本發(fā)明涉及生物材料，尤其涉及crgd靶向肽修飾的內皮祖細胞來源仿生納米囊泡的制備方法。

背景技術：

1、血管新生是創(chuàng)面愈合的必要環(huán)節(jié)。然而，糖尿病創(chuàng)面的內皮細胞功能障礙，導致血管新生減少，是其不愈合的關鍵因素。內皮祖細胞epcs，亦稱為內皮前體細胞，具有強大的旁分泌能力。此前認為，epcs主要通過分泌趨化因子和細胞因子調節(jié)內皮細胞功能。近年研究發(fā)現(xiàn)，epcs還能通過分泌納米囊泡改善內皮細胞功能，加速糖尿病創(chuàng)面血管新生，可以作為糖尿病創(chuàng)面修復的潛在手段。

2、然而，這類由細胞分泌的天然外泌體在轉化應用時存在明顯缺陷。一是天然外泌體大多產量極低且不穩(wěn)定，據(jù)報道，基于超高速離心的策略僅能從每毫升細胞上清中收獲1-10μg的納米囊泡。二是天然外泌體分離和純化步驟繁瑣、成本高且周期長。三是天然外泌體性能不穩(wěn)定，親本細胞經多次傳代后所分泌的納米囊泡表型和功能可能發(fā)生顯著改變，降低治療潛力。因此，急需解決。

3、上述內容僅用于輔助理解本發(fā)明的技術方案，并不代表承認上述內容是最接近的現(xiàn)有技術。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術問題是提供crgd靶向肽修飾的內皮祖細胞來源仿生納米囊泡的制備方法，該方法提供了一種新穎的具有促血管生成、抗氧化和抗菌的生物遞送系統(tǒng)，提升了治療糖尿病的創(chuàng)面效果。

2、為達到所述目的，本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的，crgd靶向肽修飾的內皮祖細胞來源仿生納米囊泡的制備方法，制備方法包括以下步驟：

3、s1、制備epc-nv；

4、s11、進行epcs細胞分離、培養(yǎng)、鑒定，

5、s12、進行epcs-nvs的制備，

6、s13、進行epc-nvs的crgd修飾與鑒定；

7、s2、制備adm-fe3+@pa/gelma水凝膠：

8、s21、在ph值等于10的環(huán)境中以1：3的摩爾比合成fe3+@原兒茶醛(protocatechualdehyde，pa)溶液；

9、s22、將合車的fe3+@原兒茶醛溶液與adm混合，進行多次離心洗滌后加入配置好的光固化明膠(gelma)前體溶液；

10、s23、通過超聲空化使搭載fe3+@pa的adm均勻分散；

11、s24、通過416nm藍光光照以及adm自組裝形成雙交聯(lián)水凝膠。

12、優(yōu)選的，所述步驟s11中的epcs細胞分離、培養(yǎng)和鑒定包括從大鼠骨髓細胞懸液中分離出epcs，進行原代細胞培養(yǎng)以及傳代。

13、優(yōu)選的，所述步驟s12中進行epcs-nvs的制備過程包括：

14、s12a.用含去外泌體血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)原代epcs，并收集細胞上清，采用超速離心法提取epcs的天然外泌體；

15、s12b.將500-1000萬/ml的epcs懸液依次通過擠壓器的10μm、5μm、1μm孔膜，去除細胞碎片后，獲取細胞囊泡懸液，再將懸液進行超速離心，獲取epc-nvs。

16、優(yōu)選的，所述s13中進行epc-nvs的crgd修飾的過程包括：

17、s13a.將deepc-nvs懸浮液與crgd膠束溶液共孵育，尺寸排阻色譜法對crgd修飾的epc-nvs進行純化，獲得crgd@deepc-nvs；

18、s13b.crgd@deepc-nvs的鑒定：進行epcs天然外泌體與epc-nvs的鑒定及比較：透射電子顯微鏡(transmission?electron?microscopy,tem)觀察兩種囊泡的形態(tài)和大小；納米流式(nanoparticle?tracking?analysis,nta)和動態(tài)光散射(dynamic?lightscattering,dls)檢測兩種囊泡的粒徑大小和分布；western-blot檢測兩種囊泡的特異性膜蛋白，如cd9、cd63和cd81；運用zeta電位檢測膜電位。

19、本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

20、(1)本發(fā)明通過擠壓的方法制備的內皮祖細胞來源的仿生納米囊泡，可以作為ev模擬物，將epc內容物輸送到傷口。此外，本發(fā)明將crgd靶向肽偶聯(lián)到epc-nv表面，可以實現(xiàn)對內皮細胞(endothelial?cells,ecs)的主動靶向。此外，還提供了一種雙重水凝膠網絡，將fe3+@pa絡合物修飾的adm與光固化明膠(gelma)結合，以富集和緩釋mepc-nv。該水凝膠網絡具有抗氧化和抗菌性能，在糖尿病創(chuàng)面中可以降低活性氧水平并且抑制細菌感染，彌補了epc-nv功能的不足。

21、(2)本發(fā)明根據(jù)糖尿病創(chuàng)面細胞攝取能力低、種類復雜的特點，構建了攝取增強、靶向增強的定制化mepc-nv，首次將crgd靶向肽應用到糖尿病創(chuàng)面上，提升了治療效果。

22、(3)本發(fā)明構建了adm-fe3+-mnv@pa/gelma靶向遞送系統(tǒng)來協(xié)同治療，增強了糖尿病創(chuàng)面的治療效果。

23、(4)本發(fā)明采用擠壓法可在相同細胞量條件下獲得相對天然外泌體5-100倍的囊泡粒子或蛋白量得率，并避免了繁瑣的細胞擴增和上清液濃縮等步驟。其次，由于產量的大幅提高，獲得等量的納米囊泡無需親本細胞多次傳代，保證了仿生納米囊泡的性能穩(wěn)定性。

技術特征：

1.crgd靶向肽修飾的內皮祖細胞來源仿生納米囊泡的制備方法，其特征在于，制備方法包括以下步驟：

2.根據(jù)權利要求1所述的crgd靶向肽修飾的內皮祖細胞來源仿生納米囊泡的制備方法，其特征在于，所述步驟s11中的epcs細胞分離、培養(yǎng)和鑒定包括：從大鼠骨髓細胞懸液中分離出epcs，進行原代細胞培養(yǎng)以及傳代。

3.根據(jù)權利要求2所述的crgd靶向肽修飾的內皮祖細胞來源仿生納米囊泡的制備方法，其特征在于，所述步驟s12中進行epcs-nvs的制備過程包括：

4.根據(jù)權利要求3所述的crgd靶向肽修飾的內皮祖細胞來源仿生納米囊泡的制備方法，其特征在于，所述s13中進行epc-nvs的crgd修飾的過程包括：

技術總結
本發(fā)明涉及生物材料技術領域，尤其涉及cRGD靶向肽修飾的內皮祖細胞來源仿生納米囊泡的制備方法。制備方法包括以下步驟：S1、制備EPC?NV；S11、進行EPCs細胞分離、培養(yǎng)、鑒定，S12、進行EPCs?NVs的制備，S13、進行EPC?NVs的cRGD修飾與鑒定；S2、制備ADM?Fe<supgt;3+</supgt;@PA/Ge?lma水凝膠：S21、在pH值等于10的環(huán)境中以1：3的摩爾比合成Fe<supgt;3+</supgt;@原兒茶醛溶液；S22、將合車的Fe<supgt;3+</supgt;@原兒茶醛溶液與ADM混合，進行多次離心洗滌后加入配置好的光固化明膠(Ge?lmA)前體溶液；S23、通過超聲空化使搭載Fe<supgt;3+</supgt;@PA的ADM均勻分散；S24、通過416nm藍光光照以及ADM自組裝形成雙交聯(lián)水凝膠。該方法提供了一種新穎的具有促血管生成、抗氧化和抗菌的生物遞送系統(tǒng)，提升了治療糖尿病的創(chuàng)面效果。

技術研發(fā)人員：陳振兵,楊小凡,潘昕巖,劉碩媛,萬歸
受保護的技術使用者：華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/26