本發(fā)明涉及腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的融合蛋白-金屬離子復(fù)合物前藥系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、免疫原性細(xì)胞死亡(icd)是一種可產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)的作用機(jī)制。icd促進(jìn)了鈣網(wǎng)素(crt)的表達(dá)，作為一種“吃我”的信號(hào)，并釋放損傷相關(guān)分子模式(damps)和腫瘤相關(guān)抗原，可以作為原位腫瘤疫苗。大多數(shù)用于誘導(dǎo)icd的傳統(tǒng)抗癌藥物都是通過觸發(fā)“副支效應(yīng)”來實(shí)現(xiàn)的，從而導(dǎo)致有限的抗腫瘤免疫反應(yīng)。為了有效地誘導(dǎo)icd，生成持續(xù)的活性氧(ros)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(er)應(yīng)激至關(guān)重要。鑒于線粒體是真核細(xì)胞中產(chǎn)生ros的主要細(xì)胞器，直接操縱線粒體來增強(qiáng)ros的產(chǎn)生可能是一種更直接和更有效的方法。生物活性肽，如天然毒性肽，硼烷模擬肽和陽離子兩親性肽，可誘導(dǎo)線粒體膜破裂，導(dǎo)致ros的積累，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，從這些線粒體破壞肽中篩選icd誘導(dǎo)物可能是一種很有前途的生物制藥策略，用于生成原位腫瘤疫苗。

2、同時(shí)，icd的立體定向誘導(dǎo)后腫瘤特異性免疫反應(yīng)的時(shí)空同步激活也存在挑戰(zhàn)。金屬離子，如鋁、鎂、鋅、錳，其在調(diào)節(jié)先天免疫中的關(guān)鍵作用越來越被認(rèn)識(shí)。因此，金屬離子可能被認(rèn)為是腫瘤特異性免疫反應(yīng)的潛在增強(qiáng)劑。然而，高水溶性的金屬離子很難正確地加載到傳統(tǒng)的輸送系統(tǒng)中，導(dǎo)致加載效率低，并在循環(huán)中過早泄漏。此外，在生理?xiàng)l件下po3-豐富存在，金屬離子泄漏時(shí)可能導(dǎo)致磷酸鹽納米顆粒的形成，導(dǎo)致意外的不良反應(yīng)。因此，需要適當(dāng)?shù)妮d體來提高金屬基藥物的靶向特異性和生物利用度。

3、鐵蛋白(ferritin，fn)是一種廣泛存在的儲(chǔ)鐵蛋白，由24個(gè)亞基組成，聚集形成外徑12nm、內(nèi)腔8nm的籠狀結(jié)構(gòu)，該鐵蛋白的籠狀結(jié)構(gòu)內(nèi)可封裝金屬離子，如錳、鎂、銅、鋅、鐵、鋁、鉀、鈉等。更重要的是，cd71作為fn的受體，它在大多數(shù)人類腫瘤中都有過表達(dá)，允許fn優(yōu)先被腫瘤細(xì)胞內(nèi)化。由于其可逆的籠狀結(jié)構(gòu)和天然金屬封裝特性，以及其熱穩(wěn)定性、生物相容性和非免疫原性，fn已成為金屬基治療的理想腫瘤靶向傳遞平臺(tái)，但fn依然存在如下問題。首先，cd71在肝臟中顯著表達(dá)，導(dǎo)致fn優(yōu)先被肝臟攔截，而不是靶向腫瘤。其次，fn-藥物復(fù)合物的穩(wěn)定性并不理想，在第一周內(nèi)觀察到超過30％的藥物泄漏。此外，fn的血漿半衰期相對(duì)較短(約2小時(shí))。

4、因此，本領(lǐng)域期望有既可以克服fn的缺陷，又同時(shí)實(shí)現(xiàn)icd的立體定向誘導(dǎo)后腫瘤特異性免疫反應(yīng)的時(shí)空同步激活的制劑或復(fù)合物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的

2、本發(fā)明目的提供一種腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的融合蛋白-金屬離子復(fù)合物前藥系統(tǒng)，克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。

3、技術(shù)方案

4、一種腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的融合蛋白-金屬離子復(fù)合物前藥系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)包括腫瘤靶向icd誘導(dǎo)藥物載體和免疫激活金屬離子內(nèi)容物。

5、所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述腫瘤靶向icd誘導(dǎo)藥物載體為人重鏈鐵蛋白衍生物聚合形成具有空腔的納米顆粒，所述金屬離子裝載在所述空腔內(nèi)。

6、所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述人重鏈鐵蛋白衍生物自發(fā)構(gòu)成的籠狀24聚體封裝金屬離子。

7、所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述人重鏈鐵蛋白衍生物包含pstag屏蔽序列、腫瘤微環(huán)境酶響應(yīng)序列、icd誘導(dǎo)肽、胞內(nèi)釋放序列以及內(nèi)腔改構(gòu)人重鏈鐵蛋白；所述的金屬離子包括錳、鎂、銅、鋅、鐵、鋁、鉀或鈉。

8、所述的pstag屏蔽序列為，

9、gsgssgpsatpgstgptsapgstgpatpsgtsgpstagptsgpsgtpastgpag，見seq?id?no.1、

10、或

11、gsgssgpsatpgstgptsapgstgpatpsgtsgpstagptsgpsgtpastgpatpsgtsgp?satpgtsgpsgtsptagpagstpstgpsaptgstgpagstpstgptg，見seq?id?no.2；

12、或

13、gsgssgpsatpgstgptsapgstgpatpsgtsgpstagptsgpsgtpastgpatpsgtsgpsatpgtsgpsgtsptagpagstpstgpsaptgstgpagstpstgptsgptasgpsatpgstgptsapgstgpsatpgtsgpsgtsaptgpsgtpastgpatpsgtsgpsatpgtsgpsgtsptagpsatpgstgptsapgstgpstgspatgpst，見seq?id?no.3；

14、所述的腫瘤微環(huán)境酶響應(yīng)序列為prhlrnlvpmvatv，見seq?id?no.4；

15、icd誘導(dǎo)肽為gqvgrqlaiigddinr，見seq?id?no.5；cgtnvfnatfhiwhsgqfgt，見seqid?no.6；avpiaqk，見seq?id?no.7；

16、gffalipkiissplfktllsavgsalsssggqe，見seq?id?no.8；

17、kwkvfkkiekmgrnirngivkagpaiavlgeakal，見seq?id?no.9；

18、pawrkafrwawrmlkkaa，見seq?id?no.10；

19、klaklakklaklak，見seq?id?no.11；

20、klnfrqkllnlisklfcsgt，見seq?id?no.12；

21、所述的胞內(nèi)釋放序列為slvr，見seq?id?no.13；

22、內(nèi)腔改構(gòu)人重鏈鐵蛋白的氨基酸序列為

23、mttastsqvrqnyhqdseaainrqinlelyasyvylsmsyyfdrddvalknfakyflhqsheerehaeklmklqnqrggriflqdikkpdcddwesglnamecalhleknvnqsllelhklatdkndphlcdfiethylneqvkaikelgdhvtnlrkmgapesglaeylfdkhtlgdsdneshhhhhhhh，見seq?id?no.14。

24、所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述的人重鏈鐵蛋白衍生物的氨基酸序列為：

25、mgklaklakklaklakggslvrggmttastsqvrqnyhqdseaainrqinlelyasyvylsmsyyfdrddvalknfakyflhqsheerehaeklmklqnqrggriflqdikkpdcddwesglnamecalhleknvnqsllelhklatdkndphlcdfiethylneqvkaikelgdhvtnlrkmgapesglaeylfdkhtlgdsdneshhhhhhhh，見seqid?no.15、

26、或

27、mggsgssgpsatpgstgptsapgstgpatpsgtsgpstagptsgpsgtpastgpagefprhlrnlvpmvatvggklaklakklaklakggslvrggmttastsqvrqnyhqdseaainrqinlelyasyvylsmsyyfdrddvalknfakyflhqsheerehaeklmklqnqrggriflqdikkpdcddwesglnamecalhleknvnqsllelhklatdkndphlcdfiethylneqvkaikelgdhvtnlrkmgapesglaeylfdkhtlgdsdneshhhhhhhh，見seq?idno.16、

28、或

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30、或

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32、所述的系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：在鐵蛋白外部融合表達(dá)icd誘導(dǎo)肽；利用鐵蛋白結(jié)構(gòu)上自帶的離子通道，通過加熱使鐵蛋白離子通道和pstag纏繞屏蔽打開，向其中加入金屬離子使其進(jìn)入鐵蛋白，恢復(fù)至室溫鐵蛋白離子通道關(guān)閉且pstag恢復(fù)空間屏蔽，得到內(nèi)腔包含金屬離子的融合蛋白-金屬離子復(fù)合物。

33、所述的系統(tǒng)在制備預(yù)防或治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。

34、所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤為乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、腎癌、前列腺癌或腦癌。所述的前藥系統(tǒng)的藥物載藥量為900-3200個(gè)金屬離子/每個(gè)籠狀24聚體。

35、優(yōu)選的，通過gg或ef連接序列將pstag屏蔽序列、腫瘤微環(huán)境酶響應(yīng)序列、icd誘導(dǎo)序列和胞內(nèi)釋放序列偶聯(lián)；

36、本發(fā)明還涉及所述的融合蛋白-金屬離子復(fù)合物前藥系統(tǒng)的制備方法，具體的，所述的方法包括如下步驟：

37、步驟(1)、制備并純化所述內(nèi)腔改構(gòu)人重鏈鐵蛋白衍生物

38、利用ncbi數(shù)據(jù)庫得到人h-鐵蛋白的全長(zhǎng)序列，在其n端引入pstag、腫瘤微環(huán)境響應(yīng)位點(diǎn)、icd誘導(dǎo)肽功能序列，設(shè)計(jì)出融合蛋白的蛋白序列，經(jīng)過密碼子優(yōu)化后，將融合蛋白的cdna構(gòu)建到表達(dá)載體pet-28a(genscript)上；然后利用原核表達(dá)系統(tǒng)，融合蛋白-pet-28a轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株bl21(de3)(beyotime?biotechnology)，利用iptg誘導(dǎo)表達(dá)，之后對(duì)人hfn蛋白進(jìn)行純化；

39、表達(dá)與純化具體方法為：在37℃下，用0.5mm?iptg誘導(dǎo)表達(dá)蛋白質(zhì)8小時(shí)。收集菌體并用20mm?tris-hcl(ph?8.0)緩沖液重懸。通過超聲處理獲得細(xì)菌裂解液，然后離心(12,000g、30min、4℃)。收集上清液并在70℃下加熱15min，再次離心(12,000g、30min、4℃)。收集上清液用q-sepharose?fastflow和superdextm?200pg柱進(jìn)行純化。采用12％(v/v)聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)分析。然后，收集最純凈的組分，用100kda離心超濾管超濾并將緩沖液置換為20mm?hepes，得到融合蛋白濃儲(chǔ)。

40、步驟(2)、使用內(nèi)腔改構(gòu)人重鏈鐵蛋白衍生物裝載錳離子

41、將內(nèi)腔改構(gòu)人重鏈鐵蛋白衍生物用20mm?hepes?ph?8.0稀釋至最終濃度為1.5mg/ml，最終體積為50ml，并在60℃恒溫水浴中溫和攪拌30min；

42、用去離子水制備的氯化錳溶液(450mm)，以130μl/min的速度滴泵入反應(yīng)混合物(在60℃的水浴中輕輕攪拌)，攪拌80min；

43、將反應(yīng)混合物在60℃恒溫的水浴中輕輕攪拌160min。然后將反應(yīng)混合物自然冷卻至室溫，離心(8,000g、30min、4℃)以去除變性蛋白；

44、將上清液置于50kda透析袋中，用hepes緩沖液在4℃下透析過夜，以去除游離錳離子，至此得到融合蛋白-金屬離子復(fù)合物。

45、步驟(3)、融合蛋白-金屬離子復(fù)合物載藥量計(jì)算與定量

46、使用bca蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定融合蛋白濃度，封裝的錳使用icp-oes?5110進(jìn)行定量測(cè)定，從而推算出融合蛋白-金屬離子復(fù)合物的金屬離子裝載量。

47、原理：

48、如圖10a所示，人重鏈鐵蛋白衍生物為pstag屏蔽序列、腫瘤微環(huán)境酶響應(yīng)序列、icd誘導(dǎo)序列和胞內(nèi)釋放序列與所內(nèi)腔改構(gòu)人重鏈鐵蛋白偶聯(lián)而成的融合蛋白；實(shí)現(xiàn)如下功能：①pstag屏蔽序列：減少鐵蛋白籠內(nèi)金屬離子的滲漏，延長(zhǎng)融合蛋白半衰期，提高融合蛋白穩(wěn)定性，改善融合蛋白體內(nèi)分布，減少脫靶肝富集，降低脫靶毒性。②腫瘤微環(huán)境響應(yīng)位點(diǎn)：能夠被腫瘤微環(huán)境中高表達(dá)的酶切開，去掉屏蔽序列，釋放出發(fā)揮抗腫瘤作用的融合蛋白。③icd誘導(dǎo)肽：能夠作用于腫瘤細(xì)胞線粒體，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生icd死亡的細(xì)胞殺傷肽。④胞內(nèi)切割位點(diǎn)：在鐵蛋白攜帶icd誘導(dǎo)短肽進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，能夠?qū)cd誘導(dǎo)短肽與鐵蛋白分開，使icd誘導(dǎo)短肽能夠作用于線粒體，發(fā)揮誘導(dǎo)icd的作用。

49、如圖10b所示，融合蛋白-金屬離子復(fù)合物前藥系統(tǒng)經(jīng)靜脈注射后具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，其作用機(jī)制為：復(fù)合物進(jìn)入體內(nèi)后，在腫瘤微環(huán)境中發(fā)生mmp14酶切，去掉pstag，暴露kla-fn，然后由cd71介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞?；钚苑肿觡la在細(xì)胞內(nèi)裂解后釋放，作用于線粒體，誘導(dǎo)ros水平升高。然后腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷icd和sting通路激活，從而介導(dǎo)dc成熟和t細(xì)胞激活，實(shí)現(xiàn)全身免疫應(yīng)答。在本發(fā)明中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，融合蛋白-金屬離子復(fù)合物能夠成功誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生icd，并具有良好的腫瘤靶向性，在激活免疫細(xì)胞活性的同時(shí)，能夠有效抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展。

50、有益效果

51、本發(fā)明構(gòu)建全新的融合蛋白-金屬離子復(fù)合物前藥系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括所述系統(tǒng)包括腫瘤靶向icd誘導(dǎo)藥物載體和免疫激活金屬離子內(nèi)容物。其中所述腫瘤靶向icd誘導(dǎo)藥物載體為人重鏈鐵蛋白衍生物聚合形成具有空腔的納米顆粒，所述金屬離子和藥物裝載在所述空腔內(nèi)。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

52、1、如圖7所示，該復(fù)合物顯著降低了肝臟蓄積，克服了現(xiàn)有技術(shù)中fn優(yōu)先被肝臟攔截，而不是靶向腫瘤的缺陷；如圖6所示延長(zhǎng)了半衰期，如圖7所示，在8h左右達(dá)到腫瘤部位富集，相比于無環(huán)境響應(yīng)的原型鐵蛋白對(duì)照具有更好的腫瘤靶向性。此外融合蛋白-金屬離子復(fù)合物更少的在肝富集，提高了系統(tǒng)安全性。

53、2、如圖3所示，該復(fù)合物在在4℃和37℃條件下，24h內(nèi)的滲漏均低于10％，滲漏非常少，克服了現(xiàn)有技術(shù)中fn-藥物復(fù)合物穩(wěn)定性不理想的技術(shù)缺陷。

54、3、如圖2所示，復(fù)合物能夠mmp14依賴的成功誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生icd，同時(shí)對(duì)健康細(xì)胞損傷很小，說明本發(fā)明毒副作用，更加安全。

55、4、如圖5所示，復(fù)合物包載金屬離子(如na+、al3+、zn2+、cu2+、k+、ca2+、fe2+、fe3+、mg2+、mn2+等)增加dc細(xì)胞和cd8+t細(xì)胞的活化，誘導(dǎo)更好的免疫反應(yīng)激活。如圖8所示，本發(fā)明復(fù)合物本身可以作為藥物預(yù)防腫瘤的發(fā)生。如圖9所示，也可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

56、5、如圖4所示，本發(fā)明進(jìn)一步可以作為載體包載藥物(抗腫瘤藥物，如阿霉素)，增加抗腫瘤作用。