本發(fā)明屬于口服胰島素納米制劑的制備，具體涉及一種基于脫氧膽酸修飾益生菌芽孢構(gòu)建口服胰島素納米遞藥系統(tǒng)的方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、糖尿病是一種慢性代謝性疾病，全球約有4.15億人患有糖尿病，預(yù)計(jì)未來(lái)幾年將呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。糖尿病的慢性高血糖與不同器官的長(zhǎng)期損害、功能障礙和衰竭有關(guān)，尤其是眼睛、腎臟、神經(jīng)、心臟和血管。糖尿病在臨床上主要分為ⅰ型糖尿病和ⅱ型糖尿病兩種類型。據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在所有糖尿病患者中，大約95%以上都是以ⅱ型糖尿病為主，只有不到5%為ⅰ型糖尿病，而且隨著年齡的增長(zhǎng)，發(fā)病率也在逐漸增加。胰島素（insulin，ins）不但是ⅰ型糖尿病的首選藥物，也是部分ⅱ型糖尿病后期的必備藥物。雖然皮下注射胰島素起效快，生物利用度比較高，但是長(zhǎng)期注射給病人帶來(lái)很大的痛苦，而且費(fèi)用也較高?？诜葝u素具有方便、無(wú)痛、模擬內(nèi)源性胰島素通路、保護(hù)胰腺β細(xì)胞、減輕長(zhǎng)期注射不良反應(yīng)的作用和提高患者依從性等優(yōu)勢(shì)。

2、由于胃酸、胃腸道酶環(huán)境、腸粘膜和腸上皮細(xì)胞等屏障作用，口服胰島素的生物利用度不足1%。因此，口服胰島素給藥仍存在巨大的挑戰(zhàn)。研究顯示，納米顆粒可以有效地克服胃腸道屏障，保護(hù)蛋白或多肽類藥物免受胃腸道環(huán)境的影響，并通過(guò)增強(qiáng)藥物內(nèi)化和滲透來(lái)提高其口服生物利用度。

3、凝結(jié)芽孢桿菌（bacillus?cululans，bc）是一類被美國(guó)食品和藥物管理局認(rèn)可的“一般公認(rèn)為安全”的乳酸菌。并且凝結(jié)芽孢桿菌的芽孢表面有蛋白質(zhì)涂層，能夠經(jīng)受高溫、酸堿、紫外線以及多種化學(xué)物質(zhì)滅殺。芽孢桿菌孢子作為益生菌的休眠生命體，具備抵抗胃腸道惡劣環(huán)境、穿透黏液層和脫落兩親性蛋白外殼后、定植腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生益生菌的特點(diǎn)。受芽孢生理特性的啟發(fā)，本發(fā)明構(gòu)建了一種新型的脫氧膽酸（da）修飾芽孢桿菌口服胰島素納米遞藥系統(tǒng)，將其作為自發(fā)納米“生成器”來(lái)解決口服胰島素的吸收屏障問(wèn)題，目前尚沒(méi)有該方面的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了一種基于脫氧膽酸修飾益生菌芽孢構(gòu)建口服胰島素納米遞藥系統(tǒng)的方法，該方法制備的口服胰島素納米遞藥系統(tǒng)能夠克服胃腸道中酶屏障、腸道黏液屏障以及腸上皮細(xì)胞屏障，從而提高口服胰島素的生物利用度，發(fā)揮較好的降血糖作用，因此制備的口服胰島素納米遞藥系統(tǒng)能夠用于制備治療或/和預(yù)防糖尿病的口服藥物。

2、本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題采用如下技術(shù)方案，基于脫氧膽酸修飾益生菌芽孢構(gòu)建口服胰島素納米遞藥系統(tǒng)的方法，其特征在于具體步驟為：

3、步驟s1，將脫氧膽酸溶于無(wú)水乙醇中，再與1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺（edc）和n-羥基琥珀酰亞胺（nhs）混合活化羧基，然后加入純化后的芽孢（spore），于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，反應(yīng)完成后透析，離心得到沉淀，沉淀用超純水洗滌，冷凍干燥得到脫氧膽酸修飾益生菌芽孢載體da-spore；

4、步驟s2，在弱酸環(huán)境下，將胰島素與脫氧膽酸修飾益生菌芽孢載體da-spore混合攪拌，通過(guò)物理吸附合成口服胰島素納米遞藥系統(tǒng)da-spore/ins，該口服胰島素納米遞藥系統(tǒng)da-spore/ins在腸道環(huán)境下自發(fā)形成脫氧膽酸修飾的胰島素納米粒da-spore/insnps。

5、進(jìn)一步限定，步驟s1所述純化后的芽孢的具體制備過(guò)程為：將凝結(jié)芽孢桿菌于37℃孵育48h，用掃描電鏡檢測(cè)芽孢桿菌的產(chǎn)孢程度，產(chǎn)孢率達(dá)到90%后將混懸液于80℃加熱30min，隨后于4℃離心30min，再用1m?kcl溶液和去離子水洗滌，冷凍干燥得到純化后的芽孢。

6、進(jìn)一步限定，步驟s1所述脫氧膽酸修飾益生菌芽孢載體da-spore中脫氧膽酸與芽孢的重量百分配比為25wt%~70wt%:30wt%~75wt%。

7、進(jìn)一步限定，步驟s2所述口服胰島素納米遞藥系統(tǒng)da-spore/ins中脫氧膽酸、芽孢和胰島素的重量百分配比為20wt%~60wt%:30wt%~65wt%:5wt%~45wt%。

8、本發(fā)明所述的口服胰島素納米遞藥系統(tǒng)在制備治療或/和預(yù)防糖尿病口服藥物中的應(yīng)用。

9、進(jìn)一步限定，所述口服胰島素納米遞藥系統(tǒng)用于保護(hù)胰島素免受胃強(qiáng)酸環(huán)境以及胃腸道中胃蛋白酶和胰蛋白酶的破壞，維持口服胰島素納米遞藥系統(tǒng)中胰島素的二級(jí)空間活性結(jié)構(gòu)；口服胰島素納米遞藥系統(tǒng)借助芽孢在腸道定向定植并萌發(fā)生成益生菌，并脫落蛋白外殼，自發(fā)形成脫氧膽酸修飾的胰島素納米粒da-spore/ins?nps；該脫氧膽酸修飾的胰島素納米粒da-spore/ins?nps借助芽孢表面功能蛋白和頂端鈉依賴性膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（asbt）的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)作用克服腸道黏液和腸上皮細(xì)胞屏障，提高胰島素口服生物利用度和實(shí)現(xiàn)胰島素的降血糖作用。

10、進(jìn)一步限定，所述糖尿病為ⅰ型糖尿病或ii型糖尿病。

11、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：本發(fā)明基于脫氧膽酸修飾益生菌芽孢構(gòu)建了口服胰島素納米遞藥系統(tǒng)da-spore/ins，該da-spore/ins遞藥系統(tǒng)能夠克服胃腸道蛋白酶的降解，跨過(guò)腸道黏液和腸上皮細(xì)胞屏障，實(shí)現(xiàn)口服胰島素的腸道高效遞送，提高胰島素的口服生物利用度，實(shí)現(xiàn)較好的口服降血糖作用。

技術(shù)特征：

1.基于脫氧膽酸修飾益生菌芽孢構(gòu)建口服胰島素納米遞藥系統(tǒng)的方法，其特征在于具體步驟為：

2.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于脫氧膽酸修飾益生菌芽孢構(gòu)建口服胰島素納米遞藥系統(tǒng)的方法，其特征在于步驟s1所述純化后的芽孢的具體制備過(guò)程為：將凝結(jié)芽孢桿菌于37℃孵育48h，用掃描電鏡檢測(cè)芽孢桿菌的產(chǎn)孢程度，產(chǎn)孢率達(dá)到90%后將混懸液于80℃加熱30min，隨后于4℃離心30min，再用1m?kcl溶液和去離子水洗滌，冷凍干燥得到純化后的芽孢。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于脫氧膽酸修飾益生菌芽孢構(gòu)建口服胰島素納米遞藥系統(tǒng)的方法，其特征在于：步驟s1所述脫氧膽酸修飾益生菌芽孢載體da-spore中脫氧膽酸與芽孢的重量百分配比為25wt%~70wt%:30wt%~75wt%。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于脫氧膽酸修飾益生菌芽孢構(gòu)建口服胰島素納米遞藥系統(tǒng)的方法，其特征在于：步驟s2所述口服胰島素納米遞藥系統(tǒng)da-spore/ins中脫氧膽酸、芽孢和胰島素的重量百分配比為20wt%~60wt%:30wt%~65wt%:5wt%~45wt%。

5.根據(jù)權(quán)利要求1~4中任意一項(xiàng)所述的方法制備的口服胰島素納米遞藥系統(tǒng)在制備治療或/和預(yù)防糖尿病口服藥物中的應(yīng)用。

6.?根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于：所述口服胰島素納米遞藥系統(tǒng)用于保護(hù)胰島素免受胃強(qiáng)酸環(huán)境以及胃腸道中胃蛋白酶和胰蛋白酶的破壞，維持口服胰島素納米遞藥系統(tǒng)中胰島素的二級(jí)空間活性結(jié)構(gòu)；口服胰島素納米遞藥系統(tǒng)借助芽孢在腸道定向定植并萌發(fā)生成益生菌，并脫落蛋白外殼，自發(fā)形成脫氧膽酸修飾的胰島素納米粒da-spore/ins?nps；該脫氧膽酸修飾的胰島素納米粒da-spore/ins?nps借助芽孢表面功能蛋白和頂端鈉依賴性膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)作用克服腸道黏液和腸上皮細(xì)胞屏障，提高胰島素口服生物利用度和實(shí)現(xiàn)胰島素的降血糖作用。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于：所述糖尿病為ⅰ型糖尿病或ii型糖尿病。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種基于脫氧膽酸修飾益生菌芽孢構(gòu)建口服胰島素納米遞藥系統(tǒng)的方法及應(yīng)用，其具體制備步驟為：將脫氧膽酸溶于無(wú)水乙醇中，再與EDC和NHS混合活化羧基，加入純化后的芽孢，于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)得到脫氧膽酸修飾益生菌芽孢載體DA?Spore；在弱酸環(huán)境下，將胰島素與DA?Spore混合攪拌，通過(guò)物理吸附合成口服胰島素納米遞藥系統(tǒng)DA?Spore/Ins。本發(fā)明構(gòu)建的DA?Spore/Ins遞藥系統(tǒng)能夠克服胃腸道蛋白酶的降解，跨過(guò)腸道黏液和腸上皮細(xì)胞屏障，實(shí)現(xiàn)口服胰島素的腸道高效遞送，提高胰島素的口服生物利用度，實(shí)現(xiàn)較好的口服降血糖作用。

技術(shù)研發(fā)人員：梁金英,王全喜,白孟鑫,賀曉丹,張勉,梁競(jìng)文,畢亞榮,姜尚,汪思妍,馬素英
受保護(hù)的技術(shù)使用者：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6