本發(fā)明屬于水凝膠材料及其制備和應用領域，特別涉及一種海藻酸鈉/明膠可注射雙網絡水凝膠及其制備和應用。

背景技術：

組織、器官的損傷、功能障礙或喪失是人類面臨的主要健康危害之一，也是引起人類疾病和死亡的最主要原因，組織工程的出現(xiàn)為這一世界性難題帶來了新的解決方案。作為一門新興的跨學科領域，組織工程涉及細胞生物學、分子生物學、材料科學、臨床醫(yī)學、生物工程等諸多學科，通過將細胞生物學和材料學相結合，在體外或體內構建組織或器官，最終從根本上解決組織和器官的缺失等問題。

水凝膠是一種依靠物理或化學交聯(lián)作用形成的高度含水的高分子網絡，自從1960年由wichterle等人首次利用水凝膠作為隱形眼鏡后，水凝膠被廣泛研究應用于生物醫(yī)學領域。特別是近十年來隨著組織工程的研究受到越來越多的關注，水凝膠由于其高度含水、物理性質類似于細胞外基質(ecm)的特性,被作為支持細胞生長的三維組織工程支架而廣泛研究。

隨著人們生活水平的提高，對醫(yī)療手段的無痛、無疤、操作簡易的要求越來越高，因此可注射水凝膠作為一種新型的快速治療手段，能實現(xiàn)無痛無創(chuàng)手術，更是受到越來越多的重視并逐漸為人們青睞，成為未來生物醫(yī)用材料應用發(fā)展的重要方向之一。

光聚合作為一種新型的聚合方式在組織工程中也有廣泛應用，和傳統(tǒng)的聚合方法相比優(yōu)點很多：可在室溫或生理條件下進行，固化速度快(從不到一秒鐘到幾分鐘)；反應放出的熱量少；反應條件溫和，不會對細胞和組織造成損傷；通過光聚合可使聚合物前體水溶液原位形成水凝膠，故而可用來制備可注射水凝膠。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種海藻酸鈉/明膠可注射雙網絡水凝膠及其制備和應用，本發(fā)明的海藻酸鈉/明膠可注射雙網絡水凝膠可用于組織工程，該水凝膠的原材料選用海藻酸鈉和明膠，價格低廉，生物相容性好，可被生物體吸收降解；制備方法簡單，實施條件溫和，該水凝膠生物相容性好，機械性能優(yōu)。

本發(fā)明的一種海藻酸鈉/明膠可注射雙網絡水凝膠，所述水凝膠原料包括：酯化的醛基海藻酸鈉和氨基化明膠，其中酯化的醛基海藻酸鈉和氨基化明膠的質量比為0.75～1.5:1。

本發(fā)明的一種海藻酸鈉/明膠可注射雙網絡水凝膠的制備方法，包括：

將酯化醛基海藻酸鈉水溶液與氨基化明膠的水溶液混合，在37℃下交聯(lián)5-15min后，再進行紫外照射交聯(lián)，即得海藻酸鈉/明膠可注射雙網絡水凝膠。

所述酯化醛基海藻酸鈉水溶液與氨基化明膠的水溶液按體積比為1:1混合。

所述酯化醛基海藻酸鈉水溶液與氨基化明膠的水溶液混合為：兩種溶液由兩個注射器同時注射到同一針頭中混合。

所述酯化醛基海藻酸鈉水溶液的質量體積百分比濃度為20％-30％；氨基化明膠水溶液的質量體積百分比濃度為20％。

所述酯化醛基海藻酸鈉的制備具體為：(1)室溫避光條件下，將高碘酸鈉水溶液加入到海藻酸鈉的水溶液中，反應4～6h，透析，冷凍干燥，得到醛基化海藻酸鈉；其中高碘酸鈉與海藻酸鈉的摩爾比例為0.88～1：1；(2)在醛基化海藻酸鈉的乙磺酸mes緩沖液中，加入碳化二亞胺和羥基琥珀酰亞胺，室溫下避光活化30-45min，隨后加入甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯鹽酸鹽，室溫避光條件下反應過夜，透析，冷凍干燥，得到酯化醛基海藻酸鈉；其中醛基化海藻酸鈉上的羧基、碳化二亞胺、羥基琥珀酰亞胺和甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯的摩爾比為3：3：1：1.5。

所述步驟(1)中海藻酸鈉為中粘度580mpa.s海藻酸鈉，重均分子量約為144萬，g嵌段比例為40％。

所述步驟(2)中透析：透析袋截留分子量為14000da，透析的時間為2～3天。

所述步驟(2)中冷凍干燥為先在-80℃冷凍6h，然后放入真空冷凍干燥機中進行凍干。

所述氨基化明膠的制備方法包括：將乙二胺加入到明膠水溶液中，調節(jié)ph至5.0，加入水溶性碳二亞胺edc，37℃反應4～6h，透析，冷凍干燥，得到氨基化明膠；其中明膠與乙二胺的摩爾比為1：1；明膠與水溶性碳化二亞胺摩爾比為1：2。

所述明膠為牛明膠，凍力強度為150～180g，黏度3.5～4.3，重均分子量約為3.7萬。

上述氨基化明膠的制備方法中的透析為：透析袋截留分子量為3500da，透析的時間為2～3天；冷凍干燥為先在-80℃冷凍6h，然后放入真空冷凍干燥機中進行凍干。

紫外照射交聯(lián)中采用的紫外發(fā)生器為波長365nm，功率5mw/cm²的紫外燈，紫外照射交聯(lián)10～15min。

紫外照射交聯(lián)中采用光引發(fā)劑，采用的光引發(fā)劑在體系中的最終質量體積百分濃度為0.1％，優(yōu)選光引發(fā)劑為2-羥基-2-甲基-1-[4-(2-羥基乙氧基)苯基]-1-丙酮(i2959，sigma公司，上海，中國)。

本發(fā)明的一種海藻酸鈉/明膠可注射雙網絡水凝膠的應用，其特征在于：海藻酸鈉/明膠可注射雙網絡水凝膠應用于組織工程中的光交聯(lián)可注射水凝膠支架。

本發(fā)明提供的可用于組織工程的海藻酸鈉/明膠可注射雙網絡水凝膠的制備方法中，海藻酸鈉由naio4氧化相鄰羥基形成醛基，隨后甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯中的氨基與醛基化海藻酸中的羧基通過酰胺化反應形成酯化醛基海藻酸鈉。明膠在碳化二亞胺的存在下與乙二胺縮合形成氨基化明膠。當改性海藻酸鈉溶液與改性明膠溶液混合時，首先，改性海藻酸鈉中的醛基與改性明膠中氨基發(fā)生席夫堿反應形成水凝膠的第一層網絡。然后，改性海藻酸鈉中的甲基丙烯酸基團在光引發(fā)劑i2959的存在下利用365nm紫外引發(fā)交聯(lián)，形成水凝膠的第二層網絡。

本發(fā)明的雙組份形成雙交聯(lián)網絡水凝膠的設計可以使得實際操作中，兩種溶液由兩個注射器同時注射到同一針頭中混合使之發(fā)生席夫堿反應，在室溫下自發(fā)交聯(lián)形成凝膠。注射到所需組織部位，形成原位注射交聯(lián)。

本發(fā)明的雙組份形成雙交聯(lián)網絡水凝膠的設計可以使得最終得到的水凝膠具有較強的力學性能，實際測試中，溶脹平衡后的水凝膠具有2.5mpa的壓縮模量值。

本發(fā)明的雙組份形成雙交聯(lián)網絡水凝膠的設計使得水凝膠支架可以通過調節(jié)交聯(lián)密度達到可控的降解性能。

有益效果

(1)本發(fā)明中所選用的海藻酸鈉和明膠均是天然生物材料，無毒、無味、有很好的生物相容性，價格低廉、安全可靠，實際操作中，兩種溶液由兩個注射器同時注射到同一針頭中混合，通過光照形成雙網絡結構，操作簡單；

(2)本發(fā)明制備的雙網絡水凝膠易降解，機械性能好，有望應用于組織工程中的可注射水凝膠支架。

附圖說明

圖1是酯化醛基海藻酸鈉的制備原理圖；其中n≈7272；

圖2是氨基化明膠的制備原理圖；

圖3是雙交聯(lián)水凝膠的制備原理圖(a)和示意圖(b)；

圖4是雙交聯(lián)水凝膠的降解示意圖；

圖5是成纖維細胞在雙交聯(lián)水凝膠表面的細胞增殖情況；

圖6是測試雙網絡水凝膠對纖維膜的粘結強度的示意圖；

其中，附圖中的asa表示醛基海藻酸鈉，amsa表示酯化醛基海藻酸鈉，ag表示氨基化明膠。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。

實施例1

精確稱取3.96g海藻酸鈉溶解于400ml去離子水中形成均一溶液。將4.28g高碘酸鈉避光溶于適量的去離子水中，再將高碘酸鈉溶液避光逐滴加入均一的海藻酸鈉溶液中，并于常溫下避光反應4h。將產物裝入透析袋(截留分子量為14000)中透析3天，每4h換次水。將產物倒入平皿中于-80℃冰箱中預凍6h，隨后放入凍干機，冷凍干燥得到醛基化海藻酸鈉。

實施例2

精確稱取1.2g醛基化海藻酸鈉溶解于120mlmes緩沖液中形成均一的溶液。將1.1736g碳化二亞胺和0.23064g羥基琥珀酰亞胺溶于適量的mes緩沖液中，37℃條件下活化30～45min，再稱量0.4995甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯的mes溶液避光逐滴加入，并于常溫下避光反應過夜。將產物裝入透析袋(截留分子量為3500)中避光透析3天，每4h換次水。將產物倒入平皿中于-80℃冰箱中預凍6h，隨后放入凍干機，冷凍干燥得到酯化醛基化海藻酸鈉。

實施例3

精確稱取5g牛明膠溶于100ml的水溶液中，加入16ml乙二胺，調ph至5.0，加入0.66g水溶性碳二亞胺edc，37℃反應過夜。待冷卻至室溫后，將產物裝入透析袋(截留分子量為3500)透析3天，每4h換次水。將產物倒入平皿并在-80℃冰箱中預凍6h，隨后放入凍干機，獲得得到氨基化明膠。

實施例4

將酯化醛基海藻酸鈉(實施例2)配成濃度為30％的溶液。準確稱量氨基化明膠(實施例3)，用去離子水配成濃度為20％溶液。用2ml的針管取1ml胺基化明膠溶液，用2ml針管取1ml酯化醛基海藻酸鈉溶液，然后加入i2959光引發(fā)交聯(lián)劑，使其在體系中的最終質量體積百分濃度為0.1％。經一y型連接，將胺基化明膠溶液和酯化醛基海藻酸鈉溶液同時由一個針頭注射到48孔板中形成柱狀單網絡水凝膠。10min后，在365nm波長，5mw/cm²功率的紫外燈下照射10～15min，即得雙交聯(lián)網絡水凝膠。

實施例5

根據實施例4所示方法，制備圓柱形雙交聯(lián)水凝膠塊，室溫下在磷酸鹽緩沖液(ph＝7.4)中浸泡24h后，使用萬能材料試驗機(dejiedxll-20000)對水凝膠進行壓縮試驗，得出水凝膠的壓縮模量為2.5mpa。

實施例6

根據實施例4所示方法，制備圓柱形雙交聯(lián)水凝膠塊，室溫下浸泡在去離子中，定期取出冷凍干燥，稱重，計算得出降解曲線。如圖4所示，雙交聯(lián)水凝膠在最初一周降解掉40％的質量，第30天仍保持大約50％的質量。

實施例7

將酯化醛基海藻酸鈉(實施例2)和氨基化明膠(實施例3)在284nm紫外燈下輻照滅菌，根據是實施例4所示方法制備圓柱形雙交聯(lián)水凝膠。將成纖維細胞種植在水凝膠表面，細胞密度設定為10,000個/ml。培養(yǎng)預定時間后，通過mtt測試法來測試細胞活性。種植在孔板(tcp)的作為對照。如圖5所示，水凝膠中的天然材料能夠促進細胞的生長，證明了雙交聯(lián)水凝膠具有很好的生物相容性。

實施例8

將酯化醛基海藻酸(實施例2)配成濃度為30％的溶液。準確稱量氨基化明膠(實施例3)，用去離子水配成濃度為20％溶液。用2ml的針管取1ml胺基化明膠溶液，用2ml針管取1ml酯化醛基海藻酸鈉溶液，然后加入i2959光引發(fā)交聯(lián)劑使其在體系中的最終質量體積百分濃度為0.1％。經一y型連接，將胺基化明膠溶液和酯化醛基海藻酸鈉溶液同時由一個針頭注射到兩片1厘米長3厘米的pcl纖維膜中的1厘米×1厘米區(qū)域，靜置10min形成柱狀單網絡水凝膠，然后在365nm波長，5mw/cm2功率的紫外燈下照射10～15min，以確保該雙交聯(lián)網絡水凝膠粘結兩片纖維膜完成。經過拉伸測試(如圖6)可知，該雙網絡水凝膠對纖維膜的粘結強度可達到23.4kpa以上。以上結果表明該雙網絡水凝膠有潛力用于粘結腦膜等膜類組織。