本發(fā)明涉及一種修飾的溶瘤腺病毒；包含其的藥物組合物；和使用其治療癌癥的方法。

背景技術：

1、在過去的十年期間，隨著免疫療法和刺激患者自身的免疫系統(tǒng)靶向和攻擊癌癥已經得到普及，對溶瘤病毒在癌癥治療中的作用的認識已經發(fā)生了顯著的變化。在本世紀初，溶瘤病毒被認為是在癌癥治療中僅通過它們通過溶瘤作用溶解腫瘤細胞的固有能力而起作用的活性劑。近來，它們作為癌癥疫苗的用途已經受到關注，并且它們在溶瘤時從癌細胞中釋放腫瘤抗原以激活免疫系統(tǒng)的能力被認為是設計對抗癌癥的最終免疫療法中的重要特征。

2、腺病毒是在對抗感染性疾病的各種疫苗方法中通常用作載體的高免疫原性病毒。重要的是，它們具有出色的引發(fā)和加強免疫應答的能力。此外，腫瘤內溶瘤腺病毒的存在以及它所引起的免疫原性細胞死亡可能通過引起th1型免疫調節(jié)因子，如ifnγ的表達來使不利的腫瘤微環(huán)境朝向更易感的狀態(tài)發(fā)展而發(fā)生臨床相關的抗腫瘤免疫。然而，溶瘤腺病毒的免疫原性是一把雙刃劍；抗病毒免疫通常是如此壓倒性的，以至于它超越了針對由腫瘤表達的自身抗原而引發(fā)的弱得多的免疫應答。

3、肽疫苗在癌癥的免疫療法中一直是一個有吸引力的概念，但是傳統(tǒng)的肽疫苗方法的臨床功效一般被認為是不佳的。癌癥疫苗遞送癌癥抗原與佐劑的組合，所述佐劑應當提供必要的炎癥信號以發(fā)動抗腫瘤免疫應答。然而，中樞和外周耐受性以及在腫瘤進展時免疫編輯的過程通常會導致t細胞反應性的喪失，這在選擇用于肽疫苗的候選肽時在體外被觀察到。即使腫瘤表達所選的抗原，當前的疫苗佐劑也根本不夠強效而無法破壞免疫抑制的腫瘤中的耐受性。此外，許多肽疫苗方法是基于與結合mhc?i類的cd8+t細胞表位的精確的最小序列匹配的短肽。盡管在臨床前腫瘤模型中獲得了令人鼓舞的結果，但是短肽已經被證實會引起患者的全身性外周耐受性，推測這是由于肽被缺乏重要的共刺激信號的非專職性apc或未成熟的dc提呈所致。

4、本發(fā)明以這樣的方式結合了上述兩種疫苗方法，所述方式利用了這兩者的優(yōu)點。將溶瘤腺病毒和癌癥抗原組合的物理實體解決了以下問題：a)對于免疫細胞，病毒特異性靶標壓倒性地強而沒有充足的腫瘤特異性靶標；b)佐劑弱的問題；和c)短肽疫苗引發(fā)中樞耐受性的問題。因此，本發(fā)明涉及肽包被的條件復制型腺病毒(pepticrad)，它是以下兩種臨床證明的癌癥免疫療法以創(chuàng)新且獨特的方式相結合：溶瘤腺病毒和肽疫苗。pepticrad使用免疫原性病毒作為腫瘤特異性肽的活性載體以引導免疫系統(tǒng)特異性地靶向并殺死癌細胞。此外，與遺傳編碼腫瘤抗原的溶瘤病毒疫苗相反，用免疫原性肽包被腺病毒使得pepticrad技術高度適應于所有癌癥；可以使用相同的載體病毒來治療所有癌癥并且只需通過用不同的多聚賴氨酸延伸肽包被所述病毒即可進行適應。這種獨特的技術利用了腺病毒的顯著的免疫原性并且同時將cd8+t細胞應答引導到腫瘤組織。

技術實現(xiàn)思路

1、根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供了一種修飾的腺病毒或載體，其包含：

2、以下多肽中的至少一種，所述多肽共價或非共價連接到病毒衣殼上，而并非由所述腺病毒載體遺傳編碼：

3、i)vfgielmevdpighlyifat[seq?id?no:1]mage-a3?161-180；

4、ii)ylampfatpmeaelarrsla[seq?id?no:2]ny-eso-1?91-110；

5、iii)rgpesrllefylampfatpm[seq?id?no:3]ny-eso-1?81-100；或

6、iv)與其至少60％同一的多肽。

7、在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述腺病毒能夠在靶細胞中復制并且具有溶解活性。

8、還更優(yōu)選地，部分iv)的所述多肽與部分1)或部分ii)或部分iii)的多肽具有61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

9、有利的是，所述多肽可以在受試者中刺激肽特異性免疫應答，并且還更有利的是，由于所述多肽并非由所述腺病毒載體遺傳編碼，而是已經共價或非共價連接到衣殼上，因此這種連接可以快速且有效地執(zhí)行，即無需等待在宿主細胞中病毒復制發(fā)生。通常，為了促進至少一種或兩種或三種多肽的連接，使用至少4個，理想地5個、6個、7個、8個或9個賴氨酸將所述一種或多種多肽進行多聚賴氨酸延伸。最通常，使用6個或9個賴氨酸并且最優(yōu)選地連接在多肽的氨基末端處。

10、因此，連接到腺病毒上的肽是：

11、kkkk(kkkkk)-vfgielmevdpighlyifat[seq?id?no:7]；和/或

12、kkkk(kkkkk)-ylampfatpmeaelarrsla[seq?id?no:8]；和/或

13、kkkk(kkkkk)-rgpesrllefylampfatpm[seq?id?no:9]；或者是：

14、kkkkkk-vfgielmevdpighlyifat[seq?id?no:4]；和/或

15、kkkkkk-ylampfatpmeaelarrsla[seq?id?no:5]；和/或

16、kkkkkk-rgpesrllefylampfatpm[seq?id?no:6]。

17、在本發(fā)明的又一個優(yōu)選的實施方案中，所述腺病毒可以是腺病毒科(adenoviridae)中的任何類型和物種，例如不限于人類腺病毒，但是最通常是人類腺病毒。最有利的是，所述腺病毒能夠復制和殺死癌細胞，同時將抗病毒免疫應答轉向腫瘤，因此所述修飾的腺病毒或載體是復制型的并且具有溶瘤作用。

18、可以使本發(fā)明中使用的腺病毒或載體在復制方面具有腫瘤特異性，例如，所述腺病毒載體可以在e1、e3、e4和/或l3基因中包含修飾，如腫瘤特異性啟動子的插入、基因缺失和轉基因的插入。

19、理想地，所述腺病毒或載體具有溶瘤作用，即能夠通過相對于正常細胞在腫瘤細胞中選擇性復制而感染和殺死癌細胞。

20、所述腺病毒或載體的骨架可以是任何血清型。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述腺病毒或載體骨架的血清型選自血清3型或血清5型。如本文所用的“腺病毒血清5型(ad5)核酸骨架”指的是ad5的基因組并且“腺病毒血清3型(ad3)核酸骨架”指的是ad3的基因組。

21、此外，所述病毒或載體可以是嵌合的，例如ad5/3、ad3/5或ad5/35載體。例如，“ad5/3載體”指的是具有ad5載體和ad3載體這兩者的部分的嵌合病毒或載體。

22、腺病毒或載體的“衣殼”指的是病毒的蛋白質殼。衣殼由幾個低聚結構亞基組成，所述亞基由被稱作原聚體的蛋白質制成。

23、最優(yōu)選地，所述腺病毒或載體是血清5型，選擇它是因為它對于引發(fā)和加強t細胞應答是最佳的；它觸發(fā)殺死腫瘤所需的cd8+t細胞；針對溶瘤病毒的任何預先存在的免疫都可以增強腫瘤內治療的功效并且它具有良好的臨床安全性記錄。

24、在本發(fā)明的再一個優(yōu)選的實施方案中，所述腺病毒或載體被進一步修飾以包括以下特征中的任一個或多個，包括其任何和所有組合。

25、ad5/3嵌合取代，即用血清3型腺病毒纖突結區(qū)置換血清5型腺病毒纖突結區(qū)；這允許所述病毒或載體規(guī)避ad5天然受體柯薩奇病毒-腺病毒受體(car)，而改為使用ad3天然受體橋粒芯蛋白2(dsg2)進行內化。dsg2大量存在于癌細胞中。

26、腺病毒感染是從借助于病毒表面上的特化蛋白識別宿主細胞受體開始的，所述特化蛋白即腺病毒纖突蛋白，特別是腺病毒纖突蛋白的球形羧基末端結構域，被稱作羧基末端突結結構域。因此，在本文中提到腺病毒纖突蛋白的突結時，指的是腺病毒纖突蛋白的球形羧基末端結構域。

27、e1a基因缺失，其中缺失是編碼氨基酸122-129(ltcheacf)的核苷酸；這種缺失是一種安全措施，這是因為病毒或載體e1a蛋白不能與成視網膜細胞瘤(rb)分子結合并且從rb釋放轉錄因子e2f進行病毒基因轉錄。因此，腺病毒或載體依賴于宿主細胞中游離e2f的存在并且可以在分裂的正常細胞或癌細胞中復制它的基因組，在這些細胞中游離e2f持續(xù)可用。因此，所述修飾相對地保護了非分裂細胞并且靶向分裂細胞或癌細胞。

28、e3基因的部分缺失，鑒于這種基因產物的免疫抑制作用，這會增強免疫原性。理想地，14.7k基因部分缺失或全部缺失。

29、在一個優(yōu)選的實施方案中，所述修飾的腺病毒或載體包含編碼共刺激分子的至少一個轉基因的插入，并且理想地，包含兩個轉基因的插入，其中所述基因之一引起先天免疫系統(tǒng)的激活，而另一個引起適應性免疫系統(tǒng)的激活。優(yōu)選的轉基因包括通過使用apc驅動cd8+t細胞應答來激活先天免疫系統(tǒng)的cd40l和通過增加cd8+t細胞的克隆擴增、存活以及大的記憶t細胞池的形成來激活適應性免疫系統(tǒng)的ox40l。

30、許多轉基因可以被置于腺病毒或載體的不同位置處。一個轉基因可以例如被置于部分或全部缺失的e3區(qū)域中，處于e3啟動子或外源性啟動子下；或被置于部分或全部缺失的e1區(qū)域中，處于e1啟動子或外源性啟動子下；或被置于部分或全部缺失的l3區(qū)域中，處于l3啟動子或外源性啟動子下。

31、最優(yōu)選地，ox40l，理想地是人類ox40l，位于e3b區(qū)域中，替代了基因14.7k缺失。

32、同樣最優(yōu)選地，cd40l，理想地是人類cd40l，被插入病毒的晚期區(qū)域中，特別是晚期區(qū)域3(l3)中，理想地處于23k基因下游。

33、在一個優(yōu)選的實施方案中，這兩個轉基因都被插入到所述病毒中，即ox40l和cd40l。

34、在替代方案中，可以使用已知的遺傳工程技術，如使用內部核糖體進入位點(ires)或更優(yōu)選地通過使用自切割2a肽，將編碼ox40l的dna和編碼cd40l的dna連接并且作為融合分子插入，所述自切割2a肽具有尺寸小并且在2a肽上游和下游的基因之間具有高切割效率的優(yōu)勢。通常，cd40l被插入到緊鄰ox40l的下游，但是有可能使用相反的構型來實施本發(fā)明。

35、本發(fā)明中利用的病毒或載體還可以包含除上述以外的其它修飾?？梢匀芜x地使用任何另外的組分或修飾，但是對于本發(fā)明不是必須的。

36、由上文可知，本發(fā)明的腺病毒或載體已經被工程化以刺激對抗癌癥的免疫應答，特別是在其中通常，免疫系統(tǒng)受到由癌細胞利用的逃避機制的損害的腫瘤環(huán)境中。

37、驚人的是，我們的數(shù)據(jù)表明，當與骨架病毒ad5/3d24或具有替代缺失的gp19k/7.1k基因的例如人類gm-csf的免疫刺激性轉基因的病毒相比時，將免疫刺激性轉基因人類ox40l和人類cd40l添加到14.7k基因座中不會損害本發(fā)明的病毒的溶瘤功效。這是驚人的，因為由于所述轉基因的尺寸和所述轉基因對受感染細胞的直接作用，因此所述轉基因可能會顯著影響病毒復制。此外，14.7k基因的缺失沒有像gp19k/7.1k基因的缺失那樣被廣泛地研究，并且因此可能會對病毒的復制機制產生出乎意料的后果，特別是在將轉基因摻入14.7k缺失位點中的情況下。

38、我們還證實了本技術的病毒能夠從14.7k基因座產生有功能的人類轉基因。這是出乎意料的，因為我們有點不尋常地使用了在兩個轉基因之間具有病毒2a加工位點的轉錄盒。

39、此外，我們證實了本發(fā)明的病毒能夠引發(fā)mage-a3和ny-eso-1特異性免疫應答。

40、因此，本發(fā)明延伸到一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的至少一種修飾的腺病毒或載體和合適的載劑。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述藥物組合物被配制用于腫瘤內、肌內、動脈內、靜脈內、胸膜內、囊內、腔內或腹膜注射或口服施用。

41、因此，在又一個方面，本發(fā)明涉及一種在個體中治療癌癥的方法，所述方法包括向所述個體施用有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的腺病毒或載體。

42、另外地或可選地，本發(fā)明涉及至少一種根據(jù)本發(fā)明的腺病毒或載體或組合物，其用于治療癌癥。

43、另外地或可選地，本發(fā)明涉及至少一種根據(jù)本發(fā)明的腺病毒或載體或組合物用于治療癌癥的用途。

44、另外地或可選地，本發(fā)明涉及至少一種根據(jù)本發(fā)明的腺病毒或載體用于制造用于治療癌癥的藥物的用途。

45、鑒于腫瘤已經進化出若干種免疫抑制機制來抵消身體的免疫細胞，本發(fā)明的療法還結合使用檢查點分子來實施。最佳表征的檢查點途徑是細胞毒性t淋巴細胞蛋白4(ctla-4)和程序性細胞死亡蛋白1途徑(pd-1/pd-l1)。因此，本發(fā)明的腺病毒或載體可以與諸如抗pd1分子、抗pd-l1分子或抗ctla-4分子的檢查點調節(jié)劑組合使用以抵消免疫抑制性腫瘤環(huán)境并且引起強烈的抗免疫應答。

46、修飾的腺病毒或載體用作活性佐劑，這是因為它提供了針對靶肽的最佳免疫應答所需的危險信號，而且在復制型腺病毒或載體的情況下，它保留了它溶解它所感染的癌細胞并且在其中復制它的基因組的能力。溶瘤細胞殺傷在性質上是免疫原性的，其引起腫瘤微環(huán)境的變化，所述變化可能會增強對肽/腫瘤的免疫應答。因此，當與單獨的肽疫苗或溶瘤疫苗相比時，使用我們的修飾的腺病毒與長肽(20個氨基酸，不含多聚賴氨酸尾)物理復合產生了優(yōu)越的抗腫瘤免疫應答。

47、最優(yōu)選地，本文提到的癌癥包括以下癌癥中的任一種或多種：鼻咽癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎癌、結締組織癌、黑色素瘤、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、腦癌、喉癌、口腔癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、絨毛膜癌、胃泌素瘤、嗜鉻細胞瘤、泌乳素瘤、t細胞白血病/淋巴瘤、神經瘤、希林二氏病(von?hippel-lindau?disease)、卓艾二氏綜合征(zollinger-ellison?syndrome)、腎上腺癌、肛門癌、膽管癌、膀胱癌、輸尿管癌、少突膠質細胞瘤、成神經細胞瘤、腦膜瘤、脊髓腫瘤、骨軟骨瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤(ewing's?sarcoma)、原發(fā)部位未知的癌癥、類癌、胃腸道類癌、纖維肉瘤、乳腺癌、佩吉特氏病(paget's?disease)、宮頸癌、癌癥、食道癌、膽囊癌、頭癌、眼癌、頸癌、腎癌、腎母細胞瘤(wilms'tumor)、肝癌、卡波西氏肉瘤(kaposi's?sarcoma)、前列腺癌、睪丸癌、霍奇金氏病(hodgkin's?disease)、非霍奇金氏淋巴瘤、皮膚癌、間皮瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌、內分泌胰腺癌、胰高血糖素瘤、甲狀旁腺癌、陰莖癌、垂體癌、軟組織肉瘤、成視網膜細胞瘤、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲狀腺癌、滋養(yǎng)細胞癌、葡萄胎、子宮癌、子宮內膜癌、陰道癌、外陰癌、聽神經瘤、蕈樣真菌病、胰島素瘤、類癌綜合征、生長抑素瘤、牙齦癌、心臟癌、唇癌、腦膜癌、口腔癌、神經癌、上腭癌、腮腺癌、腹膜癌、咽癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌和扁桃體癌。

48、在所附的權利要求書和本發(fā)明的先前描述中，除非上下文由于表達語言或必要的暗示而另外需要，否則詞語“包含(comprises)”或諸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的變體以包括性意義使用，即用于指定所述特征的存在，但不排除在本發(fā)明的各種實施方案中存在或添加另外的特征。

49、本說明書中引用的所有參考文獻，包括任何專利或專利申請，在此以引用的方式并入本文。不承認任何參考文獻構成了現(xiàn)有技術。此外，不承認任何現(xiàn)有技術構成了本領域公知常識的一部分。

50、本發(fā)明的每一個方面的優(yōu)選特征可以結合任何其它方面來描述。

51、根據(jù)以下實施例，本發(fā)明的其它特征將變得顯而易見。一般來說，本發(fā)明延伸到本說明書(包括所附權利要求書和附圖)中公開的特征中的任何新穎的特征或任何新穎的組合。因此，結合本發(fā)明的特定方面、實施方案或實施例描述的特征、整數(shù)、特性、化合物或化學部分應當被理解為適用于本文所述的任何其它方面、實施方案或實施例，除非與其不相容。

52、此外，除非另外說明，否則本文公開的任何特征可以被用于相同或相似目的的替代特征代替。

53、在本說明書的整個說明和權利要求書中，除非上下文另外要求，否則單數(shù)形式包括復數(shù)形式。特別是，在使用不定冠詞的情況下，除非上下文另外要求，否則本說明書應當被理解為考慮復數(shù)以及單數(shù)。