利要求9所述的方法，其特征在于這兩個板適合于在彼此垂直方向上略微地移動而仍保持平行。
11.按照權利要求10所述的方法，其特征在于這些板是彎曲的。
12.按照權利要求11所述的方法，其特征在于這些板是球形彎曲的。
13.按照權利要求11所述的方法，其特征在于這些板是圓柱形彎曲的。
14.按照權利要求9至13中任何一個所述的方法，其特征在于冷凍框架為鋁制的。
15.按照權利要求14所述的方法，其特征在于這些板的鉆孔區(qū)域的厚度為0.9mm。
16.按照權利要求14或15所述的方法，其特征在于這些板的非鉆孔邊緣的厚度為1.2mm。
17.按照權利要求9至16中任何一個所述的方法，其特征在于在冷凍過程中不搖動該冷凍框架。
18.一種大體上如這里描述的使用HES作為低溫防護劑冷凍紅血細胞的方法。
19.本方法使用的、具有特征如權利要求9至16中任何一個所述的一種冷凍框架。
20.一種大體上如這里描述的冷凍框架。
21.一種冷凍紅血細胞的方法，其特征在于包括下述步驟將450ml標準獻血單位的血液離心，去掉血漿和血小板，得到細胞壓積不小于90%，占據(jù)大約200ml的體積的紅血細胞;將紅血細胞置于一個裝有大約35ml 40%W/V HES溶液的冷凍袋中，HES的平均分子量為150，000-200，000;把冷凍袋定位于一個冷凍框架上，該冷凍框架由兩個平行的彎曲板構成，兩者可以在彼此垂直方向作略微的移動而仍保持平行;以及將冷凍框架放入液氮中，直至HES加紅血細胞的混合物被冷凍，在冷凍過程中不搖動冷凍框架。
22.一種準備將權利要求1至18及21中任何一個方法中的紅血細胞，用于輸血時的方法，其特征在于將HES和紅血細胞的混合物浸入43.5℃左右的熱水中，在不需要搖動下，保持大約10分鐘。
全文摘要
一種冷凍一個標準獻血單位的紅血細胞的方法，使之可以長期儲存，隨后以一種對輸血是足夠純的形式被恢復，該方法包括將一個血液單位進行離心，分離出血漿和血小板，并使紅血細胞的細胞壓積不小于90％，把紅血細胞置于裝有HES溶液的冷凍袋(13)中，使得HES/紅血細胞的比例不大于7％W/V(優(yōu)選為6％W/V)，將冷凍袋(13)定位于一個冷凍框架(20，21)上，該框架適合于保持袋內物厚度均勻，并在不搖動下將冷凍框架(20，21)置于液氮中。
文檔編號A61M1/02GK1049103SQ90101409
公開日1991年2月13日 申請日期1990年2月8日 優(yōu)先權日1989年2月8日
發(fā)明者蘇珊·海倫·貝爾, 斯圖爾特·格雷厄姆·納什, 厄恩斯特·悉尼·帕里, 邁克爾·約翰·格林·托馬斯 申請人:英國國防部