本發(fā)明涉及脆弱擬桿菌的應(yīng)用，特別是涉及抑制脆弱擬桿菌在制備防治功能性胃腸道疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：1、功能性胃腸病(functional?gastrointestinaldisorders，fgids)，又稱腸腦互動異常，是一組因動力紊亂、內(nèi)臟高敏感、黏膜免疫功能改變、腸道菌群改變、中樞神經(jīng)系統(tǒng)處理功能異常等因素引起的以腹痛、惡心嘔吐、腹瀉便秘、難以排出食物或糞便為特征的非器質(zhì)性消化道紊亂性疾病。臨床上，以功能性消化不良和腸易激綜合征多見。其中，功能性消化不良(functional?dyspepsia，fd)是指胃和十二指腸功能紊亂引起的癥狀，而無器質(zhì)性疾病的一組臨床綜合征。主要癥狀包括餐后飽脹、早飽感、上腹脹痛、噯氣、厭食、惡心等。發(fā)病機制尚未明確，可能與胃腸動力障礙、內(nèi)臟感覺過敏、胃底對事物的容受性舒張功能下降、精神和社會因素等有關(guān)。而腸易激綜合征(irritable?bowel?syndrome，ibs)是一種以腹痛或腹部不適伴隨排便習慣改變?yōu)樘卣鞫鵁o器質(zhì)性病變的常見功能性腸病，臨床上根據(jù)排便特點和糞便的性狀可分為腹瀉型、便秘型和混合型。發(fā)病機制尚未明確，目前認為是多因素多種發(fā)病機制共同作用的結(jié)果，包括胃腸動力學異常、內(nèi)臟感覺異常、腸道感染、胃腸激素、精神心理障礙等。2、越來越多的研究證實，腸道微生物群在fgids中發(fā)揮重要作用，是引起發(fā)病的重要因素之一。ibs患者和fd患者中小腸細菌過度生長(sibo)的發(fā)生率比健康對照要顯著增加。大約10％的ibs患者，癥狀可追溯到感染性腸胃炎發(fā)作導(dǎo)致微生物群結(jié)構(gòu)的持續(xù)改變。還有研究表明通過將ibs患者的糞便移植給無菌(gf)小鼠糞便后可改變動物的胃腸道轉(zhuǎn)運、內(nèi)臟超敏反應(yīng)和腸道通透性變。3、腸道微生物群是治療fgids的潛在靶點。目前大多數(shù)以微生物菌群為導(dǎo)向的治療策略(包括益生菌和合生元，益生元和飲食干預(yù)措施，抗生素以及最近的糞便微生物菌群移植(fmt))均未顯示出一致的結(jié)果。其中益生菌相關(guān)的臨床研究中所采用的菌種多以一代益生菌為主，因此效果更好、安全性更佳、耐受力更強的二代益生菌有必要被開發(fā)出來。技術(shù)實現(xiàn)思路1、針對上述問題，本發(fā)明提供了脆弱擬桿菌在改善和/或治療功能性胃腸道疾病中的應(yīng)用。2、為了更好地解決上述問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：3、第一方面4、本發(fā)明提供了脆弱擬桿菌在制備改善和/或治療功能性胃腸道疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述脆弱擬桿菌選自脆弱擬桿菌zy-312或脆弱擬桿菌nctc?9343，有效成分為脆弱擬桿菌的活菌、滅活菌或提取物；所述功能性胃腸道疾病為功能性消化不良。5、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述脆弱擬桿菌選自脆弱擬桿菌zy-312的活菌、脆弱擬桿菌zy-312的滅活菌、脆弱擬桿菌nctc?9343的活菌、脆弱擬桿菌nctc?9343的滅活菌、脆弱擬桿菌zy-312的提取物。6、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述脆弱擬桿菌選自脆弱擬桿菌zy-312的滅活菌、脆弱擬桿菌nctc?9343的滅活菌；優(yōu)選地，所述脆弱擬桿菌選自脆弱擬桿菌zy-312的滅活菌。7、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，滅活菌為形態(tài)完整的滅活菌和/或形態(tài)不完整的滅活菌。8、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，滅活菌是通過干熱、濕熱、過濾、有機溶劑、化學試劑、紫外或紅外射線、發(fā)酵、凍干、基因重組、基因修飾或改造的方法中的任意一種或多種滅活的。9、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，滅活菌為脆弱擬桿菌滅活菌粉。10、優(yōu)選地，所述脆弱擬桿菌滅活菌粉的制備方法如下：脆弱擬桿菌發(fā)酵培養(yǎng)并離心得菌體、氯化鈉水溶液洗滌菌體并離心得洗滌后的菌體、加入賦形劑重懸、滅活并離心得滅活菌泥、干燥。11、進一步優(yōu)選地，所述脆弱擬桿菌滅活菌粉的制備方法如下：12、(1)取脆弱擬桿菌發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，對發(fā)酵液進行離心，收集菌體；13、(2)按菌體與氯化鈉水溶液的重量體積比為1g:(10～30)ml加入氯化鈉水溶液洗滌、離心，得到洗滌后的菌體；14、(3)向洗滌后的菌體中加入第一賦形劑溶液混合重懸得到菌體溶液，再進行滅活處理，離心，收集滅活菌泥；15、(4)向步驟(3)獲得的滅活菌泥中加入第二賦形劑溶液，得滅活菌原液；16、(5)將步驟(4)獲得的滅活菌原液干燥至殘留水分低于5wt％，即得脆弱擬桿菌滅活菌粉。17、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟(1)中，發(fā)酵液的菌數(shù)達到108cfu/ml以上。18、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟(2)中，所述氯化鈉水溶液的質(zhì)量濃度為0.6-1.5wt％，優(yōu)選為0.65-1.2wt％，更優(yōu)選為0.8-1.0wt％，最優(yōu)選0.85-0.95wt％，例如為0.9wt％的氯化鈉水溶液。19、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟(3)的第一賦形劑與步驟(4)中的第二賦形劑相同或不同，彼此獨立地選自甘露醇、山梨醇、麥芽糊精、乳糖、氯化鈉、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、右旋糖酐、脯氨酸、賴氨酸、丙氨酸、酪蛋白、脫脂乳中的至少一種。20、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟(3)中，菌體與第一賦形劑溶液的重量體積比為1g:(5～40)ml。21、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟(3)和/或步驟(4)中，賦形劑的質(zhì)量分數(shù)為4～30wt％。22、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟(3)和/或步驟(4)中，賦形劑溶液選自氯化鈉水溶液；優(yōu)選地，賦形劑溶液選自生理鹽水，例如0.9wt％氯化鈉水溶液。23、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟(3)中，所述滅活處理的方法選自熱滅活、冷凍滅活或者化學滅活中的至少一種，優(yōu)選為熱滅活。24、示例性地，所述熱滅活的溫度為60～100℃，熱滅活的時間為10～60min。25、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟(4)中，加入第二賦形劑溶液使滅活菌原液的總重量與步驟(3)滅活前的菌體溶液重量一致。26、示例性地，所述第二賦形劑溶液與所述第一賦形劑溶液相同。27、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟(5)中，所述干燥的方式選自真空冷凍干燥、噴霧干燥，優(yōu)選為真空冷凍干燥。28、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述真空冷凍干燥的條件包括：冷凍溫度為-20～-40℃，冷凍時間為1～3小時，真空度為0.20～0.25mbar。29、示例性地，所述真空冷凍干燥的工藝包括：-40±2℃預(yù)凍1～3小時后，-20±2℃預(yù)凍0.5～1h，最后-40±2℃再冷凍0.5～2h，0.25mbar真空度下經(jīng)一次干燥、解析干燥制備成滅活菌粉。30、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述制備方法中，對所述離心的條件不做具體限定，只要能實現(xiàn)所需的離心效果即可，例如所述離心的轉(zhuǎn)速為10000～20000rpm。31、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，產(chǎn)品選自藥物組合物、食品、保健品或食品添加劑中的任意一種。32、優(yōu)選地，所述的藥物組合物含有藥學有效劑量的保藏編號為cgmcc?no.10685的滅活的脆弱擬桿菌zy-312菌粉。33、上述的藥物組合物中，藥物組合物的劑型為丸劑、片劑、顆粒劑、膠囊、散劑、混懸劑、口服液或灌腸劑等；優(yōu)選地，所述藥物組合物通過口服或灌腸的形式給藥。34、上述的藥物組合物的給藥周期為間歇給藥、周期性給藥、持續(xù)給藥或長期給藥。35、優(yōu)選地，所述脆弱擬桿菌zy-312的提取物中包含脆弱擬桿菌莢膜多糖a。36、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，脆弱擬桿菌zy-312的提取物的制備方法包括以下步驟：37、(i)將發(fā)酵培養(yǎng)后的脆弱擬桿菌菌液離心沉淀，加入純化水使菌體重懸，調(diào)節(jié)其ph至3.5，提取，離心，取上清，得到粗糖溶液；38、(ii)粗糖溶液經(jīng)10kd超濾膜超濾濃縮、除小分子雜質(zhì)，至電導(dǎo)率穩(wěn)定，收集回流液；39、(iii)回流液中加入等體積緩沖液轉(zhuǎn)鹽；deae?sepharose?fast?flow離子交換柱層析，流速20ml/min，梯度洗脫25個柱體積，分段收集，100ml/瓶(組分)，sec-hplc跟蹤監(jiān)測，合并206nm吸收峰為單一、對稱峰的組分，10kd超濾膜超濾，加入純化水反復(fù)超濾，至電導(dǎo)率穩(wěn)定，收集回流液，凍干，得到脆弱擬桿菌提取物。40、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟(i)中，按菌體沉淀與純化水的重量比為1g:6g加入純化水使菌體重懸；41、和/或，100℃提取1.5h。42、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟(iii)中，緩沖液為40mmol/l?tris-hcl(ph8.5)；43、和/或，洗脫液為20mmol/l?tris-hcl(ph8.5，含0.2mol/l?nacl)。44、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，脆弱擬桿菌zy-312的提取物的制備方法包括以下步驟：45、(i)將發(fā)酵培養(yǎng)后的脆弱擬桿菌菌液離心沉淀，按菌體沉淀與純化水的重量比為1g:6g加入純化水使菌體重懸，用1mol/l鹽酸溶液調(diào)節(jié)其ph至3.5，100℃提取1.5h，冷卻至室溫，12000g常溫離心10min，取上清，得到粗糖溶液；46、(ii)粗糖溶液經(jīng)10kd超濾膜超濾濃縮、除小分子雜質(zhì)，至電導(dǎo)率穩(wěn)定，收集回流液；47、(iii)回流液中加入等體積40mmol/l?tris-hcl(ph8.5)轉(zhuǎn)鹽；deae?sepharosefast?flow離子交換柱層析(16mm×200mm)，流速20ml/min，20mmol/l?tris-hcl(ph8.5，含0.2mol/l?nacl)梯度洗脫25個柱體積，分段收集，100ml/瓶(組分)，sec-hplc跟蹤監(jiān)測，合并206nm吸收峰為單一、對稱峰的組分，10kd超濾膜超濾，加入純化水反復(fù)超濾，至電導(dǎo)率穩(wěn)定，收集回流液，凍干，得到脆弱擬桿菌提取物。48、第二方面49、本發(fā)明提供了脆弱擬桿菌在制備改善和/或治療功能性胃腸道疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述脆弱擬桿菌選自脆弱擬桿菌zy-312或脆弱擬桿菌nctc?9343，有效成分為脆弱擬桿菌的滅活菌或裂解液；所述功能性胃腸道疾病為腸易激綜合征。50、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，腸易激綜合征包括腹瀉型腸易激綜合征和炎癥后腸易激綜合征。51、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述脆弱擬桿菌選自脆弱擬桿菌zy-312的滅活菌、脆弱擬桿菌nctc?9343的滅活菌、脆弱擬桿菌zy-312的裂解液；優(yōu)選地，所述脆弱擬桿菌選自脆弱擬桿菌zy-312的滅活菌。52、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，滅活菌為形態(tài)完整的滅活菌和/或形態(tài)不完整的滅活菌。53、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，滅活菌是通過干熱、濕熱、過濾、有機溶劑、化學試劑、紫外或紅外射線、發(fā)酵、凍干、基因重組、基因修飾或改造的方法中的任意一種或多種滅活的。54、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，滅活菌為脆弱擬桿菌滅活菌粉。55、優(yōu)選地，所述脆弱擬桿菌滅活菌粉的制備方法如下：脆弱擬桿菌發(fā)酵培養(yǎng)并離心得菌體、氯化鈉水溶液洗滌菌體并離心得洗滌后的菌體、加入賦形劑重懸、滅活并離心得滅活菌泥、干燥。56、進一步優(yōu)選地，所述脆弱擬桿菌滅活菌粉的制備方法如下：57、(1)取脆弱擬桿菌發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，對發(fā)酵液進行離心，收集菌體；58、(2)按菌體與氯化鈉水溶液的重量體積比為1g:(10～30)ml加入氯化鈉水溶液洗滌、離心，得到洗滌后的菌體；59、(3)向洗滌后的菌體中加入第一賦形劑溶液混合重懸得到菌體溶液，再進行滅活處理，離心，收集滅活菌泥；60、(4)向步驟(3)獲得的滅活菌泥中加入第二賦形劑溶液，得滅活菌原液；61、(5)將步驟(4)獲得的滅活菌原液干燥至殘留水分低于5wt％，即得脆弱擬桿菌滅活菌粉。62、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟(1)中，發(fā)酵液的菌數(shù)達到108cfu/ml以上。63、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟(2)中，所述氯化鈉水溶液的質(zhì)量濃度為0.6-1.5wt％，優(yōu)選為0.65-1.2wt％，更優(yōu)選為0.8-1.0wt％，最優(yōu)選0.85-0.95wt％，例如為0.9wt％的氯化鈉水溶液。64、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟(3)的第一賦形劑與步驟(4)中的第二賦形劑相同或不同，彼此獨立地選自甘露醇、山梨醇、麥芽糊精、乳糖、氯化鈉、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、右旋糖酐、脯氨酸、賴氨酸、丙氨酸、酪蛋白、脫脂乳中的至少一種。65、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟(3)中，菌體與第一賦形劑溶液的重量體積比為1g:(5～40)ml。66、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟(3)和/或步驟(4)中，賦形劑的質(zhì)量分數(shù)為4～30wt％。67、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟(3)和/或步驟(4)中，賦形劑溶液選自氯化鈉水溶液；優(yōu)選地，賦形劑溶液選自生理鹽水，例如0.9wt％氯化鈉水溶液。68、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟(3)中，所述滅活處理的方法選自熱滅活、冷凍滅活或者化學滅活中的至少一種，優(yōu)選為熱滅活。69、示例性地，所述熱滅活的溫度為60～100℃，熱滅活的時間為10～60min。70、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟(4)中，加入第二賦形劑溶液使滅活菌原液的總重量與步驟(3)滅活前的菌體溶液重量一致。71、示例性地，所述第二賦形劑溶液與所述第一賦形劑溶液相同。72、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟(5)中，所述干燥的方式選自真空冷凍干燥、噴霧干燥，優(yōu)選為真空冷凍干燥。73、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述真空冷凍干燥的條件包括：冷凍溫度為-20～-40℃，冷凍時間為1～3小時，真空度為0.20～0.25mbar。74、示例性地，所述真空冷凍干燥的工藝包括：-40±2℃預(yù)凍1～3小時后，-20±2℃預(yù)凍0.5～1h，最后-40±2℃再冷凍0.5～2h，0.25mbar真空度下經(jīng)一次干燥、解析干燥制備成滅活菌粉。75、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述制備方法中，對所述離心的條件不做具體限定，只要能實現(xiàn)所需的離心效果即可，例如所述離心的轉(zhuǎn)速為10000～20000rpm。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，產(chǎn)品可以是藥物組合物、食品、保健品或食品添加劑中的任意一種。76、優(yōu)選地，所述的藥物組合物含有藥學有效劑量的保藏編號為cgmcc?no.10685的滅活的脆弱擬桿菌zy-312菌粉。77、上述的藥物組合物中，藥物組合物的劑型為丸劑、片劑、顆粒劑、膠囊、散劑、混懸劑、口服液或灌腸劑等；優(yōu)選地，所述藥物組合物通過口服或灌腸的形式給藥。78、上述的藥物組合物，所述藥物組合物的給藥周期為間歇給藥、周期性給藥、持續(xù)給藥或長期給藥。79、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，脆弱擬桿菌zy-312的裂解液通過超聲破碎的方法制備。80、優(yōu)選地，脆弱擬桿菌zy-312的裂解液的制備方法包括以下步驟：81、(1)取脆弱擬桿菌發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，對發(fā)酵液進行離心，收集菌泥；82、(2)按菌泥與生理鹽水的重量比為1:(5～15)的比例加入生理鹽水攪拌重懸；83、(3)重懸后的菌液經(jīng)超聲儀裂解；84、(4)裂解后經(jīng)離心、過濾，即得裂解液。85、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟(3)中，裂解條件為裂解30min，on?10秒，off?10秒；86、和/或，步驟(4)中離心條件為6000rpm、10min、4℃。87、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：88、本發(fā)明通過不同的動物模型試驗證明，脆弱擬桿菌，特別是保藏編號為cgmccno.10685的脆弱擬桿菌zy-312以及脆弱擬桿菌nctc?9343的活菌、裂解液、滅活菌、提取物等具有改善和治療功能性胃腸道疾病，特別是功能性消化不良和腸易激綜合征的作用。對于功能性消化不良，脆弱擬桿菌可有效地改善功能性消化不良的體重減輕、厭食、內(nèi)臟感覺過敏和胃動力障。對于腸易激綜合征，脆弱擬桿菌可有效改善腹瀉癥狀，降低腸道敏感性。當前第1頁12當前第1頁12