本發(fā)明涉及納米藥物領(lǐng)域，具體涉及一種基于介孔二氧化硅的多肽抗原納米粒系統(tǒng)及其制備方法、應(yīng)用

背景技術(shù)：

1、蛋白質(zhì)藥物可分為多肽和基因工程藥物、單克隆抗體和基因工程抗體、重組疫苗等；與傳統(tǒng)的小分子藥物相比，作為生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能的活性物質(zhì)，蛋白質(zhì)和多肽涉及到激素、神經(jīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖等各個(gè)領(lǐng)域。與傳統(tǒng)小分子化學(xué)藥物相比，蛋白質(zhì)藥物具有良好的生物活性、特異性強(qiáng)、低毒性、生物功能明確、有利于臨床應(yīng)用的特點(diǎn)，往往療效顯著、不良反應(yīng)小、安全性高，很少引起嚴(yán)重的免疫反應(yīng)。因此，蛋白多肽類藥物已成為治療內(nèi)分泌類、感染類及代謝類等多種疾病的一線藥物。但是，蛋白多肽類藥物的穩(wěn)定性差、易酶解、生物半衰期短，較難通過(guò)生物屏障及脂質(zhì)膜，從而導(dǎo)致此類藥物生物利用率較低。因此，近年來(lái)，有研究者嘗試將其包埋于微球、凝膠等載體模型中，用于肌肉或皮下注射不僅能防止藥物在體內(nèi)快速降解，還可達(dá)到緩釋長(zhǎng)效的目的。因此，針對(duì)蛋白多肽類藥物給藥上的不足，采用了許多的技術(shù)對(duì)多肽類藥物進(jìn)行修飾或納入新型給藥載體系統(tǒng)，以增強(qiáng)蛋白多肽類藥物的療效。

2、多肽trpm8-2(簡(jiǎn)稱t2)結(jié)構(gòu)如下所示，是trpm8(瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道亞家族m成員)蛋白的抗原表位，其氨基酸的序列為cseem?rhrfr?qldtk?lndlkg，分子量為2.58kda。trpm8-2可參與炎癥以及癌癥的調(diào)控。然而，t2多肽作為多肽類藥物在制劑開發(fā)上同樣面臨上述多肽類藥物面臨的難題。

3、

4、納米顆粒(np)具有良好的可修飾性和負(fù)載功能藥物的能力以及生物相容性大、尺寸小、生物利用度高以及易與配體功能化等優(yōu)點(diǎn)，非常有利于構(gòu)建納米診療一體化平臺(tái)，在精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用價(jià)值，因此被確立為診斷和藥物應(yīng)用領(lǐng)域的新型給藥載體。根據(jù)組成成分的不同，納米顆粒主要被區(qū)分為有機(jī)和無(wú)機(jī)納米材料，由于有機(jī)材料在各種條件下(溫度范圍、ph值和離子條件、溶解度)的穩(wěn)定性較差，因此，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的無(wú)機(jī)材料被應(yīng)用到納米給藥系統(tǒng)中，這些無(wú)機(jī)材料均具有高的載藥能力、良好的生物相容性以及不容易在體內(nèi)蓄積、副作用小等特點(diǎn)，在新型給藥系統(tǒng)中具有較高的價(jià)值。

5、針對(duì)于多肽藥物穩(wěn)定性差、包封率低的特點(diǎn)，如何荷載多肽、保護(hù)多肽，并將多肽高效地遞送到靶部位，是目前多肽類藥物遞送系統(tǒng)設(shè)計(jì)開發(fā)急需解決的難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的

2、本發(fā)明是針對(duì)多肽類藥物的不穩(wěn)定性以及酶降解性，構(gòu)建高效荷載多肽的介孔二氧化硅納米載體系統(tǒng)。

3、本發(fā)明基于介孔二氧化硅納米顆粒(mesoporous?silica?nanoparticles，msns)，構(gòu)建了一種荷載模型多肽t2的納米載體，并用脂質(zhì)進(jìn)行包裹，實(shí)現(xiàn)荷載、保護(hù)、遞送等多重功能。即制備一種載t2多肽的多肽介孔二氧化硅納米載體系統(tǒng)，該納米粒系統(tǒng)，其能夠提高t2多肽完成跨膜進(jìn)入胞內(nèi)，并且提高了多肽在體內(nèi)的穩(wěn)定性。

4、本發(fā)明的另一目的是提供上述基于載多肽介孔二氧化硅系統(tǒng)的制備方法及應(yīng)用。

5、技術(shù)方案

6、一種基于介孔二氧化硅的t2多肽抗原納米粒系統(tǒng)，其特征在于，包括:t2多肽，介孔二氧化硅、磷脂、膽固醇。其中，所述t2多肽通過(guò)物理吸附成載藥介孔二氧化硅納米粒，而后包裹脂質(zhì)材料，制備成載多肽脂質(zhì)介孔二氧化硅納米顆粒。

7、所述脂質(zhì)材料為脂質(zhì)和膽固醇配制而成。

8、所述介孔二氧化硅納米粒由如下步驟制備獲得：取ctab,teos及氨水溶解于去離子水中溶劑中，通過(guò)軟模板法制備得到介孔二氧化硅。

9、所需的teos為2-8ml,氨水用量為3-12ml,ctab用量為0.25-1g。

10、所述軟模板法中磁力攪拌轉(zhuǎn)速為700-1000rpm，煅燒時(shí)間為4-7h.

11、所述t2肽與介孔二氧化硅用量比為1:1-5，所述t2多肽的質(zhì)量濃度為0.2-1.0mg/ml。所述多肽為t2多肽的氨基酸序列為:cseem?rhrfr?qldtk?lndlk?g。

12、所述脂質(zhì)材料中膽固醇：磷脂為1：3-6，超聲時(shí)間為1-4min，超聲功率為100-300w。

13、結(jié)果：最佳比例為：teos為4ml,ctab為0.5g，氨水用量為6ml,攪拌轉(zhuǎn)速為700rpm,煅燒時(shí)間為6h,msn:t2為5：1，t2多肽的質(zhì)量濃度為1.0mg/ml，磷脂與膽固醇與質(zhì)量比4:1，超聲時(shí)間為1min，超聲功率為200w。

14、進(jìn)一步而言：

15、本發(fā)明提供一種基于介孔二氧化硅的t2多肽抗原納米粒系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟：

16、步驟一：取ctab,teos及氨水溶解于去離子水中溶劑中，通過(guò)軟模板法制備得到介孔二氧化硅。

17、步驟二：取t2多肽、介孔二氧化硅溶解于去離子水的溶劑中，通過(guò)物理吸附法制備得到載t2多肽的介孔二氧化硅納米粒。

18、步驟三：將步驟一得到的多載t2多肽的介孔二氧化硅納米粒與脂質(zhì)材料通過(guò)薄膜水化法制備得到載t2多肽的脂質(zhì)-介孔二氧化硅納米粒。

19、作為一種優(yōu)選方式，上述步驟一中，所述ctab的用量為0.25-1g；優(yōu)選地，所述ctab的用量為0.25-0.75g。所述teos的用量為2-8ml；氨水用量為3-12ml，優(yōu)選地，所述teos的用量為2-6ml，氨水用量為3-9ml。磁力攪拌所使用轉(zhuǎn)速為700-1000rpm/min，煅燒時(shí)間為4-7h,優(yōu)選地，磁力攪拌轉(zhuǎn)速為700-900rpm/min,煅燒時(shí)間為5-7h。

20、作為一種優(yōu)選方式，上述步驟二中，磁力攪拌所使用的時(shí)間為40-100min；優(yōu)選地，磁力攪拌轉(zhuǎn)速為40-80min。所述t2肽與介孔二氧化硅用量比為1：1-5，所述t2多肽的質(zhì)量濃度為0.2-1.0mg/ml；優(yōu)選地，所述t2肽與介孔二氧化硅用量比為1:2-4，所述t2多肽的質(zhì)量濃度為0.6-1.0mg/ml。經(jīng)過(guò)磁力攪拌制得載藥納米粒。

21、作為一種優(yōu)選方式，上述步驟三中，稱取磷脂及膽固醇溶于三氯甲烷中，通過(guò)薄膜水化法制得脂質(zhì)薄膜，將介孔二氧化硅及t2多肽混合水溶液加入到脂質(zhì)薄膜中。所述膽固醇與磷脂質(zhì)量比為1:3-6，超聲時(shí)間為1-4min，超聲功率為100-300w。所述膽固醇與磷脂質(zhì)量比為1:3-6；優(yōu)選地，所述膽固醇與磷脂質(zhì)量比為1:3-5。以及/或者所述介孔二氧化硅質(zhì)量濃度為1-5mg/ml；優(yōu)選地，所述介孔二氧化硅質(zhì)量濃度為3-5mg/ml。以及/或者所述t2多肽的質(zhì)量濃度為0.2-1.0mg/ml，得到荷載t2多肽抗原的脂質(zhì)-介孔二氧化硅納米粒。

22、作為最佳工藝，所述的方法，其特征在于，

23、步驟一中，氨水加入為6ml,teos加入量為4ml，ctab加入量為0.5g，攪拌速度為700rpm,煅燒時(shí)間為6h；

24、步驟二中，磁力攪拌時(shí)間為43min；介孔二氧化硅與t2多肽比例為5:1，t2多肽質(zhì)量濃度為1mg/ml；

25、步驟三中，磷脂與膽固醇與質(zhì)量比4:1，超聲時(shí)間為1min，超聲功率為200w。

26、通過(guò)本發(fā)明上述方法可以制備得到粒徑均一，pdi良好的載t2多肽抗原的脂質(zhì)-介孔二氧化硅納米顆粒，該體系對(duì)生物系統(tǒng)具有較低得毒性，并且體系穩(wěn)定，具有良好的生物相容性。是一種理想的藥物遞送系統(tǒng)。

27、本發(fā)明還提供上述基于介孔二氧化硅的t2多肽抗原納米顆粒系統(tǒng)在制藥中的應(yīng)用，該載藥納米凝膠系統(tǒng)通過(guò)不同給藥途徑從而治療前列腺癌和/或慢性前列腺炎(cp/cpps)的潛力。

28、本發(fā)明還提供上述基于介孔二氧化硅的t2多肽抗原納米顆粒系統(tǒng)適用于皮下注射、靜脈注射、口服、吸入等多種給藥途徑，以及進(jìn)一步設(shè)計(jì)成為具有靶向給藥系統(tǒng)的制劑應(yīng)用。

29、有益效果

30、本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于：首先，本發(fā)明設(shè)計(jì)構(gòu)建了荷載多肽的脂質(zhì)-介孔二氧化硅納米粒，主要針對(duì)模型多肽藥物t2多肽的治療潛力及其給藥上的不足，通過(guò)納米載體包裹與脂質(zhì)表面修飾，可以有效地提高多肽的包封率以及載藥量；同時(shí)，構(gòu)建的納米載體能夠緩慢釋放多肽，加強(qiáng)多肽在體內(nèi)的作用時(shí)間，加強(qiáng)樹突狀細(xì)胞對(duì)與多肽的攝取，從而激活機(jī)體的免疫應(yīng)答。此外，本發(fā)明所采用的無(wú)機(jī)介孔二氧化硅具有免疫佐劑的特性，能夠保護(hù)多肽抗原進(jìn)而增強(qiáng)其在抗原呈遞細(xì)胞，從而能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)；再者，本發(fā)明所構(gòu)建的荷載多肽的納米載體，通過(guò)皮下注射的方式給藥后，將納米載體包裹的t2抗原肽呈遞到樹突細(xì)胞，從而完成免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明構(gòu)建的是一種非常有前景的納米載體，可應(yīng)用于免疫治療。具體如下：

31、(1)本發(fā)明提供的多肽納米顆粒系統(tǒng)的制備方法簡(jiǎn)單、快速，制得的多肽納米顆粒系統(tǒng)相比現(xiàn)有技術(shù)的納米遞送系統(tǒng)，具有較高的包封率和載藥量。本發(fā)明荷載t2多肽的介孔二氧化硅納米顆粒的包封率為87％，加入脂質(zhì)材料后，形成荷載t2多肽的脂質(zhì)-介孔二氧化硅納米顆粒包封率可達(dá)93％。

32、(2)本發(fā)明提供的多肽納米顆粒系統(tǒng)將t2多肽包裹在納米粒的孔道中，對(duì)t2多肽起到了保護(hù)作用，提高了t2多肽的穩(wěn)定性，并且提高了t2多肽多種給藥劑型的研發(fā)。

33、(3)本發(fā)明提供的多肽納米顆粒系統(tǒng)適用性廣，具備進(jìn)一步被修飾的能力，適用于皮下注射、靜脈注射、口服、吸入等多種給藥途徑，以及靶向修飾的給藥系統(tǒng)及制劑的開發(fā)。

34、(4)本發(fā)明提供的多肽納米系統(tǒng)能顯著激活機(jī)體的免疫應(yīng)答，是治療慢性前列腺炎(cp/cpps)和/或前列腺癌非常理想的給藥系統(tǒng)。