專利名稱:一種胎盤提取物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種胎盤提取物的制備方法和制得胎盤提取物在制備治療白癜風(fēng)藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
白癜風(fēng)是一種常見多發(fā)性色素皮膚病，發(fā)病率為1-2％，這種疾病主要是由于表皮中產(chǎn)生黑素的細胞缺失所致。到目前為止它的發(fā)病機理尚不清楚，也沒有一種確定的治療方法。患者處于一種神經(jīng)高度緊張狀態(tài)下，表皮中的黑素逐漸消失，這種癥狀影響病人的心理和社會行為。發(fā)病部位通常在臉上、肢體及身體的暴露部位。
目前對于該病的治療相當困難，尤其是頭頂部和兒童白癜風(fēng)。1986年古巴人Cao用乙醇從正常人胎盤中提取了melagenine，認為其是含有一種能促進黑素合成和黑素細胞增殖的脂蛋白，用其注射治療白癜風(fēng)取得了84％的有效率(CaO CM.Series of NationalReports，1986.)。1995年Rabindra Roy等進一步分析了melagenine大致化學(xué)成份，認為其含內(nèi)皮素、神經(jīng)節(jié)苷脂、磷脂等活性物質(zhì)(RoyR et al.Int J Dermatol，1995；3461)，但提取方法需過濾、過柱層析、冷凍干燥，操作復(fù)雜，特別是這種方法需過柱，不適宜大生產(chǎn)的需要，生產(chǎn)成本也很高。
早在1986年，Meyer A等報告鈣離子對皮膚色素具有一定的活性(13th International Pigment Cell Conference.Oct 5-6.Tveson ArigUSA)。1995年Carberg等指出鈣離子可以刺激人體的黑素細胞產(chǎn)生黑素(J Dermatological Science，1995，9157-164)。同年Schallreuter等應(yīng)用psendocatalase和鈣離子合并紅外線局部照射治療白癜風(fēng)，取得了一定的療效(Dermatology，1995，190223-229)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種操作簡單、成本低廉的治療白癜風(fēng)的胎盤提取物的制備方法。
本發(fā)明所述的治療白癜風(fēng)的胎盤提取物的制備方法，包括以下步驟
(1)取健康胎盤搗碎，用重量比1∶1的20％～95％乙醇浸泡1～7天，過濾，得濾液a；
(2)將濾液a加入1～5倍20％～95％的乙醇，在-4℃～40℃陳化2～10天，過濾，得濾液b；
(3)將步聚(2)所得濾液b陳化3～5天，過濾，得濾液為胎盤提取物。
上述的健康胎盤指乙肝、丙肝、梅毒、HIV等傳染病檢測均呈陰性的新鮮胎盤，其可以直接搗碎或者在-40℃～4℃冰凍保存3～10天后搗碎。
上述的制法步驟(1)中，乙醇濃度優(yōu)選為80％～95％，上述的步驟(2)中，乙醇濃度優(yōu)選為40％～45％。
按照上述胎盤提取物的制備方法，推薦以如下參數(shù)按下列步驟制備
(1)取健康胎盤搗碎，用重量比1∶1的80％乙醇浸泡4天，過濾，得濾液a；
(2)將濾液a加入3倍40％的乙醇，在3～5℃陳化3天，過濾，得濾液b；
(3)將步聚(2)所得濾液b陳化3～4天，過濾，得濾液為胎盤提取物。
將上述制得胎盤提取物進行內(nèi)皮素含量測定。內(nèi)皮素也叫血管緊張肽，是一種由21個氨基酸殘基組成的短肽。內(nèi)皮素的主要作用是維持血管的張力，此外還具有促進細胞分裂的功能，已有報道角質(zhì)形成細胞分泌的內(nèi)皮素具有促進黑素細胞分裂的功能。Roy等人認為胎盤提取物中可能存在內(nèi)皮素(ET)，內(nèi)皮素被認為對MC的有絲分裂有關(guān)鍵性作用。1991年Yada等發(fā)現(xiàn)人體MC上有ET受體。ET-1、ET-2能通過受體介導(dǎo)的信號傳遞途徑刺激MC增殖及黑素合成，而人胎盤中含有豐富的ET。利用本發(fā)明提取的胎盤提取物中含有內(nèi)皮素的量為105.6-265pg/ml，此外還含有神經(jīng)節(jié)苷脂和一些蛋白質(zhì)，可能這些活性成份參與了促進黑素細胞的增殖和黑素合成的過程。
通過測定胎盤提取物中唾液酸的含量確定其中含有唾液酸的神經(jīng)節(jié)苷脂。神經(jīng)節(jié)苷脂是含有一個或幾個唾液酸的糖鞘脂，除大量存在于神經(jīng)元細胞質(zhì)膜上還廣泛分布于其它細胞，其作為細胞膜上的受體和特異性的抗原物質(zhì)參與了細胞間的相互識別、細胞生長和分化等功能。胎盤提取物中含有的神經(jīng)節(jié)苷脂可能會促進白癜風(fēng)病人角質(zhì)形成細胞與黑素細胞間的識別和聯(lián)系，加快黑素的運輸和成熟，從而使皮膚顏色恢復(fù)正常。
按上述方法制得的胎盤提取物在制備治療白癜風(fēng)藥物中的應(yīng)用，所述的胎盤提取物直接用作外用搽劑。外用搽劑還可含有0.05～1％的氯化鈣，鈣離子可以加速色素的沉著過程，從而較快使藥物產(chǎn)生治療效果。
所述的胎盤提取物在制備治療白癜風(fēng)藥物中的應(yīng)用時，還可將所述的藥物制成注射液。所述的注射液的制備方法為胎盤提取物用葡聚糖凝膠G-50層析，洗脫液為PBS，收集峰值的層析液，將所收層析液過濾除菌，分裝后，4℃保存?zhèn)溆?，使用時通常用于皮下注射。
用胎盤提取物的外用搽劑配合紅外線照射治療、表皮移植加胎盤提取物治療或者皮下直接注射治療患者，一定時間后觀察療效。療效判定標準采用中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)會色素病學(xué)組的分型和療效標準。有效率為痊愈、顯效和有效的總和。
本提取工藝操作簡單、成本低廉。所制得的胎盤提取物，用于治療白癜風(fēng)，特別是對治療較困難的頭皮白癜風(fēng)和兒童白癜風(fēng)效果好、安全、無毒副反應(yīng)。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于此。
實施例1胎盤提取物的制備
取健康人新鮮胎盤在-20℃冰凍保存7天后搗碎。用重量比1∶1的80％濃度的乙醇浸泡4天后，用濾紙過濾，所得濾液加入3倍量40％的乙醇，在4℃陳化3天，取上清液過濾后，濾液在室溫陳化2天，取上清液過濾，濾液即胎盤提取物，于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 實施例2胎盤提取物的制備
取健康人新鮮胎盤在-20℃冰凍保存1天后搗碎。用重量比1∶1的50％濃度的乙醇浸泡7天后，用濾紙過濾，所得濾液加入2倍量75％的乙醇，在4℃陳化8天，取上清液過濾后，濾液在室溫陳化5天，取上清液過濾，濾液即胎盤提取物，于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 實施例3胎盤提取物的制備
取健康人新鮮胎盤在-20℃冰凍保存4天后搗碎。用重量比1∶1的95％濃度的乙醇浸泡1天后，用濾紙過濾，所得濾液加入5倍量50％的乙醇，在30℃陳化8天，取上清液過濾后，濾液在室溫陳化3天，取上清液過濾，濾液即胎盤提取物，于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 實施例4注射液的制備
將實施例1制備的胎盤提取物用葡聚糖凝膠G-50層析，洗脫液為PBS，收集峰值的層析液，將所收層析液用PBS調(diào)整濃度為1.0mg/ml(總蛋白含量)，過濾除菌，分裝后滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 實施例5胎盤提取物成份分析
1.材料與方法
1.1材料
實施例1～3所得胎盤提取物；硅膠為青島海洋化工有限工司產(chǎn)；唾液酸測定試劑盒為溫州伊利康生物有限公司產(chǎn)。
1.2方法
1.2.1TLC分析采用硅膠G制薄層板110℃活化0.5小時；點樣5～10μl；展開，展開劑為氯仿(55)甲醇(45)0.2％CaCl2溶液(10)；碘蒸氣顯色。
1.2.2內(nèi)皮素含量測定內(nèi)皮素測定采用放射免疫分析法(RIA)，試劑盒由北京東亞免疫技術(shù)研究所提供。分別將標準品和胎盤提取物、胎盤組織液及內(nèi)皮素抗體放入放免分析緩沖液中，混勻后4℃孵育24小時，次日加入125I標記的內(nèi)皮素，混勻后4℃過夜，再加二抗分離結(jié)合和游離的125I標記的內(nèi)皮素，再測每管沉淀物的每分鐘放射活性計數(shù)值(cpm)。
1.2.3唾液酸含量測定采用溫州伊利康塵物有限公司產(chǎn)試劑盒，采用比色法，將標準品、胎盤提取物與呈色液混合，100℃水浴15分鐘，在冷水中冷卻至室溫，3000r/min離心5分鐘，560nm比色
2.結(jié)果
2.1TLC分析取5ul冷凍濃縮樣品TLC分析，實施例1～3的樣品均出現(xiàn)5個明顯的斑點，其遷移率分別為0.123、0.469、0.605、0.840和0.975。遷移率為0.975的斑點中推測其為脂類混合物，其它四個斑點為一些含有氨基、及二硫鍵的疏水性蛋白。
2.2內(nèi)皮素含量測定用RIA法測出實施例1、實施例2、實施例3的胎盤提取物中內(nèi)皮素含量在105.6-265pg/ml；分別是265pg/ml105.6pg/ml；183pg/ml；顯著高于正常人血液中內(nèi)皮素(含量為3.1-76.1pg/ml)。
測定胎盤提取物中內(nèi)皮素含量顯著大于正常人體血液中的含量，所以這種提取物具有促進黑素細胞分裂的功能。
2.3唾液酸含量測定按試劑盒提供方法，100℃水浴中反應(yīng)15分鐘后，比色法測定實施例1、實施例2、實施例3的胎盤提取物中唾液酸含量在112-163μg/ml之間，含量分別為143μg/ml；163μg/ml；112μg/ml。
實施例6胎盤提取物的動物急性毒性試驗
1、試驗材料
1.1、實施例4制得胎盤提取物注射液
1.2、動物昆明種小鼠，體重17-23g，雌雄各半。由南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證書號蘇動93084。
2、動物試驗
2.1、給藥途徑選用皮下注射和腹腔注射給藥。
2.2、預(yù)試驗及最大耐受量試驗
先作小鼠皮下與腹腔注射的急性毒性預(yù)試驗，結(jié)果胎盤提取物注射液最大給藥量均無動物死亡，預(yù)計不能測出半數(shù)致死量(LD50)因此作最大耐受量試驗，分別以小鼠20只(雌雄各半)，用兩種注射途徑給藥，觀察期7天，室溫20-24℃。
2.3、小鼠皮下注射毒性試驗按90ml/kg(含總蛋白98mg)給予20只小鼠，分3次皮下注射.每次注射容積0.3ml/10g，間隔2.5h，觀察7天，隔日稱體重一次.結(jié)果無動物死亡，對小鼠的行為活動、外觀、食欲、體重、大小便無明顯影響，亦未發(fā)現(xiàn)其他不良反應(yīng)(如驚厥、步態(tài)不穩(wěn)、豎毛、癱瘓、呼吸困難和抑制等)，將小鼠處死，尸體解剖，肉眼觀察末見異常變化。
2.4、小鼠腹腔注射毒性試驗按80ml/kg(含總蛋白87.2mg)給予20只小鼠分四次腹腔注射，每次容積為0.2ml/s，間隔2h。觀察7天，隔日稱體重一次，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有動物死亡，除有少數(shù)小鼠注射當日活動稍有減少(第二天即恢復(fù)正常)，對小鼠行為活動、食欲、體重大小便等均無影響，亦未出現(xiàn)其他不良反應(yīng)(如驚厥、步態(tài)不穩(wěn)、豎毛、呼吸困難和抑制等)，將小鼠處死，解剖后肉眼觀察未見異常變化。
3、試驗結(jié)果分析
3.1、胎盤提取物注射液皮下注射的小鼠最大耐受量為90ml/kg，按體重計相當于人單次臨床用量的900倍(計算方法人單次臨床用量為5ml/50kg體重，即0.1ml/kg，現(xiàn)動物用90ml/kg÷0.1ml/kg＝900倍)。
3.2、黑色素生成素注射液腹腔注射的小鼠最大耐受量為80ml/kg，按體重計相當于人單次臨床用量的800倍，(計算方法依上法算出人單次劑量為0.1ml/kg，現(xiàn)動物用量80ml/kg÷0.1ml/kg＝800倍)。
4.結(jié)論
因不能求出LD50，且兩種紿藥途徑最大耐受量均大于人用量的100倍以上，故本制劑為一安全無毒性制劑。
實施例7胎盤提取物過敏實驗
1、試驗材料
1.1、藥物
(1)實施例4制得的胎盤提取物注射液。
(2)陽性對照品1％蛋清生理鹽水溶液。
(3)空白對照生理鹽水。
1.2、動物健康豚鼠，體重250-300g，雌雄各半，南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。合格證書號蘇動93084。
2、試驗方法
2.1、試驗分組豚鼠30只，分為3組，每組10只，空白對照組生理鹽水，陽性對照組1％蛋清生理鹽水溶液，受試藥物組胎盤提取物注射液。
2.2、給藥方法上述各組分別腹腔注射給藥，劑量1.0mi/Lg，隔日1次，連續(xù)3次，各組給藥第14天，再給藥1次，劑量按致敏攻擊量(即原劑量的2倍)，均為靜脈給藥，觀察給藥后有無過敏反應(yīng)癥狀，分為4級0級為無癥狀，1級用爪搔鼻、打噴嚏等，2級抽搐等，3級呼吸困難、直至死亡。
3、結(jié)果判斷
如表1所示，胎盤提取物注射液組與空白對照組的豚鼠均為0級反應(yīng)，未出現(xiàn)過敏反應(yīng)癥狀及死亡現(xiàn)象，蛋清對照組的10只豚鼠為4級反應(yīng)，均出現(xiàn)打噴嚏、抽搐、呼吸困難等過敏反應(yīng)癥狀直至出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。
結(jié)論胎盤提取物注射液過敏反應(yīng)為陰性。
表1 胎盤提取物注射液對豚鼠過敏試驗的結(jié)果 組別 動物數(shù) 致敏劑量 (ml/kg) 致敏攻擊量 (mgl/kg) 致敏反應(yīng)數(shù)(只) 死亡數(shù)、出現(xiàn)過敏反應(yīng)癥狀數(shù) 空白對照組 10 1.0 2.0 0 0 蛋清對照組 受試藥物組 10 10 1.0 1.0 2.0 2.0 10 0 10 0
實施例8胎盤提取物注射液刺激試驗
1、試驗材料
1.1、實施例4制得的胎盤提取物注射液。
1.2、對照品滅菌生理鹽水。
1.3、動物健康家兔2.0-2.4kg，雌雄不拘。昆明種小鼠，18-22g，雌雄各半。南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證書號蘇動93084。
2、試驗方法
2.1、兔股四頭肌刺激試驗家兔4只，將每只家兔兩側(cè)臀部股四頭肌部位表面皮膚剪毛，并用灑精棉球消毒(注射器和針頭預(yù)先消毒)于右側(cè)部位肌肉注射胎盤提取物注射液1.0ml，右側(cè)部位注射等量生理鹽水作對照，48h后將動物放血處死，縱向切開注射部位肌肉，觀察有無充血、水腫、變性和壞死現(xiàn)象，并各取出小塊組織作病理切片檢查。
2.2、小鼠腹腔刺激試驗取小鼠20只，分為兩組，每組10只雌雄各半。分別腹腔注射胎盤提取物注射液和生理鹽水各0.1ml/kg，注射后記錄10min內(nèi)產(chǎn)生扭體反應(yīng)的次數(shù)，(表現(xiàn)為腹部收縮內(nèi)陷，軀體扭曲，后肢伸張等)，如出現(xiàn)扭體反應(yīng)為陽性，即該藥物有疼痛反應(yīng)。
3、試驗結(jié)果判斷與評價
3.1、注射藥物48h，家兔健康如常，解剖兩側(cè)股四頭肌注射部位，4只家兔均未見充血、水腫、變性及壞死等現(xiàn)象，按表2刺激反應(yīng)分級標準，肌肉組織無異常改變，反應(yīng)級數(shù)為零級，故為無刺激性。病理組織切片檢查結(jié)果未發(fā)現(xiàn)異常病變。
3.2、兩組小鼠腹腔注射受試藥品及生理鹽水后，均末出現(xiàn)扭體反應(yīng)，為陰性，表明黑色素細胞生成注射液無疼痛刺激反應(yīng)。
4.結(jié)論
本試驗表明，受試藥品胎盤提取物注射液為無刺激性制劑。
表2 注射劑刺激反應(yīng)評分標準 反應(yīng)級數(shù) 刺激反應(yīng) 0 1 2 3 4 5 給藥部位無明顯反應(yīng) 給藥部位輕度充血，直徑在0.5cm以下 結(jié)藥部位中度充血，直徑在1.0cm以下 給藥部位重度充血、紅腫、肌肉有變性 出現(xiàn)肌肉褐色變性、壞死，直徑在0.5cm以下 肌肉嚴重變性，出現(xiàn)大片壞死
實施例9胎盤提取物對豚鼠表皮黑素細胞的影響
1、材料和方法
1.1動物皮膚樣品健康雄性棕黃色豚鼠4只(浙江省中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，普通級)，體重300g左右，每只豚鼠在背部棕黃色區(qū)脫毛后外搽胎盤提取物，并立即用紅外線照20min，每天二次，連續(xù)5周；在同一鼠背部搽藥部對側(cè)同色皮膚處，以不搽藥、不照紅外線作為空白對照。
1.2藥物來源胎盤提取物由實施例1制得。
1.3染色方法
1.3.1 HE染色常規(guī)石蠟切片，蘇木-伊紅染色。
1.3.2 lmokawa法染色；0.1M PBS(PH6.8)沖洗皮膚標本(2×2cm2)；置1M溴化鈉中37℃下孵育5h分離表皮、毛囊和真皮；10％冷福爾馬林用固定表皮和毛囊30min、0.1M PBS液(PH6.8)沖洗2遍；0.1％二羥基苯丙氨酸(DOPA)、0.1M PBS(PH6.8)染色5h。黑素細胞為黑褐色。
1.3.3 Schmonl法染色切片水洗；用新鮮配制1％氯化鐵30ml、1％鐵氰化鉀4ml和6ml蒸餾水混合液處理10min；流水沖洗；胞核用1％藏紅花對比染色15-30min；水洗、脫水、透明、常規(guī)封固。黑素染色為黃褐、黑色顆粒。
1.4光鏡觀察
1.4.1多巴陽性細胞計數(shù)Imokowa染色后100倍光鏡下計數(shù)5個視野的表皮基底層所含多巴陽性黑素細胞數(shù)。
1.4.2黑素顆粒細胞計數(shù)Schmorl染色后400倍光鏡下取5個視野，計數(shù)出每100個角質(zhì)形成細胞中含有黑素顆粒的細胞數(shù)。
1.4.3黑素含量指數(shù)(melain content index，MCl)使用多媒體病理圖象分析系統(tǒng)(復(fù)旦郎珈公司)，對schmorl染色切片進行MCI計數(shù)
MCI-1選擇10個叢底層含黑素顆粒細胞，測定受檢細胞黑素顆粒面積占該細胞總面積的百分比平均值；
MCI-2選擇10處表皮，測定受檢基底層以上各層角質(zhì)形成細胞內(nèi)黑素顆粒面積占該處表皮基底層以上各層細胞總面積的百分比平均值。
1.5透射電鏡觀察0.25％戊二醛磷酸鹽緩沖液固定皮膚4h，1％鋨酸固定液固定；環(huán)氧樹脂包埋半薄切片定位；超薄切片；日立H-800型透射電鏡觀察、拍照。
2、結(jié)果
2.1皮膚反應(yīng)豚鼠背部皮膚外用胎盤提取物并配合紅外線照5周后，肉眼未見明顯的色素沉著。
2.2胎盤提取物對棕黃色豚鼠背部皮膚黑素細胞增殖的影響Imokawa法染色后光鏡檢測(×100)發(fā)現(xiàn)用胎盤提取物處理后豚鼠背部皮膚中多巴陽性細胞數(shù)平均每視野204.71個，而對照平均每視野44.86個，用胎盤提取物后比不用多巴陽性細胞數(shù)明顯增高；在毛囊與皮膚交界處，多巴陽性細胞數(shù)明顯增多，陽性細胞胞體較大，樹突較短，雙極細胞數(shù)目明顯增多。
2.3胎盤提取物對棕黃色豚鼠背部皮膚黑素合成的影響黑素生成素處理表皮中含黑素顆粒細胞數(shù)也明顯增高，Schmonl法染色后，用胎盤提取物后為76.33/100細胞，而對照為24.63/100細胞。
2.4棕黃色豚鼠背部皮膚表皮黑素含量指數(shù)測定
胎盤提取物處理后黑素顆粒在叢底層及棘層增多。用胎盤提取物后基底層細胞MCI-1為0.28，對照組基底層細胞MCI-1為0.03；對照組基底層以上各層細胞MCI-2為0.04，用胎盤提取物后基底層以上各層細胞MCI-2為0.20。黑素生成素處理明顯提高了皮膚中黑素含量指數(shù)，所以胎盤提取物對皮膚黑素合成具有促進作用。
2.5透射電鏡觀察
透射電鏡下觀察，胎盤提取物處理的表皮中的黑素細胞細胞膜完整，胞漿內(nèi)含有豐富的與合成黑素有關(guān)的細胞器，可見大量線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在細胞核旁可見I、II期黑素小體，在胞漿周邊可見較多已黑素化的III、IV期黑素小體，在其伸出的樹枝狀突起兩側(cè)可見許多成熟IV期的黑色小體排列在兩旁，輸送到樹突頂端。在黑色細胞附近的角質(zhì)形成細胞內(nèi)可見較多III、IV期黑色小體分布于胞漿，在真皮淺層組織細胞內(nèi)可見有較多被吞噬的III、IV期黑色小體。于之相對比，在對照組中I～III期黑色小體明顯少，無IV期黑色小體可見。
3結(jié)論
豚鼠棕黃色皮膚用胎盤提取物外搽并配合紅外線照，一天兩次，連續(xù)5周后，通過染色觀察發(fā)現(xiàn)多巴陽性細胞數(shù)及含黑素顆粒細胞數(shù)比不用胎盤提取物的明顯增多，在毛囊與皮膚交界處也增多，皮膚黑素含量指數(shù)也較對照增高，提示黑素生成素對皮膚黑素化有促進作用；通過超微結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn)用胎盤提取物后III、IV期黑素小體增多。上述發(fā)現(xiàn)表明胎盤提取物能促進黑素的合成及黑素細胞的增殖。
實施例10胎盤提取物對黑素細胞增殖和黑素合成作用
1.材料與方法
1.1材料
胎盤提取物為實施例1制得；黑素細胞由本科細胞培養(yǎng)室提供；四甲基偶氮唑藍(MTT)購于上海華美生物工程公司；合成黑素為Sigma產(chǎn)品Dynatech-MR4100酶標儀為美國產(chǎn)；96孔培養(yǎng)板及培養(yǎng)皿為丹麥產(chǎn)。
1.2方法
1.2.1、MC增殖的測定四甲基偶氮唑藍比色法(MTT)，選擇對數(shù)生長期的細胞，用0.25％胰酶37℃消化5-8分鐘，將細胞濃度調(diào)為5×104個/ml，加于96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，再加胎盤提取物，使終濃度為0、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32mg/ml，并設(shè)置培養(yǎng)液對照。置37℃、5％CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)56-72個小時，于結(jié)束前4小時加入MTT 10μl/孔。4小時后棄上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)100μl/孔，振蕩10分鐘左右。置酶標儀測A值(OD值)，波長為490nm，按下公式計算促增值率
促增值率＝(加MelagenineA值一不加MelagenineA值)/(不加MelagenineA值一培養(yǎng)液A值)×100％。實驗結(jié)果應(yīng)用t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。
1.2.2、黑素合成測定我們用Oikawa法測胎盤提取物對體外培養(yǎng)MC黑素合成的影響。選擇對數(shù)生長期細胞，將細胞濃度調(diào)為3×105/ml，加入培養(yǎng)皿，每孔1ml，再加培養(yǎng)液1ml/孔，加入胎盤提取物120ul，使其濃度為0.16mg/ml，對照不加，放入37℃、5％CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)4天后，傾去培養(yǎng)液，用0.9％NaCl洗2次，用0.25胰酶消化5-8分鐘，將細胞收集入離心管，進行細胞計數(shù)后，300g離心10分鐘，棄上清液，加蒸餾水超聲處理后離心、沉淀，沉淀用10％三氯乙酸洗2次，乙醇洗1次后1200g離心5分鐘，棄上清液，加入1mlNaOH(含10％DMSO)于80℃水浴2小時，在470nm測A值，同時用合成黑素制備標準曲線。
1.2.3、透射電鏡觀察選擇對數(shù)生長期MC，加入培養(yǎng)皿，再加黑索生成素，使其濃度為0.16mg/ml，對照不加，培養(yǎng)4天后，送電鏡觀察。
2.結(jié)果
2.1.MTT測定結(jié)果胎盤提取物對體外培養(yǎng)的MC增值有促進作用(見表3)。在濃度為0.16mg/ml對細胞增值作用最佳，此濃度組與不加胎盤提取物相比，對MC的增值有顯著性差異(t＝14.76，P＜0.01)。將胎盤提取物濃度和促增殖率進行回歸計算發(fā)現(xiàn)，兩者具有顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.9936。
表3 MTT法測定胎盤提取物對黑素細胞增殖作用結(jié)果 胎盤提取物濃度(mg/ml) 促增殖率(％) 細胞數(shù)104/ml 0 0.02 0.04 0.08 0.16 0.32 20.0 26.5 33.0 42.8 29.1 6.2 7.5 8 8.1 9.0 7.8
2.2黑素合成測定對照組為4.5fg/細胞，而加胎盤提取物為5.5fg/細胞，加胎盤提取物的黑素量比不加時有所增加。
2.3電鏡觀察可見加胎盤提取物后黑素小體增多。
3結(jié)果分析
胎盤提取物被認為是一種能促進黑素合成和黑素細胞增殖的活性物質(zhì)。MTT法檢測結(jié)果顯示0.16mg/ml胎盤提取物對MC促增殖率為42.8％，胎盤提取物對體外培養(yǎng)的MC增值有促進作用。對黑素含量測定，也表明加胎盤提取物比不加胎盤提取物含量相對增加(不加胎盤提取物為4.5fg/細胞，加胎盤提取物為5.5fg/細胞)。電鏡結(jié)果也顯示胎盤提取物促使黑素小體增多，以上這些實驗研究證明胎盤提取物能促進黑素合成和黑素細胞增殖。
實施例11 外用搽劑的制備
實施例1制得胎盤提取物加入氯化鈣，使氯化鈣的濃度為0.05％，制成外用搽劑。
實施例12 外用搽劑的制備
實施例2制得胎盤提取物加入氯化鈣，使氯化鈣的濃度為0.07％，制成外用搽劑。
實施例13 外用搽劑治療白癜風(fēng)
參與實驗的白癜風(fēng)患者共150例均為穩(wěn)定期，其中節(jié)段型73例，局限型57例；男70例，女80例；患者年齡4～60歲，其中＜16歲的有77例，平均年齡18.9歲；病程1～15年，平均4.6年；150例中頭頂部36例，面頸部42例，腰胸部32例，手臂部17例，大小腿、足背23例；白斑面積為2.0cm×2.6cm～16.3cm×7.2cm。
將其隨機分為3組，每組50例，一組采用實施例11的所得外用搽劑，一組采用實施例12的所得外用搽劑，一組采用實施例3所得胎盤提取物直接作為外用搽劑，搽后立即用紅外線燈照(功率為250W)，一天兩次，每次照20min，以3個月為1個療程。同時在治未使療期間用其他治療白癜風(fēng)的藥物。在治療前后檢查血、尿常規(guī)和肝腎功能。
患者在治療過程中均未出現(xiàn)不良反應(yīng)，血尿常規(guī)和肝腎功能均正常。在使用2個療程后，150例中痊愈27例(占18％，患者在治療2～3周后在白斑處出現(xiàn)色素點，后逐漸擴大、融合，快者5周后痊愈，慢者2個療程后痊愈)，顯效45例(占30％)，有效36例(占24％)，無效42例(占28％)，總有效率為72％。隨訪半年以上都未見色素斑脫失，最長隨訪2年，色素仍保持完好，所有患者治療后均無復(fù)發(fā)。
在年齡＜16的77例兒童患者中，痊愈有16例(占20.8％)，顯效27例(占35.1％)，有效20例(占26.0％)，總有效率為81.8％，療效好于年齡＞16歲的患者(總有效率60.3％，痊愈10例，占13.7％；顯效18例，占24.7％；有效16例，占22.0％)。
頭皮部36例有32例有效(痊愈10例，占27.8％；顯效15例，占41.7％；有效7例，占19.4％)，總有效率為88.9％，明顯好于其他部位。
各組的療效見表4，三組治療白癜風(fēng)都有較好的療效，尤其是由
實施例11治療。
表4平均年齡(歲) 平均病程 痊愈 顯效 有效 無效 有效率 實施例11組 實施例12組 實施例3組 19.6 18.7 18.4 5.1 4.5 4.2 11 8 8 16 15 14 13 13 10 10 14 18 80％ 72％ 64％
實施例14 表皮移植加胎盤提取物治療
我們對5例經(jīng)多次表皮片移植失敗的白癜風(fēng)患者(非表皮片1周內(nèi)脫落及感染因素造成)，在移植術(shù)中加胎盤提取物，得到全部成活，并且色素斑加深及擴大明顯。
10例白癜風(fēng)患者均為穩(wěn)定期，其中男4例，女6例；年齡18-45歲。節(jié)段型5例，泛發(fā)型3例，局限型2例；病期1-15年不等。10例其28片移植皮片曾經(jīng)2次以上移植，4周后植皮區(qū)無色素出現(xiàn)。
將實施例4所得胎盤提取物注射液滴加在白斑去表皮的裸露面上，讓其吸收1-2分鐘，然后把浸過胎盤提取物的供皮區(qū)水皰的整個皰壁平整地移植在白斑創(chuàng)面，用消毒紗布或油紗布包扎一周。
結(jié)果術(shù)后一周、一個月、二個月觀察，34片移植片全部成活，隨訪1年，有2例(7片)色素斑直徑達15-20mm，超過原來移植面積的1.5-2倍。
實施例15皮下直接注射
穩(wěn)定期白癜風(fēng)10例，男6例，女4例；年齡16-41歲。節(jié)段型5例，局限型5例；病期4-13年不等。將實施例4所得注射液直接在患者白斑處皮下注射，7天一次，一個半月為一療程。在治療2個療程后3例顯效，3例有效，4例無效。
權(quán)利要求
1、一種胎盤提取物的制備方法，其特征在于包括以下步驟
(1)取健康胎盤搗碎，用重量比1∶1的20％～95％乙醇浸泡1～7天，過濾，得濾液a；
(2)將濾液a加入1～5倍20％～95％的乙醇，在-4℃～40℃陳化2～10天，過濾，得濾液b；
(3)將步聚(2)所得濾液b陳化2～5天，過濾，得濾液為胎盤提取物。
2、如權(quán)利要求
1所述的胎盤提取物的制備方法，其特征在于所述的步驟(1)中，乙醇濃度為80％～95％。
3、如權(quán)利要求
1所述的胎盤提取物的制備方法，其特征在于所述的步驟(2)中，乙醇濃度為40％～45％。
4、如權(quán)利要求
1所述的胎盤提取物的制備方法，其特征在于按如下步驟制備
(1)取健康胎盤搗碎，用重量比1∶1的80％乙醇浸泡4天，過濾，得濾液a；
(2)將濾液a加入3倍40％的乙醇，在3～5℃陳化3天，過濾，得濾液b；
(3)將步驟(2)所得濾液b陳化3～4天，過濾，得濾液為胎盤提取物。
5、如權(quán)利要求
1所述的胎盤提取物的制備方法，其特征在于所述的健康胎盤在-40℃～4℃冰凍保存3～10天后搗碎。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種胎盤提取物的制備方法。所述的制備方法包括取健康胎盤搗碎，用重量比1∶1的20%～95%乙醇浸泡1～7天，過濾，得濾液a；加入1～5倍20%～95%的乙醇，在-4℃～40℃陳化2～10天，過濾，得濾液b；將濾液b陳化2～5天，過濾，得濾液為胎盤提取物。本提取工藝操作簡單、成本低廉。所制得的胎盤提取物，用于治療白癜風(fēng)，特別是對治療較困難的頭皮白癜風(fēng)和兒童白癜風(fēng)效果好、安全、無毒副反應(yīng)。
文檔編號A61K35/48GKCN1259059SQ200410025672
公開日2006年6月14日 申請日期2004年6月23日
發(fā)明者許愛娥, 尉曉冬, 李光華, 武家才 申請人:許愛娥, 尉曉冬, 杭州市第三人民醫(yī)院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan