本發(fā)明涉及一種rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體鼻用原位凝膠及其制備方法和應用，屬于醫(yī)藥領域。

背景技術：

1、帕金森病(pakinson’s?disease,pd)也常被稱為“震顫麻痹”，是一種神經系統(tǒng)退行性疾病。這個疾病的主要原因是由于黑質多巴胺能神經元的退化和死亡，與遺傳、環(huán)境因素及神經系統(tǒng)老化等多種因素有關。已成為繼腫瘤、心腦血管病后，嚴重危害老年人健康的疾病。pd屬于中樞神經系統(tǒng)疾病，但血腦屏障的存在限制了大多數(shù)藥物入腦發(fā)揮療效。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，藥物鼻腔給藥后可避開血腦屏障沿嗅通路和三叉神經通路直接轉運入腦，為藥物治療pd提供了新的遞送策略。然而，鼻纖毛的快速清除和鼻黏膜的低通透性極大降低了鼻內藥物傳遞。此外，藥物經鼻入腦后分布無選擇性，難以在黑質多巴胺能神經元蓄積，且易損傷正常腦組織。

2、雷公藤紅素(celastrol,clt)是從雷公藤屬植物中分離得到的五環(huán)三萜類單體化合物，研究發(fā)現(xiàn)clt除了具有抗炎和抗氧化活性外，還具有顯著的神經保護功能。但clt水溶性差、生物利用度低，容易產生全身性毒副作用等問題，極大地限制了其臨床應用。

3、本發(fā)明以clt為模型藥物，以多肽rvg29修飾雷公藤紅素得到的傳遞體(rvg29-tfs)載入脫乙酰結冷膠(dgg)，得到凝膠制劑，通過鼻腔給藥途徑，凝膠制劑黏附于鼻嗅區(qū)黏膜表面，可增加難溶性藥物溶解度，提高藥物生物利用度，并減緩鼻腔的清除，同時可高效的實現(xiàn)主動靶向入胞，提高“鼻-腦”轉運效率。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于，提供一種rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體鼻用原位凝膠及其制備方法和應用。制備得到的rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體鼻用原位凝膠可增加難溶性藥物溶解度，提高藥物生物利用度，且可響應鼻粘液的陽離子環(huán)境發(fā)生相變，黏附于鼻黏膜表面，延長傳遞體的鼻腔滯留時間。隨后，傳遞體從凝膠中擴散并借助自身的膜融合作用和變形穿透作用跨膜入腦，進而在rvg29靶向肽的介導下，被多巴胺能神經元高效攝取發(fā)揮藥效。

2、本發(fā)明的技術方案：

3、一種rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體鼻用原位凝膠，所述鼻用原位凝膠是由rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體和脫乙酰結冷膠溶液制備而成；

4、所述rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體是由雷公藤紅素2.5-4.5份、大豆磷脂30-70份、膽固醇6-20份、mpeg2000-dspe?5-15份、mpeg2000-dspe-rvg29?10-28份和脫氧膽酸鈉4-12份制成；

5、所述脫乙酰結冷膠溶液的濃度為0.6-1.4％，溶劑為蒸餾水；

6、所述rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體和脫乙酰結冷膠溶液的體積比為0.8-1.2:0.8-1.2。

7、前述鼻用原位凝膠是由rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體和脫乙酰結冷膠溶液制備而成；

8、前述rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體是由雷公藤紅素3-4份、大豆磷脂40-60份、膽固醇10-15份、mpeg2000-dspe?8-12份、mpeg2000-dspe-rvg29?15-20份和脫氧膽酸鈉6-10份制成；

9、前述脫乙酰結冷膠溶液的濃度為0.8-1.2％，溶劑為蒸餾水；

10、前述rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體和脫乙酰結冷膠溶液的體積比為0.9-1.1:0.9-1.1。

11、具體的說，前述鼻用原位凝膠是由rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體和脫乙酰結冷膠溶液制備而成；

12、具體的說，前述rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體是由雷公藤紅素3.5份、大豆磷脂50份、膽固醇13份、mpeg2000-dspe?10份、mpeg2000-dspe-rvg29?18份和脫氧膽酸鈉8份制成；

13、具體的說，前述脫乙酰結冷膠溶液的濃度為1.0％，溶劑為蒸餾水；

14、具體的說，前述rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體和脫乙酰結冷膠溶液的體積比為1:1。

15、前述的rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體鼻用原位凝膠的制備方法按照以下具體步驟進行：

16、(1)脂質薄膜的制備：按照比例稱取2.5-4.5mg雷公藤紅素、30-70mg大豆磷脂、6-20mg膽固醇、5-15mg?mpeg2000-dspe、10-28mg?mpeg2000-dspe-rvg29和4-12mg脫氧膽酸鈉溶于3-7ml二氯甲烷，在35-39℃水浴下，30rpm旋轉蒸發(fā)除去二氯甲烷后，得到均勻的脂質薄膜；

17、(2)rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體的制備：取脂質薄膜加入5-15ml蒸餾水，于50-70℃恒溫振蕩器100rpm條件下水化20-40min，按照每超聲3-7s，暫停3-7s的方法進行冰浴超聲2-4min，超聲功率為300w，即得rvg29-clt-tfs；

18、(3)脫乙酰結冷膠溶液的制備：取0.6-1.4g的脫乙酰結冷膠粉末置于燒杯中，加入100ml的蒸餾水，稱重，85-95℃恒溫磁力攪拌1.5-2.5h使其完全溶解，冷卻至室溫，補足蒸餾后，密封，置于3-5℃冰箱充分溶脹22-26h，得脫乙酰結冷膠溶液；

19、(4)rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體鼻用原位凝膠的制備：將rvg29-clt-tfs與脫乙酰結冷膠溶液按體積比0.8-1.2:0.8-1.2混合，100rpm攪拌均勻，得橙黃色的rvg29-clt-tfs/dgg，即得rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體鼻用原位凝膠成品。

20、前述制備方法按照以下具體步驟進行：

21、(1)脂質薄膜的制備：按照比例稱取3-4mg雷公藤紅素、40-60mg大豆磷脂、10-15mg膽固醇、8-12mg?mpeg2000-dspe、15-20mg?mpeg2000-dspe-rvg29和6-10mg脫氧膽酸鈉溶于4-6ml二氯甲烷，在36-38℃水浴下，30rpm旋轉蒸發(fā)除去二氯甲烷后，得到均勻的脂質薄膜；

22、(2)rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體的制備：取脂質薄膜加入8-12ml蒸餾水，于55-65℃恒溫振蕩器100rpm條件下水化25-35min，按照每超聲4-6s，暫停4-6s的方法進行冰浴超聲2.5-3.5min，超聲功率為300w，即得rvg29-clt-tfs；

23、(3)脫乙酰結冷膠溶液的制備：取0.8-1.2g的脫乙酰結冷膠粉末置于燒杯中，加入100ml的蒸餾水，稱重，90℃恒溫磁力攪拌2h使其完全溶解，冷卻至室溫，補足蒸餾后，密封，置于4℃冰箱充分溶脹24h，得脫乙酰結冷膠溶液；

24、(4)rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體鼻用原位凝膠的制備：將rvg29-clt-tfs與脫乙酰結冷膠溶液按體積比0.9-1.1:0.9-1.1混合，100rpm攪拌均勻，得橙黃色的rvg29-clt-tfs/dgg，即得rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體鼻用原位凝膠成品。

25、具體的說，前述制備方法按照以下具體步驟進行：

26、(1)脂質薄膜的制備：按照比例稱取3.5mg雷公藤紅素、50mg大豆磷脂、13mg膽固醇、10mg?mpeg2000-dspe、18mg?mpeg2000-dspe-rvg29和8mg脫氧膽酸鈉溶于5ml二氯甲烷，在37℃水浴下，30rpm旋轉蒸發(fā)除去二氯甲烷后，得到均勻的脂質薄膜；

27、(2)rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體的制備：取脂質薄膜加入10ml蒸餾水，于60℃恒溫振蕩器100rpm條件下水化30min，按照每超聲5s，暫停5s的方法進行冰浴超聲3min，超聲功率為300w，即得rvg29-clt-tfs；

28、(3)脫乙酰結冷膠溶液的制備：取1.0g的脫乙酰結冷膠粉末置于燒杯中，加入100ml的蒸餾水，稱重，90℃恒溫磁力攪拌2h使其完全溶解，冷卻至室溫，補足蒸餾后，密封，置于4℃冰箱充分溶脹24h，得脫乙酰結冷膠溶液；

29、(4)rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體鼻用原位凝膠的制備：將rvg29-clt-tfs與脫乙酰結冷膠溶液按體積比1:1混合，100rpm攪拌均勻，得橙黃色的rvg29-clt-tfs/dgg，即得rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體鼻用原位凝膠成品。

30、前述的rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體鼻用原位凝膠在制備治療帕金森藥物中的應用。

31、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

32、1.rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體可增加難溶性藥物溶解度，提高藥物生物利用度，傳遞體的包封率和載藥量分別為94.22±0.21％和2.31±0.25％。

33、2.rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體鼻用原位凝膠的黏度小，能更好地流入鼻腔，進入鼻腔后，rvg29-tfs為水性制劑，在鼻腔易流失,脫乙酰結冷膠(deacetylated?gellangum，dgg)為典型的離子敏感型原位凝膠基質，可響應鼻腔環(huán)境中的陽離子na+、ka+、ca2+發(fā)生相變，由溶液狀轉變?yōu)槟z狀，使得凝膠有效吸附于鼻黏膜上，從而延長藥物的經鼻入腦的吸收時間，減緩鼻腔清除。

34、3.由狂犬病毒糖蛋白衍生得到的具有29個氨基酸序列的多肽rvg29，可與achr特異性識別結合。多肽rvg29修飾的傳遞體(rvg29-tfs)借助自身的高度變形性和滲透性經鼻入腦，并在rvg29肽的介導下，實現(xiàn)多巴胺能神經元的主動鼻腔腦靶向作用。

35、4.凝膠強度居于25-50s之間，既可抵抗鼻纖毛的清除，保護凝膠完整性的同時，實現(xiàn)藥物在鼻腔中特定吸收部位的持續(xù)釋放。

36、5.水分保持能力都高于85％，這種優(yōu)良的水分保持能力能夠保持凝膠在儲存或受到外力作用時的穩(wěn)定性。

37、6.凝膠ph值都介于5.5-7.0，而人體鼻腔粘液的ph值通常在5.5-7.0，可減少對鼻腔黏膜的刺激性，適合于鼻腔用藥。

38、綜上所述，本發(fā)明研發(fā)的rvg29肽修飾雷公藤紅素傳遞體鼻用原位凝膠可增加難溶性藥物溶解度，提高藥物生物利用度，減緩鼻腔的清除。能與多巴胺能神經元高表達乙酰膽堿受體(acetylcholine?receptor，achr)特異性識別的rvg29肽修飾于傳遞體表面，可有效實現(xiàn)高效主動靶向入胞，提高載體在鼻腔的滯留時間，增加吸收時間和吸收量，提高“鼻-腦”轉運效率，針對治療帕金森疾病。