本發(fā)明涉及口服益生菌制劑，尤其是涉及一種蒙脫石-益生菌微球制劑及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、炎癥性腸病(ibd)是一類慢性炎癥性胃腸道疾病，包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎。這些疾病常導(dǎo)致腸道黏膜炎癥、腸屏障功能受損以及腸道菌群失調(diào)。蒙脫石，作為一種天然層狀硅酸鹽礦物，以其優(yōu)異的病原體吸附能力和腸黏膜保護(hù)作用，在ibd引發(fā)的腹瀉治療中顯示出顯著的療效。此外，蒙脫石主要從天然膨潤土礦山中開采，具有較高的安全性，其吸附的有害物質(zhì)可以隨胃腸道蠕動被排出體外，從而減少系統(tǒng)性副作用的風(fēng)險。然而，蒙脫石的作用機(jī)制主要限于癥狀緩解和局部保護(hù)，尚未解決ibd的根本病因。

2、口服益生菌能夠通過調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)、產(chǎn)生抗炎物質(zhì)、增強(qiáng)腸道屏障及調(diào)控腸道菌群，提供系統(tǒng)性治療ibd的可能性。為了克服蒙脫石的治療局限性，將益生菌固定在蒙脫石表面是一個潛在的解決方案。蒙脫石具有優(yōu)異的陽離子交換特性，其層間的陽離子(如ca2+，na+)易與環(huán)境中的氫離子(h+)交換，這使得蒙脫石表面的電荷由負(fù)轉(zhuǎn)正，有助于增強(qiáng)與益生菌的靜電相互作用，從而促進(jìn)益生菌在其表面形成生物被膜。益生菌的生物被膜由益生菌及其分泌的胞外聚合物組成，為益生菌提供了良好的附著表面，增強(qiáng)其在腸道中的黏附能力。因此，該方法也能有效克服由于胃腸道的快速轉(zhuǎn)運(yùn)和炎癥部位黏膜損傷導(dǎo)致的益生菌附著能力不足及滯留時間短的問題。

3、中國專利cn?112972503?a公開了一種益生菌體系的制備方法及其應(yīng)用，將生物體內(nèi)的益生菌在體外與無機(jī)材料系統(tǒng)結(jié)合，通過混合培養(yǎng)的方式，形成“細(xì)菌-無機(jī)材料-生物被膜”的復(fù)合微球，其中無機(jī)材料包括蒙脫石。所制備的微球雖然能夠很好地吸附在宿主的腸道內(nèi)表面，并且為益生菌的穩(wěn)定生長于繁殖提供安全可靠的環(huán)境，但是生物被膜的抗胃酸能力是有限的，在口服到達(dá)胃部時仍會有較多數(shù)量的細(xì)菌失活。

4、中國專利cn?117462513?a公開了一種結(jié)腸靶向聚合物微球及其制備方法與應(yīng)用，該結(jié)腸靶向聚合物微球包括微球壁材和微球芯材；其中壁材的原料包括甲基丙烯酸化葡聚糖和甲基丙烯酸化單寧酸，微球芯材的原料包括益生菌和后生元。該方法基于液滴微流控技術(shù)，通過簡單快速和時空可控的光交聯(lián)反應(yīng)，生成粒徑均一的包裹益生菌和后生元的單分散聚合物微球。該聚合物微球具有抵抗胃腸道環(huán)境侵襲、結(jié)腸靶向降解與腸道粘膜黏附的功能，可高效遞送益生菌及后生元用于腸道疾病治療。然而，這種結(jié)腸靶向聚合物微球是以油包水液滴為模板進(jìn)行交聯(lián)而制得的。油相不利于細(xì)菌活力的保持，并且在制備完成后需要反復(fù)洗滌以確保油相的有效去除，導(dǎo)致整體流程較為復(fù)雜。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的就是為了提供一種蒙脫石-益生菌微球制劑及其制備方法與應(yīng)用，系統(tǒng)、高效地治療ibd。

2、本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

3、本發(fā)明提供一種蒙脫石-益生菌微球制劑，所述微球制劑包括蒙脫石、益生菌生物被膜和功能小分子。

4、優(yōu)選地，所述微球制劑為由蒙脫石、益生菌生物被膜、功能小分子和微球壁材組成的微球，其中所述益生菌生物被膜附著于蒙脫石表面，所述功能小分子分散在蒙脫石和微球壁材之間。

5、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述微球壁材通過海藻酸鈉在收集液中交聯(lián)制備得到，所述蒙脫石、益生菌生物被膜和功能小分子被封裝在所述由海藻酸鈉制備得到的微球壁材內(nèi)。

6、優(yōu)選地，所述益生菌選自乳酸桿菌、雙歧桿菌、丁酸梭菌中的一種或多種。

7、優(yōu)選地，所述功能小分子選自吲哚-3-丙酸、丙酸、丁酸、脂壁酸、肽聚糖中的一種或多種。

8、本發(fā)明提供的蒙脫石-益生菌微球制劑可以克服蒙脫石作用的局限性以及益生菌的腸道粘附力低、易受環(huán)境攻擊和單一療效差等現(xiàn)實因素，開發(fā)了一種同時封裝蒙脫石-益生菌生物被膜和功能小分子的微球制劑，并賦予其抵抗胃酸和腸道響應(yīng)性釋放的特性。

9、第二方面，本發(fā)明還提供一種上述的蒙脫石-益生菌微球制劑的制備方法，包括以下步驟：

10、s1，將滅菌后的蒙脫石顆粒分散于處于對數(shù)生長期的益生菌培養(yǎng)液中，在28～40℃條件下培養(yǎng)36～60h，得到蒙脫石-益生菌生物被膜；

11、s2，將蒙脫石-益生菌生物被膜、功能小分子分散在海藻酸鈉溶液中，混合均勻后注入微流控芯片通道，在靜電壓的作用下生成噴霧液滴，并在收集液中交聯(lián)成微球制劑。

12、優(yōu)選地，步驟s1中，所述蒙脫石顆粒分散于益生菌培養(yǎng)液的濃度為5～20mg/ml。

13、優(yōu)選地，步驟s1中，所述處于對數(shù)生長期的益生菌培養(yǎng)液是指od600值為0.4～0.5的益生菌培養(yǎng)液。

14、優(yōu)選地，步驟s1中，所述培養(yǎng)指厭氧培養(yǎng)。

15、優(yōu)選地，步驟s1中，所述蒙脫石-益生菌生物被膜還需用無菌pbs溶液洗滌3次。

16、優(yōu)選地，步驟s1中，所述滅菌后的蒙脫石顆粒是指用紫外線照射0.5～1h滅菌后得到的蒙脫石顆粒。

17、優(yōu)選地，步驟s2中，所述蒙脫石-益生菌生物被膜分散在海藻酸鈉溶液中的濃度為10～40mg/ml；所述功能小分子分散在海藻酸鈉溶液的濃度為0.5～2mg/ml。

18、優(yōu)選地，步驟s2中，所述海藻酸鈉溶液的濃度為1～3％(w/v)。

19、進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟s2中，所述海藻酸鈉溶液的溶劑為pbs緩沖液。

20、優(yōu)選地，步驟s2中，所述靜電壓的大小為4～8kv。

21、優(yōu)選地，步驟s2中，所述收集液選自氯化鈣溶液、氯化鋇溶液、氯化鋁溶液中的一種或多種。

22、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述氯化鈣溶液、氯化鋇溶液、氯化鋁溶液的溶劑為無菌水，無菌水指經(jīng)過處理，去除了細(xì)菌、病毒、微生物孢子等所有形式的微生物的水。

23、優(yōu)選地，步驟s2中，所述收集液的濃度為1～3％(w/v)。

24、優(yōu)選地，步驟s2中，所述交聯(lián)的時間為1～5min。

25、優(yōu)選地，所述微流控芯片通道內(nèi)的液體流速為3～6ml/h。

26、第三方面，本發(fā)明還提供一種上述的蒙脫石-益生菌微球制劑在制備治療腸道疾病的口服活體益生菌制劑中的應(yīng)用。

27、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

28、(1)本發(fā)明通過直接采用蒙脫石作為益生菌的載體，形成蒙脫石-益生菌生物被膜復(fù)合物，隨后將蒙脫石-益生菌生物被膜復(fù)合物，功能小分子分散在海藻酸鈉溶液中，在收集液中交聯(lián)制備得到微球制劑。該微球制劑主要用于口服遞送蒙脫石-益生菌生物被膜和功能小分子，具有抵抗胃酸侵襲、腸道響應(yīng)性釋放等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效治療腸道炎癥。

29、(2)本發(fā)明的蒙脫石-益生菌微球制劑，所用的蒙脫石具有陽離子交換能力，能促進(jìn)產(chǎn)酸益生菌形成生物被膜。

30、(3)本發(fā)明的蒙脫石-益生菌微球制劑，所用的蒙脫石-益生菌生物被膜能增強(qiáng)腸黏膜的粘附，從而延長益生菌在腸道的滯留時間，并且一定程度上增強(qiáng)了益生菌抵抗體內(nèi)惡劣環(huán)境的能力。

31、(4)本發(fā)明的蒙脫石-益生菌微球制劑，通過海藻酸鈉在收集液中交聯(lián)制備得到，所用的海藻酸鈉具有良好的生物相容性，能夠保護(hù)益生菌抵抗胃酸侵襲，并在腸道環(huán)境下響應(yīng)性釋放。

32、(5)本發(fā)明的蒙脫石-益生菌微球制劑通過海藻酸鈉與ca2+在水相中交聯(lián)制備得到，制備過程簡單，且有利于保持細(xì)菌活力。

33、(6)本發(fā)明的蒙脫石-益生菌微球制劑，可協(xié)同包裹功能小分子，解決單一益生菌治療療效不佳的問題。

34、(7)本發(fā)明的蒙脫石-益生菌微球制劑的制備方法基于微流控電噴霧技術(shù)，制備工藝簡單，通量高，交聯(lián)速度快，微球尺寸均勻、可控且具有優(yōu)異的單分散性。