本發(fā)明屬于功能高分子材料領(lǐng)域，具體涉及一種負(fù)載光敏劑和表皮生長因子的水凝膠納米材料及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、皮膚是人體的主要防御器官，在抵御外部傷害和避免內(nèi)部水分流失方面起著至關(guān)重要的作用。然而，一旦皮膚的完整性受到損害，病原體就會穿透身體，導(dǎo)致各種后果，包括疼痛，出血，感染，炎癥，愈合時間延長和疤痕形成。此外，病原體的侵襲可能導(dǎo)致嚴(yán)重感染和炎癥，這將不可避免地導(dǎo)致慢性傷口愈合，給患者帶來長期的痛苦。

2、迄今為止，抗生素依然是治療細(xì)菌感染最有效的手段，但人們對抗生素的過度使用引發(fā)了細(xì)菌耐藥，隨之而來的是多重耐藥菌株的產(chǎn)生，這是對傳統(tǒng)抗生素藥物療效的巨大挑戰(zhàn)。因此，開發(fā)具有高效抗菌活性且不易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的新型抗菌劑具有十分重要的意義。利用金屬離子來殺菌消毒具有十分悠久的歷史。金屬離子之所以能夠具有定的殺菌作用，這是因為帶正電的金屬離子和帶負(fù)電的細(xì)菌表面相結(jié)合后，金屬離子能進(jìn)一步穿透細(xì)胞壁并導(dǎo)致其破裂，引起細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)成分的流失并最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。此外，金屬離子對細(xì)菌代謝和酶活性也有干擾作用，這會影響細(xì)菌正常的生理功能。常見的金屬離子如銀離子、銅離子、鋅離子和鉛離子等均有作為殺菌消毒應(yīng)用的相關(guān)報道。但不能忽視的是金屬離子對正常機(jī)體細(xì)胞的毒性，所以在設(shè)計該類納米材料時，它們的生物安全性問題也不容忽視。理想的創(chuàng)面敷料需提供濕潤的環(huán)境、良好的自我修復(fù)能力和抗菌能力。水凝膠敷料由于具有高親水性，優(yōu)異生物相容性等優(yōu)點,是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的敷料之一。然而，水凝膠敷料在處理細(xì)菌感染傷口時也存在一些缺點。首先，其適用范圍有限，不適合用于深部或隧道狀傷口，且難以完全覆蓋和填充整個傷口區(qū)域。此外，對于滲出液較多的傷口，水凝膠需要頻繁更換，從而增加了護(hù)理的工作量和費用。再者，由于水凝膠質(zhì)地柔軟，在傷口上固定可能不夠牢靠，因此需要額外的固定措施來保持敷料的穩(wěn)固。

3、抗菌光動力療法是一種非侵入性、經(jīng)臨床批準(zhǔn)且安全的治療策略?？捎行⑺兰?xì)菌病原體且不易產(chǎn)生耐藥。在光動力療法中，光敏劑能夠吸收可見光并激發(fā)至高能的單線態(tài)。然而，受激電子的自旋不穩(wěn)定，導(dǎo)致其壽命較短。激發(fā)態(tài)的分子可以通過氧化還原反應(yīng)或系間竄越轉(zhuǎn)變?yōu)閴勖^長的三重態(tài)。在光化學(xué)反應(yīng)中，主要通過i型和ii型機(jī)制進(jìn)行。在i型反應(yīng)中，三重態(tài)分子將電子轉(zhuǎn)移到底物，從而產(chǎn)生超氧陰離子和羥基自由基。這些活性氧會對細(xì)菌的細(xì)胞膜及其他生物分子造成不可逆的氧化損傷。而在ii型反應(yīng)中，激發(fā)的三重態(tài)分子會與分子氧反應(yīng)，通過能量轉(zhuǎn)移過程生成高活性的單線態(tài)氧。生成的單線態(tài)氧能夠有效消滅細(xì)菌病原體。光敏劑、光源和分子氧是光動力療法的三個基本先決條件，然而大多文獻(xiàn)報道光敏劑親水性差，生物利用度差，從而最大限度的減少了細(xì)胞膜黏附和滲透，并且由于單線態(tài)氧和自由基在生物微環(huán)境中的半衰期較短，光敏劑的靶點定位對于實現(xiàn)高效的光動力效應(yīng)至關(guān)重要。因此，開發(fā)不同的策略來提高光敏劑對各種病原體的溶解度/分散性和光動力功效。所以，急需開發(fā)無毒性、能夠模擬功能器官降低炎癥反應(yīng)并且有光子接收能力，能將激發(fā)能量轉(zhuǎn)移到光敏劑的聚合物基體材料用于增強(qiáng)光動力療法的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供一種負(fù)載光敏劑和表皮生長因子的水凝膠納米材料及其制備方法。

2、本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：一種負(fù)載光敏劑和表皮生長因子的水凝膠納米材料的制備方法，它包括以下步驟：

3、s1.制備水凝膠納米粒子nps：

4、將n-異丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺丙基三甲基氯化銨和n,n-亞甲基雙丙烯酰胺的混合水溶液、n-叔丁基丙烯酰胺的無水乙醇溶液加入到反應(yīng)瓶中，再加入表面活性劑和引發(fā)劑，氮氣氛圍下進(jìn)行反應(yīng)，所述反應(yīng)的溫度為50～65℃，反應(yīng)時間為4～8h，反應(yīng)混合液經(jīng)后處理得水凝膠納米粒子nps；

5、s2.負(fù)載光敏劑：

6、將光敏劑tpa-2py-c2負(fù)載在步驟s1制備的水凝膠納米粒子nps上，純化凍干后獲得aie-nps；

7、s3.制備aie-egf-nps納米粒子：

8、將步驟s2制備的aie-nps與表皮生長因子egf溶液混合攪拌共孵育10～14h，純化凍干后獲得aie-egf-nps納米粒子。

9、進(jìn)一步地，步驟s1中所述混合水溶液中n-異丙基丙烯酰胺的濃度為3～4.5mg/ml，甲基丙烯酰胺丙基三甲基氯化銨的濃度為0.35～0.45mg/ml，n,n-亞甲基雙丙烯酰胺的濃度為0.2～0.3mg/ml。

10、進(jìn)一步地，步驟s1中所述n-叔丁基丙烯酰胺的無水乙醇溶液中n-叔丁基丙烯酰胺的濃度為108～124mg/ml。

11、進(jìn)一步地，步驟s1中所述表面活性劑為十二烷基硫酸鈉，所述引發(fā)劑為過硫酸銨。

12、進(jìn)一步地，所述混合水溶液和n-叔丁基丙烯酰胺的無水乙醇溶液的體積比為45～55:1，所述表面活性劑和引發(fā)劑的總質(zhì)量與混合水溶液的體積比為1mg:1.5～2ml，所述表面活性劑和引發(fā)劑的質(zhì)量比為37.5～100:1。

13、進(jìn)一步地，步驟s1中所述后處理為將反應(yīng)混合液用mwco1400的透析袋在超純水中透析純化110～130h，透析液凍干后得到白色絮狀物為水凝膠納米粒子nps。

14、進(jìn)一步地，在加熱過程中向濃度為48～56mg/ml?4,4，-二甲酰三苯胺的乙醇溶液中加入化合物1-乙基-4-甲基碘化吡啶和四氫吡咯，化合物1-乙基-4-甲基碘化吡啶與4,4，-二甲酰三苯胺的乙醇溶液的質(zhì)量體積比為65～75mg/ml，四氫吡咯與4,4，-二甲酰三苯胺的乙醇溶液的體積比為2～3:1，將所得混合物在75～85℃下攪拌15～17h，所得產(chǎn)物為tpa-2py-c2。

15、更進(jìn)一步地，將濃度為800～1200μm的tpa-2py-c2溶液與步驟s1制備的水凝膠納米粒子nps混合后攪拌共孵育10～14h，孵育結(jié)束后用mwco1400的透析袋在超純水中透析純化68～75h，透析液凍干后得到橙色絮狀物為aie-nps，其中，所述水凝膠納米粒子nps與tpa-2py-c2溶液的質(zhì)量體積比為1～2mg:5ml。

16、進(jìn)一步地，步驟s3中所述表皮生長因子egf溶液的蛋白濃度為8～12μg/ml，aie-nps與表皮生長因子egf溶液的質(zhì)量體積比為30～40mg:1ml，孵育結(jié)束后用mwco1400的透析袋在超純水中透析純化22～26h，透析液凍干后得到絮狀物為aie-egf-nps。

17、上述方法制備的負(fù)載光敏劑和表皮生長因子的水凝膠納米材料。

18、本發(fā)明中，以較為疏水的單體n-叔丁基丙烯酰胺(tbam)和溫度響應(yīng)性單體n-異丙基丙烯酰胺(nipam)為主體，加入少量陽離子單體甲基丙烯酰胺丙基三甲基氯化銨(maptac)，交聯(lián)劑n,n-亞甲基雙丙烯酰胺(bis)，十二烷基硫酸鈉(sds)作為乳化劑，過硫酸銨(aps)作為引發(fā)劑，氮氣氛圍下進(jìn)行反應(yīng)，合成水凝膠納米粒子nps。其中，tbam作為疏水單元，提供疏水區(qū)域，nipam聚合物是一種常見的溫度響應(yīng)性材料，當(dāng)反應(yīng)溫度高于nipam聚合物的最低臨界溶解溫度(lcst)時，nipam聚合物發(fā)生卷球效應(yīng)，即聚合物鏈?zhǔn)湛s形成納米顆粒；陽離子單體maptac提供正電荷，增強(qiáng)聚合物的離子導(dǎo)電性和與細(xì)胞表面帶負(fù)電的革蘭氏菌的相互作用；bis即作為交聯(lián)劑增加聚合物的強(qiáng)度以及穩(wěn)定性。

19、整個體系的單體通過加聚反應(yīng)雙鍵打開形成新的自由基，繼續(xù)與其他單體反應(yīng)逐漸形成長鏈聚合物，并提升溫度發(fā)生卷球效應(yīng)，以獲得球形聚合物。tbam具有親水性可以增加聚合物的水溶性，并引入疏水性側(cè)鏈可以制備出具有良好保水性和機(jī)械強(qiáng)度的聚合物，同時引入了三個單鍵可以增加聚合物的靈活性和可加工性為后續(xù)負(fù)載光敏劑和表皮生長因子(egf)提供條件；為了使最終產(chǎn)品達(dá)到可注射以及靶向特點，本發(fā)明合成的是一種納米球形式的聚合物。

20、本發(fā)明水凝膠納米粒子nps的合成路線為：

21、

22、本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

23、(1)本發(fā)明產(chǎn)品通過改變水凝膠單體，提出了一種全新水凝膠納米粒子的制備配方，將帶有正電基團(tuán)的水凝膠單體引入水凝膠體系中，使水凝膠納米粒子通過靜電作用靶向到細(xì)胞表面帶負(fù)電的革蘭氏菌并緊密吸附，以達(dá)到靶向殺菌作用。

24、(2)本發(fā)明的水凝膠納米粒子aie-egf-nps的抗菌活性來源于光敏劑接受特定波長的光，吸收光子，使光敏劑分子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，產(chǎn)生活性氧(ros)對周圍生物分子產(chǎn)生氧化損傷，從而達(dá)到殺菌效果。該方式具有無創(chuàng)性、廣譜抗菌性和不會產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點。同時光動力療法可以實現(xiàn)精準(zhǔn)定位，通過選擇性的光照可以在特定的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行治療，減少對周圍組織的損傷。

25、(3)本發(fā)明的水凝膠納米粒子aie-egf-nps具有良好的細(xì)胞相容性及血液相容性，能有效減少體內(nèi)異物反應(yīng)，不會引起明顯的炎癥或免疫反應(yīng)。

26、(4)本發(fā)明的水凝膠納米粒子aie-egf-nps由于引入了表皮生長因子(egf)不僅可以達(dá)到高效殺菌的作用，還可以達(dá)到抗炎促進(jìn)傷口愈合的功能。

27、(5)納米級的粒徑尺度賦予了該抗菌水凝膠納米粒子的多種使用形式，可以以簡捷的噴霧形式給藥既解決了普通輔料所面臨的換藥困難的問題同時又不受傷口形狀的約束，還可以用于水凝膠的微創(chuàng)遞送，其優(yōu)勢在于水凝膠粒子的尺寸小于大多數(shù)針頭內(nèi)徑，小尺寸不僅使它們可以針狀注射，而且更有利于大面積和生物組織接觸，同時利于自然代謝清除，具有更強(qiáng)的組織穿透能力。水凝膠自身的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以阻止各種蛋白的侵入，使藥物分子免于被向水凝膠內(nèi)部侵入的酶降解，從而保持生物活性。

28、(6)本發(fā)明產(chǎn)品具有多重功效，相比于單純的抗菌材料，本發(fā)明產(chǎn)品具有更好的均一性和分散性，相比于傳統(tǒng)的傷口敷料，本產(chǎn)品具有更好的抗菌效果且可以促進(jìn)傷口愈合，防治傷口感染。本發(fā)明具有良好的生物相容性，在金黃色葡萄球菌感染的小鼠全層創(chuàng)面模型中，水凝膠納米粒子表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)傷口愈合的功能。此外，通過h&e染色對小鼠器官(肝，脾，腎，心臟和肺)進(jìn)行組織學(xué)分析，以研究水凝膠納米粒子的體內(nèi)毒理學(xué)。小鼠治療14天后，未觀察到異常作用和明顯的器官損傷，表明該水凝膠納米粒子是一種治療傷口愈合的安全療法。這些結(jié)果表明，該水凝膠納米粒子可以極大地促進(jìn)創(chuàng)面的愈合過程，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。