本發(fā)明涉及用于診斷cns疾病的熒光標記。

背景技術(shù)：

1、視網(wǎng)膜評估可以提供關(guān)于許多系統(tǒng)性疾病的存在和嚴重性的信息。例如，凋亡的視網(wǎng)膜細胞的檢測(darc)描述了一種監(jiān)測視網(wǎng)膜細胞死亡速率的技術(shù)，最近完成了診斷青光眼的i期臨床試驗(科爾迪羅等，2017年)，目前正在一系列神經(jīng)退行性疾病進行中的ii期臨床試驗，包括青光眼、與年齡有關(guān)的黃斑變性、視神經(jīng)炎和唐氏病(作為阿爾茨海默氏病的模型)。該技術(shù)目前包括靜脈內(nèi)施用一種稱為anx776的新型熒光劑，新型熒光劑包含內(nèi)源蛋白annexin?a5的改良版，其與近紅外熒光團dy-776熒光結(jié)合(科爾迪羅等，2017)。

2、darc利用眼睛的獨特光學特性，可以使用熒光標記的人膜聯(lián)蛋白v衍生物直接觀察患者的單神經(jīng)細胞凋亡。膜聯(lián)蛋白v是一種人蛋白，其具有在存在鈣的條件下與磷脂酰絲氨酸(ps)結(jié)合的能力。ps存在于每個細胞的質(zhì)膜中，但是，凋亡細胞在質(zhì)膜的外部小葉中表達ps。膜聯(lián)蛋白v與暴露的ps結(jié)合，從而識別細胞凋亡。

3、對于darc的i期和ii期臨床試驗，anx776均通過靜脈給藥。通過共聚焦掃描激光檢眼鏡(cslo)成像用于檢測視網(wǎng)膜疾病的其他熒光分子也主要通過靜脈注射給藥。例如，熒光素鈉和吲哚菁綠(icg)通常靜脈給藥以標記視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)，以識別與年齡相關(guān)性黃斑變性(amd)有關(guān)的異常血管生長(血管生成)和滲漏(約齊克等，2005)。

4、靜脈給藥的使用需要直接的醫(yī)學監(jiān)督，意味著除非懷疑可疑病理，否則不會對患者進行常規(guī)評估。因此，需要可用于評估視網(wǎng)膜的替代技術(shù)，以使患者能夠更廣泛地進行此類評估，并可能更早地診斷視網(wǎng)膜和神經(jīng)退行性疾病。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了視網(wǎng)膜完整性的熒光標記，用于診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)疾病，其中，熒光標記通過鼻內(nèi)給藥遞送。出人意料的是，本技術(shù)的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，鼻內(nèi)施用熒光標記導致視網(wǎng)膜中熒光的快速積累，視網(wǎng)膜成像的結(jié)果與先前靜脈施用相同熒光劑后獲得的結(jié)果相同。

2、不受理論的束縛，發(fā)明人相信，鼻內(nèi)遞送的視網(wǎng)膜完整性的熒光標記被系統(tǒng)吸收到循環(huán)中。由于局部給藥，視網(wǎng)膜完整性的熒光標記可能需要減少劑量，且與相同試劑的全身給藥相比起效更快。

3、如本說明書所用，視網(wǎng)膜完整性的熒光標記是指用于查詢視網(wǎng)膜細胞的健康和/或視網(wǎng)膜細胞和/或血管的完整性的熒光標記。例如，熒光標記可以識別和/或區(qū)分凋亡和壞死細胞，或識別血管滲漏或血管生成的區(qū)域。響應于激發(fā)，熒光標記發(fā)光且可以具有約400nm至約1000nm，優(yōu)選約500nm至約900nm的發(fā)射波長。

4、視網(wǎng)膜完整性的熒光標記優(yōu)選以適合局部遞送，尤其是鼻內(nèi)遞送的形式提供。視網(wǎng)膜完整性的熒光標記可以以藥物組合物的形式提供，可以以適合吸入的溶液、懸浮液或干粉形式提供。包含視網(wǎng)膜完整性的熒光標記的藥物組合物可以是無菌的，且可以包含一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑。合適的載體和賦形劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的，并且可以根據(jù)鼻內(nèi)遞送的預期途徑進行優(yōu)化。例如，包含視網(wǎng)膜完整性的熒光標記的組合物還可包含緩沖劑、粘合劑、防腐劑、增稠劑或抗氧化劑，如海藻糖。

5、在本發(fā)明的一些實施例中，視網(wǎng)膜完整性的熒光標記可以是視網(wǎng)膜血管完整性的熒光標記。通常，熒光標記將進入視網(wǎng)膜血管并在其中循環(huán)，從而易于觀察到異常的血管生長(血管生成)和/或滲漏部位。

6、視網(wǎng)膜血管完整性的熒光標記可以具有約2kda或以下，或1kda或以下的分子量。在本發(fā)明的一些實施例中，視網(wǎng)膜血管完整性的熒光標記可具有約100da、或約1kda的分子量，優(yōu)選約300da至約800da的分子量。

7、用于本發(fā)明的合適的視網(wǎng)膜血管完整性的熒光標記包括熒光團，特別優(yōu)選的視網(wǎng)膜血管完整性的熒光標記包括熒光素鈉和吲哚菁綠(icg)。

8、如上所述，視網(wǎng)膜血管完整性的熒光標記將通過鼻內(nèi)給藥，且可以與相同標記靜脈內(nèi)給藥的劑量相同或更少的劑量來給藥。例如，熒光素鈉可以約50mg/ml至約500mg/ml的濃度鼻內(nèi)施用，優(yōu)選約50mg/ml至約200mg/ml的濃度。在本發(fā)明的一些實施例中，熒光素鈉可以約以100mg/ml濃度鼻內(nèi)施用?？梢砸詽舛葹榧s1mg/ml至約100mg/ml，優(yōu)選約25mg/ml至約100mg/ml鼻內(nèi)施用icg。在本發(fā)明的一些實施例中，icg可以約50mg/ml鼻內(nèi)施用。

9、在本發(fā)明的一些實施例中，視網(wǎng)膜完整性的熒光標記可以是視網(wǎng)膜細胞完整性的標記。通常，視網(wǎng)膜細胞完整性熒光標記包括熒光標簽和細胞凋亡、壞死、細胞活性、細胞應激或蛋白質(zhì)聚集中的一種或多種標記。

10、熒光標簽是指響應激發(fā)而發(fā)光的化合物或分子(如熒光團)，其可以選擇使用，因為信噪比提高，從而在遵守曝光安全標準的同時提高了圖像分辨率和靈敏度，避免光毒作用。優(yōu)選熒光標簽在給藥時幾乎不引起炎癥或不引起炎癥。熒光標簽可以具有紅外或近紅外范圍的波長。熒光標簽可以具有約400nm至約1000nm，優(yōu)選約500nm至約900nm，更優(yōu)選約700nm至約900nm的發(fā)射波長。

11、合適的熒光標簽包括熒光素鈉、吲哚菁綠(icg)、姜黃素、irdye700、irdye800、dy-776、dy-488和d-781中的一種或多種。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，熒光標簽是dy-776。

12、可以使用用于將熒光標簽與標記結(jié)合的標準技術(shù)來制備視網(wǎng)膜細胞完整性熒光標記。這樣的標記可以從眾所周知的來源獲得，例如dyomics。用于將標簽與標記結(jié)合的適當技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且可以由標簽的制造商提供。

13、凋亡標記是指使經(jīng)歷凋亡的細胞與活細胞區(qū)分開的標記。此外，標記優(yōu)選應能夠從壞死細胞中區(qū)分凋亡細胞。例如，可以是特異性結(jié)合凋亡細胞但不結(jié)合活細胞或壞死細胞的化合物或分子。例如，凋亡標記包括膜聯(lián)蛋白家族蛋白。膜聯(lián)蛋白是在陽離子存在下可逆地結(jié)合到細胞膜上的蛋白質(zhì)。特別地，膜聯(lián)蛋白在鈣存在的條件下能夠結(jié)合磷脂酰絲氨酸(ps)。ps存在于每個細胞的質(zhì)膜中，但是，凋亡細胞在質(zhì)膜的外部小葉中表達ps。膜聯(lián)蛋白與暴露的ps結(jié)合，從而識別細胞凋亡。可用于本發(fā)明的膜聯(lián)蛋白可以是天然的或重組的。蛋白質(zhì)可以是完整的，也可以是功能片段，也就是說，膜聯(lián)蛋白的片段或部分特異性結(jié)合與整個蛋白質(zhì)相同的分子。此外，可以使用此類蛋白質(zhì)的功能性衍生物。特別地，膜聯(lián)蛋白的功能片段或衍生物可以包括含有“膜聯(lián)蛋白重復”的分子，是在單個膜聯(lián)蛋白內(nèi)和家族成員之間均保守的約70個氨基酸的結(jié)構(gòu)域?？色@得多種膜聯(lián)蛋白，如美國專利申請公開號2006/0134001a中描述的膜聯(lián)蛋白。優(yōu)選的膜聯(lián)蛋白是膜聯(lián)蛋白5，其在本領(lǐng)域眾所周知的。其他可以使用的膜聯(lián)蛋白包括膜聯(lián)蛋白11、2和6。其他凋亡標記在本領(lǐng)域中是已知的，例如，包括突觸標簽素i的c2a結(jié)構(gòu)域、杜拉霉素、基于非肽的靛紅磺酰胺類似物，例如wc-ii-89和aposense、例如nst-732、ddc和ml-10(圣休伯特等，2009)。

14、在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，凋亡的標記是膜聯(lián)蛋白128(泰特等，2005)。膜聯(lián)蛋白128是膜聯(lián)蛋白5的變體，與野生型的區(qū)別在于兩個單氨基酸突變。膜聯(lián)蛋白128在n-末端包括一個暴露的硫醇基，從而提高了分子標簽(如熒光標記)的結(jié)合效率。

15、在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，視網(wǎng)膜細胞完整性熒光標記包括與dy-776結(jié)合的膜聯(lián)蛋白128，膜聯(lián)蛋白128和dy-776可以以1:1的熒光拉貝克標記比率結(jié)合。

16、壞死標記是指使經(jīng)歷壞死的細胞與活細胞、經(jīng)歷凋亡的細胞區(qū)分開的標記。例如，可以是特異性結(jié)合壞死細胞但不結(jié)合活細胞或凋亡細胞的化合物或分子。壞死的標記包括碘化丙啶(pi)，一種與核酸結(jié)合而幾乎沒有或沒有序列優(yōu)先性的嵌入劑。其他壞死標記在本領(lǐng)域中是已知的，包括焦磷酸鹽、抗肌球蛋白、葡糖酸鹽、金絲桃素及其衍生物，如金絲桃素一元羧酸和棕櫚酸，例如雙-酰肼-雙dtpa棕櫚酸。特別地，使用了99mtc-焦磷酸鹽、111-抗肌球蛋白、99mtc-葡萄糖酸鹽和亞甲基藍。

17、細胞活性的其他指示也可以用于鑒定凋亡或壞死的細胞。例如，可以觀察到線粒體功能的變化，可以將活性氧(ros)用作標記，可以將鈣離子用作標記。細胞活性的標記可以包括膜染料、線粒體染料、自噬染料、壞死染料和鈣流中的一種或多種。更特別地，細胞活性的標記可以包括fluo-3，n-(熒光素-5-硫代氨基甲酰基)-1,2-二十六烷?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、jc-1，雙發(fā)射jc-9、還原若丹明和羅米明、若丹明123和di-8-anepps中的一種或多種。細胞應激的標記可以包括脂質(zhì)過氧化、谷胱甘肽(gsh)或活性氧(ros)(如超氧化物、過氧自由基、過氧化氫，羥基和過亞硝酸鹽)中的一種或多種標記。

18、視網(wǎng)膜中的蛋白質(zhì)聚集可以發(fā)生在視網(wǎng)膜神經(jīng)元內(nèi)或周圍的細胞內(nèi)或細胞外，但是，通常發(fā)生在視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)之外。已知蛋白質(zhì)聚集體的存在與經(jīng)歷神經(jīng)變性的細胞相關(guān)。合適的蛋白質(zhì)聚集標記包括剛果紅、姜黃素或硫黃素s中的一種或多種。

19、如上所述，本發(fā)明提供了鼻內(nèi)遞送的視網(wǎng)膜完整性的熒光標記，用于診斷受試者的cns病癥。受試者優(yōu)選是哺乳動物，包括人，可以是兒科病人或老年患者?？梢酝ㄟ^分析視網(wǎng)膜完整性來識別cns病癥，參見wo2009/077750和wo2011/055121描述的方法。例如，視網(wǎng)膜完整性的熒光標記可用于通過標記凋亡和/或壞死細胞來顯示視網(wǎng)膜中細胞死亡的分布，根據(jù)分布可以區(qū)分具有不同凋亡和/或壞死活性模式的不同神經(jīng)退行性疾病。

20、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病可能是炎性的(如關(guān)節(jié)炎或肉芽腫)、傳染性的(如病毒、腦炎或細菌)、血管的(如血管生成、閉塞或代謝)，或退化性的(如青光眼、與年齡相關(guān)性黃斑變性(amd)、阿爾茨海默氏病或帕金森氏病)。在本發(fā)明的一些實施例中，cns病癥可以是神經(jīng)退行性疾病，尤其是眼神經(jīng)退行性疾病。術(shù)語“眼神經(jīng)退行性疾病”是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，是指由眼神經(jīng)元逐漸和進行性喪失引起的疾病，包括但不限于青光眼、amd、視神經(jīng)炎和糖尿病性視網(wǎng)膜病變。神經(jīng)退行性疾病包括帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓氏病和弗里德里希共濟失調(diào)。在本發(fā)明的一些實施例中，cns病癥可包括顱腦外傷、中風、腦癱(如由新生兒缺氧引起的腦癱)，和癌癥(包括腦瘤)。

21、本發(fā)明還提供了一種用于診斷cns疾病的方法，其包括向患者施用如本技術(shù)描述的視網(wǎng)膜完整性的熒光標記并生成患者視網(wǎng)膜的圖像，其中，視網(wǎng)膜完整性的熒光標記是鼻內(nèi)施用的。患者視網(wǎng)膜的圖像優(yōu)選在體內(nèi)產(chǎn)生，可以使用cslo成像獲得。圖像中熒光信號的存在或不存在可以指示cns疾病的存在或不存在，從而使臨床醫(yī)生能夠診斷疾病的存在或不存在。如果圖像中存在熒光信號，則熒光的位置和分布可以使臨床醫(yī)生區(qū)分中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的類型。例如，熒光信號可以指示血管生成或血管滲漏的部位?；蛘?，熒光信號可以指示凋亡和/或壞死細胞的分布模式和/或數(shù)量。

22、本發(fā)明診斷方法還可以用于監(jiān)測疾病的進展，例如，以評估治療的有效性或?qū)膊∵M行分期。可以將患者眼睛的第一個體內(nèi)圖像與同一患者眼睛的后一個體內(nèi)圖像進行比較，后一個體內(nèi)圖像是在第一個圖像后的幾天、幾周或幾個月內(nèi)拍攝的。熒光信號的變化可以指示疾病進展或有效的治療方法。例如，熒光信號的增加可能表明凋亡細胞數(shù)量增加，可能表明疾病進展?？梢愿鶕?jù)wo2011/055121的描述，對圖像進行分析。

23、在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含上述視網(wǎng)膜細胞完整性的標記，其中，藥物組合物包含與2kda或更小的化合物結(jié)合的膜聯(lián)蛋白或其功能性片段或衍生物，其中膜聯(lián)蛋白或其功能性片段或衍生物以至少5mg/ml的濃度存在。當膜聯(lián)蛋白以約2mg/ml或更高的濃度存在時，包含膜聯(lián)蛋白的組合物會遇到沉淀問題。但是，本技術(shù)的發(fā)明人已經(jīng)能夠解決該問題，以便提供包含濃度為至少5mg/ml的膜聯(lián)蛋白的組合物。在避光條件下，該組合物已證明在25℃下可穩(wěn)定儲存長達50天。不受理論的束縛，本技術(shù)的發(fā)明人相信，2kda或更小的化合物與膜聯(lián)蛋白的n-末端的結(jié)合可在空間上阻礙蛋白質(zhì)聚集。

24、結(jié)合可以是靜電的或共價的，化合物優(yōu)選與膜聯(lián)蛋白或其功能片段或衍生物的n-末端(即前30個氨基酸)結(jié)合。在本發(fā)明的一些實施例中，膜聯(lián)蛋白或其功能片段或衍生物可以約5mg/ml至約20mg/ml，優(yōu)選約5mg/ml至約10mg/ml的濃度存在。

25、化合物可以是有機化合物或無機化合物，且可以具有約100da至約2kda，優(yōu)選約200da至約1kda，更優(yōu)選約300da至約800da的尺寸。化合物可以是如上所述的熒光標記，或者可以是治療劑。合適的熒光標記可以選自熒光素鈉、吲哚菁綠(icg)、姜黃素、irdye700、irdye800、dy-776、dy-488和d-781中的一種或多種。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，熒光標記是dy-776。

26、在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，藥物組合物包含與dy776結(jié)合的膜聯(lián)蛋白128。出人意料的是，已經(jīng)評估了幾種濃縮視網(wǎng)膜細胞完整性的標記的方法，結(jié)果證明與dy776結(jié)合的膜聯(lián)蛋白128在高濃度下比膜聯(lián)蛋白5更穩(wěn)定。

27、藥物組合物優(yōu)選適合鼻內(nèi)給藥(如適合吸入的溶液、懸浮液或干粉)，且可以包含如上所述的合適的載體和/或賦形劑。藥物組合物可以是凍干粉的形式，且可以以適合吸入的干粉的形式給予患者?；蛘?，在施用前，可以將凍干粉再水化以形成懸浮液。