本發(fā)明屬于組織工程骨支架材料領(lǐng)域，具體涉及一種以海藻酸鈉、殼聚糖為原料的具有搭載多種藥物功能的新型可塑性緩釋微球型支架材料及其制備方法。

背景技術(shù)：

隨著人們物質(zhì)生活水平提高，嚴(yán)重意外事故創(chuàng)傷、患者腫瘤切除、感染等因素所致的骨缺損的診治變得更加復(fù)雜。目前臨床上自體骨移植是最有效的方法，但自體骨的來(lái)源有限，其提取會(huì)對(duì)患者生理、心理造成二次傷害。因此同種異體骨以較好的骨傳導(dǎo)性成為目前臨床上最主要的骨移植材料，但在處理過(guò)程中，為了降低異體骨的免疫原性，除去了異體骨細(xì)胞成分因而使異體骨喪失了直接成骨活性，造成成骨能力下降及部分移植骨壞死的發(fā)生。

近年來(lái)，組織工程學(xué)通過(guò)種子細(xì)胞體外擴(kuò)增并復(fù)合于支架材料構(gòu)建有生物活性的骨移植物，彌補(bǔ)了單純異體骨無(wú)直接成骨活性的不足。但在骨移植過(guò)程中，新移植的組織工程骨與宿主相容性差，短期內(nèi)不能與宿主建立良好的血供關(guān)系，并且骨移植手術(shù)存在創(chuàng)口且骨缺損處存在感染或潛在感染幾率，血液中生物因子和藥物很難在移植組織工程骨內(nèi)部聚集并發(fā)揮作用，缺乏生物因子調(diào)節(jié)的組織工程骨成骨活性潛能不能完全發(fā)揮，潛在細(xì)菌的大量繁殖可引起移植組織工程骨的感染，導(dǎo)致移植失敗。

海藻酸鈉和殼聚糖是近年來(lái)在生物醫(yī)藥、組織工程領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用的天然生物高分子材料，具有生物相容性好、無(wú)毒可降解等優(yōu)良性能。海藻酸鈉與殼聚糖均為天然高分子多糖，殼聚糖的側(cè)鏈化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有大量游離的氨基，呈現(xiàn)為聚陽(yáng)離子性；海藻酸鈉的側(cè)鏈化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有大量游離的羧基，呈現(xiàn)聚陰離子性，二者通過(guò)正負(fù)電荷相互吸引可發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，生成的復(fù)合物即可用于制備負(fù)載藥物的緩釋微球，又可用于構(gòu)建組織工程骨的支架材料。

本發(fā)明首先利用兩種原料層層自組裝成負(fù)載藥物的緩釋微球結(jié)構(gòu)，又按一定質(zhì)量比例復(fù)合成疏松多孔海綿狀結(jié)構(gòu)，將緩釋微球結(jié)構(gòu)嵌入疏松多孔海綿狀結(jié)構(gòu)之中，在正負(fù)電荷的吸引下發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，制備得到具有搭載多種藥物功能的新型可塑性緩釋微球型支架材料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種以海藻酸鈉、殼聚糖為原料的具有搭載多種藥物功能的新型可塑性緩釋微球型支架材料及其制備方法。

本發(fā)明所述支架材料由緩釋微球和疏松多孔海綿狀結(jié)構(gòu)組成。緩釋微球?yàn)楹Ｔ逅徕c-殼聚糖多層復(fù)合緩釋微球的多層球結(jié)構(gòu)，核心球?yàn)楹Ｔ逅徕c，可以搭載一種以上的藥物，奇數(shù)層球殼為殼聚糖(如第一層、第三層球殼為殼聚糖)，偶數(shù)層球殼為海藻酸鈉(如第二層、第四層球殼為海藻酸鈉)，每一層球殼均可搭載相同或不同的藥物；疏松多孔海綿狀結(jié)構(gòu)是海藻酸鈉、殼聚糖通過(guò)正負(fù)離子交聯(lián)形成的，具有良好的內(nèi)部三維孔隙結(jié)構(gòu)。以上提到的藥物包括但不限于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)、成骨生長(zhǎng)肽、萬(wàn)古霉素(van)、頭孢氨芐(cef)等。海藻酸鈉側(cè)鏈羧基基團(tuán)帶負(fù)電，殼聚糖側(cè)鏈氨基基團(tuán)帶正電，通過(guò)正負(fù)電荷相互吸引發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)的原理，緩釋微球和疏松多孔海綿狀結(jié)構(gòu)間通過(guò)正負(fù)電荷的相互作用在不改變兩者原有結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上有機(jī)的結(jié)合在一起。

本發(fā)明所述的一種具有搭載多種藥物功能的新型可塑性緩釋微球型支架材料的制備方法，其步驟如下：

(1)制備殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液和緩釋微球：

(1.1)配置殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液：

取海藻酸鈉固體溶解于體積分?jǐn)?shù)1～2％的醋酸溶液(以下內(nèi)容如非特殊指明，均為無(wú)菌去離子水溶液)中，制備得到海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1～4％的海藻酸鈉醋酸溶液；

按殼聚糖與海藻酸鈉質(zhì)量比為1:1～1.5的比例，稱取殼聚糖固體溶解于上述海藻酸鈉醋酸溶液；再加入0.5～1mol/lnaoh溶液調(diào)ph＝5～5.5，制備得到殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液；

(1.2)制備緩釋微球：

(1.2.1)將海藻酸鈉溶解于無(wú)菌去離子水，制備得到海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)2～6％的海藻酸鈉溶液；將藥物溶解于無(wú)菌去離子水，制備得到藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)1～5％的藥物溶液；再將藥物溶液與海藻酸鈉溶液混合均勻，制備得到載藥或不載藥的海藻酸鈉溶液，藥物溶液與海藻酸鈉溶液的體積比為0～5：100(當(dāng)體積用量為0：100時(shí)，表示不載藥)；將氯化鈣溶于無(wú)菌去離子水，制備得到氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)10～20％的氯化鈣溶液；按載藥或不載藥的海藻酸鈉溶液與氯化鈣溶液體積比為1：1～3的比例，將海藻酸鈉溶液逐滴勻速滴入氯化鈣溶液中，200～300r/min勻速攪拌20～40min，過(guò)濾制備得到載藥或不載藥的核心微球；

(1.2.2)將殼聚糖溶解于體積分?jǐn)?shù)1～2％的醋酸溶液中，制備得到殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)1～2％的殼聚糖醋酸溶液；將藥物溶解于無(wú)菌去離子水，制備得到藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)1～5％的藥物溶液；再將藥物溶液與殼聚糖醋酸溶液混合均勻，制備得到載藥或不載藥的殼聚糖醋酸溶液，藥物溶液與殼聚糖醋酸溶液的體積比為0～5：100(當(dāng)體積用量為0：100時(shí)，表示不載藥)；將步驟(1.2.1)制備得到的載藥或不載藥的核心微球逐粒投入到載藥或不載藥的殼聚糖醋酸溶液中，載藥或不載藥的殼聚糖醋酸溶液的體積為投入核心微球總體積的1～3倍，500～800r/min勻速攪拌10～20min，過(guò)濾制備得到海藻酸鈉-殼聚糖單層核心球；

(1.2.3)將海藻酸鈉溶解于無(wú)菌去離子水，制備得到海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5～1％的海藻酸鈉溶液；將藥物溶解于無(wú)菌去離子水，制備得到藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)1～5％的藥物溶液；再將藥物溶液與海藻酸鈉溶液混合均勻，制備得到載藥或不載藥的海藻酸鈉溶液，藥物溶液與海藻酸鈉溶液的體積比為0～5：100(當(dāng)體積用量為0：100時(shí)，表示不載藥)；將步驟(1.2.2)制備得到的海藻酸鈉-殼聚糖單層核心球逐粒投入到載藥或不載藥的海藻酸鈉溶液中，載藥或不載藥的海藻酸鈉溶液的體積為投入單層核心球總體積的1～3倍，500～800r/min勻速攪拌2～4min，過(guò)濾，制備得到海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉二層微球；

(1.2.4)將殼聚糖溶解于體積分?jǐn)?shù)1～2％的醋酸溶液中，制備得到殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)1～2％的殼聚糖醋酸溶液；將藥物溶解于無(wú)菌去離子水，制備得到藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)1～5％的藥物溶液；再將藥物溶液與殼聚糖醋酸溶液混合均勻，制備得到載藥或不載藥的殼聚糖醋酸溶液，藥物溶液與殼聚糖醋酸溶液的體積比為0～5：100(當(dāng)體積用量為0：100時(shí)，表示不載藥)；將步驟(1.2.3)制備得到的海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉二層微球逐粒投入到載藥或不載藥的殼聚糖醋酸溶液中，載藥或不載藥的殼聚糖醋酸溶液的體積為投入二層微球總體積的1～3倍，500～800r/min勻速攪拌10～20min，過(guò)濾，制備得到海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉-殼聚糖三層微球；

重復(fù)步驟(1.2.3)和步驟(1.2.4)可依次制備得到多層緩釋微球，將制備得到的多層緩釋微球于-20～-30℃預(yù)凍12～24h，再于-60～-80℃凍干直至重量不再發(fā)生變化，即得緩釋微球成品；

(2)制備可塑性緩釋微球型支架材料：

按步驟(1.2)制備得到的緩釋微球成品與步驟(1.1)制備得到的殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液體積比為1：1～19的比例，將緩釋微球成品逐粒加入殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液，300～500r/min勻速攪拌10～30min至緩釋微球分布均勻后，倒入柱形或方形或其他形狀的模具中，-20～-30℃下預(yù)凍12～24h，后于-60～-80℃凍干18～32h，恢復(fù)至室溫再經(jīng)3％～5％(w/v)的氯化鈣溶液浸泡處理30min～2h后，-20～-30℃下預(yù)凍12～24h，再于-60～-80℃凍干直至重量不再發(fā)生變化，即可制備得到本發(fā)明所述的可塑性緩釋微球型支架材料。

本發(fā)明利用緩釋微球具有良好的生物相容性，優(yōu)秀的載藥及緩釋功能；殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液凍干后呈疏松多孔海綿狀結(jié)構(gòu)，具有良好的生物相容性、可控的生物降解性、特定的三維外形、優(yōu)化的內(nèi)部三維孔隙結(jié)構(gòu)，基本滿足作為組織工程骨支架材料所要求的物理特性；通過(guò)海藻酸鈉側(cè)鏈羧基基團(tuán)帶負(fù)電，殼聚糖側(cè)鏈氨基基團(tuán)帶正電，正負(fù)電荷相互吸引發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)的原理，將緩釋微球與海綿狀結(jié)構(gòu)通過(guò)正負(fù)電荷的相互作用在不改變兩者原有結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上有機(jī)的結(jié)合在了一起。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比優(yōu)點(diǎn)在于：

1)作為一種新型組織工程骨支架材料，除了滿足支架材料所要求的可控的生物降解性、特定的三維外形、優(yōu)化的內(nèi)部三維孔隙結(jié)構(gòu)等物理特性，還能夠搭載多種藥物，有助于組織工程骨早期移植壞死率的降低。

2)本發(fā)明使用的兩種天然高分子原料，具有一定的生物活性，抗菌性，促成骨活性。

3)作為一種新型組織工程骨支架材料，在凍干前為液態(tài)，具有一定的流動(dòng)性，凍干后的形態(tài)與凍干前入模具形態(tài)一致，因此具有很強(qiáng)的可塑性，即可批量生產(chǎn)，又可根據(jù)患者骨缺損的大小、形狀進(jìn)行個(gè)體化組織工程骨修復(fù)骨缺損的治療。

4)作為一種新型組織工程骨支架材料，原料種類少，制作工藝簡(jiǎn)單。無(wú)需有機(jī)溶劑，安全無(wú)污染，可操作性強(qiáng)，前景廣闊。兩種原料結(jié)合的原理為正負(fù)電荷互相吸引發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，對(duì)包裹的藥物沒(méi)有影響。緩釋微球結(jié)構(gòu)和海綿狀結(jié)構(gòu)結(jié)合的原理也為正負(fù)電荷互相吸引發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，連接緊密的同時(shí)又不影響二者原有結(jié)構(gòu)，最大限度的保證了緩釋微球結(jié)構(gòu)搭載緩釋藥物的功能和海綿狀結(jié)構(gòu)的物理特性。

5)本發(fā)明可以通過(guò)調(diào)整緩釋微球與海綿狀結(jié)構(gòu)的比例，來(lái)達(dá)到在一定范圍內(nèi)調(diào)整新型可塑性緩釋微球型支架材料搭載緩釋藥物的總藥量、瞬時(shí)藥物濃度、緩釋時(shí)間以及孔隙率、收縮率、溶脹度、降解速率等物理特性，可以根據(jù)需要制備得到搭載緩釋不同藥物的不同物理特性的個(gè)性化新型可塑性緩釋微球型支架材料。

附圖說(shuō)明

圖1：為新型可塑性緩釋微球型支架材料的圓柱體成品照片的俯視圖，主體為海綿狀結(jié)構(gòu)，箭頭指示的位置是支架材料中的緩釋微球結(jié)構(gòu)。

圖2：為新型可塑性緩釋微球型支架材料的圓柱體成品照片的側(cè)視圖，主體為海綿狀結(jié)構(gòu)，箭頭指示的位置是支架材料中的緩釋微球結(jié)構(gòu)。

圖3：為單一緩釋微球結(jié)構(gòu)(a)和新型可塑性緩釋微球型支架材料的掃描電鏡照片(b，其中虛線部分為緩釋微球結(jié)構(gòu)與疏松多孔海綿狀結(jié)構(gòu)結(jié)合部分大致的分界處，c為疏松多孔海綿狀結(jié)構(gòu)外表面部分，d為疏松多孔海綿狀結(jié)構(gòu)縱剖面結(jié)構(gòu)。)。

圖4：為新型可塑性緩釋微球型支架材料的紅外曲線(前后箭頭的指示分別為海藻酸鈉與殼聚糖特異性官能團(tuán)峰值，表明新型可塑性緩釋微球型支架材料由海藻酸鈉和殼聚糖組合制成)；

圖5：為新型可塑性緩釋微球型支架材料中緩釋微球不同組分比下的孔隙率(圖中percentage＝10％、20％、30％、40％分別對(duì)應(yīng)實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4)；

圖6：為新型可塑性緩釋微球型支架材料中緩釋微球不同組分比下的收縮率曲線(圖中percentage＝10％、20％、30％、40％分別對(duì)應(yīng)實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4)；

圖7：為新型可塑性緩釋微球型支架材料中緩釋微球不同組分比下的溶脹率曲線(圖中percentage＝10％、20％、30％、40％分別對(duì)應(yīng)實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4)；

圖8：為新型可塑性緩釋微球型支架材料中緩釋微球不同組分比下的降解速率曲線(圖中example1、2、3、4分別對(duì)應(yīng)實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4)；

圖9：為新型可塑性緩釋微球型支架材料的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果(圖中controlgroup對(duì)應(yīng)對(duì)照組，experimentalgroup對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)組)。

具體實(shí)施辦式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但是本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不僅限于此。

實(shí)施例1

(1)制備殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液和緩釋微球：

(1.1)配置殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液

量取1ml冰醋酸加入100ml的容量瓶無(wú)菌去離子水定容，制備得到體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液；稱取2g海藻酸鈉固體，加入100ml體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液中攪拌溶解，制備得到海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的海藻酸鈉醋酸溶液。稱取1.67g殼聚糖固體，加入100ml海藻酸鈉醋酸溶液攪拌溶解，滴加1mol/lnaoh溶液調(diào)ph＝5，制備得到100ml殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液。

(1.2)制備緩釋微球：

稱取4g海藻酸鈉固體溶解于96ml無(wú)菌去離子水溶液中制備得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的海藻酸鈉溶液；稱取15g氯化鈣固體溶解于85ml無(wú)菌去離子水溶液中制備得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％的氯化鈣溶液。量取20ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的海藻酸鈉溶液逐滴勻速滴入30ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％的氯化鈣溶液中，300r/min勻速攪拌30min，過(guò)濾，制備得到核心微球。

量取1ml冰醋酸加入100ml的容量瓶無(wú)菌去離子水定容，制備得到體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液；稱取1g殼聚糖固體，加入99ml體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液中攪拌溶解，制備得到殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的殼聚糖醋酸溶液。將制備得到的核心微球逐粒投入30ml殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的殼聚糖醋酸溶液，500r/min勻速攪拌10min，過(guò)濾，制備得到海藻酸鈉-殼聚糖單層核心球。

稱取0.5g海藻酸鈉固體溶解于99.5ml無(wú)菌去離子水溶液中制備得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％的海藻酸鈉溶液。將制備得到的海藻酸鈉-殼聚糖單層核心球逐粒投入30ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％海藻酸鈉溶液，500r/min勻速攪拌2min，過(guò)濾，制備得到海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉二層微球。

量取1ml冰醋酸加入100ml的容量瓶無(wú)菌去離子水定容，制備得到體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液；稱取1g殼聚糖固體，加入99ml體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液中攪拌溶解，制備得到殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的殼聚糖醋酸溶液。將制備得到的海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉二層微球逐粒投入30ml殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的殼聚糖醋酸溶液，500r/min勻速攪拌10min，過(guò)濾，制備得到海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉-殼聚糖三層微球。將制備得到海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉-殼聚糖三層微球于-20℃預(yù)凍24h，再于-80℃凍干直至重量不再發(fā)生變化，制備得到緩釋微球成品。

(2)制備可塑性緩釋微球型支架材料：

稱取3g氯化鈣固體溶解于97ml無(wú)菌去離子水溶液中制備得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％的氯化鈣溶液。

按步驟(1.2)制備得到的緩釋微球成品與步驟(1.1)制備得到的殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液體積比為1：9，將緩釋微球成品逐粒加入殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液，300r/min勻速攪拌15min至緩釋微球分布均勻后，取2ml倒入24孔板一板孔，-20℃下預(yù)凍24h，后于-80℃凍干24h，恢復(fù)室溫后質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％的氯化鈣溶液浸泡處理(液面沒(méi)過(guò)支架材料)1h后，-20℃下預(yù)凍24h，再于-80℃凍干直至重量不再發(fā)生變化，即可制備得到組分比為1:9的新型可塑性緩釋微球型支架材料，產(chǎn)物質(zhì)量為0.154±0.005g。

實(shí)施例2

(1)制備殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液和緩釋微球：

(1.1)配置殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液

量取1ml冰醋酸加入100ml的容量瓶無(wú)菌去離子水定容，制備得到體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液；稱取2g海藻酸鈉固體，加入100ml體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液中攪拌溶解，制備得到海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的海藻酸鈉醋酸溶液。稱取1.67g殼聚糖固體，加入100ml海藻酸鈉醋酸溶液攪拌溶解，滴加1mol/lnaoh溶液調(diào)ph＝5，制備得到100ml殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液。

(1.2)制備緩釋微球：

稱取4g海藻酸鈉固體溶解于96ml無(wú)菌去離子水溶液中制備得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的海藻酸鈉溶液稱?。?5g氯化鈣固體溶解于85ml無(wú)菌去離子水溶液中制備得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％的氯化鈣溶液。量取20ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的海藻酸鈉溶液逐滴勻速滴入30ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％的氯化鈣溶液中，300r/min勻速攪拌30min，過(guò)濾，制備得到核心微球。

量取1ml冰醋酸加入100ml的容量瓶無(wú)菌去離子水定容，制備得到體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液；稱取1g殼聚糖固體，加入99ml體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液中攪拌溶解，制備得到殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的殼聚糖醋酸溶液。將制備得到的核心微球逐粒投入30ml殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的殼聚糖醋酸溶液，500r/min勻速攪拌10min，過(guò)濾，制備得到海藻酸鈉-殼聚糖單層核心球。

稱取0.5g海藻酸鈉固體溶解于99.5ml無(wú)菌去離子水溶液中制備得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％的海藻酸鈉溶液。將制備得到的海藻酸鈉-殼聚糖單層核心球逐粒投入30ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％海藻酸鈉溶液，500r/min勻速攪拌2min，過(guò)濾，制備得到海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉二層微球。

量取1ml冰醋酸加入100ml的容量瓶無(wú)菌去離子水定容，制備得到體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液；稱取1g殼聚糖固體，加入99ml體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液中攪拌溶解，制備得到殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的殼聚糖醋酸溶液。將制備得到的海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉二層微球逐粒投入30ml殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的殼聚糖醋酸溶液，500r/min勻速攪拌10min，過(guò)濾，制備得到海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉-殼聚糖三層微球。將制備得到海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉-殼聚糖三層微球于-20℃預(yù)凍24h，再于-80℃凍干直至重量不再發(fā)生變化，制備得到緩釋微球成品。

(2)制備可塑性緩釋微球型支架材料：

稱取3g氯化鈣固體溶解于97ml無(wú)菌去離子水溶液中制備得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％的氯化鈣溶液。按步驟(1.2)制備得到的緩釋微球成品與步驟(1.1)制備得到的殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液體積比為2:8，將緩釋微球成品逐粒加入殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液，300r/min勻速攪拌15min至緩釋微球分布均勻后，取2ml倒入24孔板一板孔，-20℃下預(yù)凍24h，后于-80℃凍干24h，恢復(fù)室溫后經(jīng)3％(w/v)的氯化鈣溶液浸泡處理(液面沒(méi)過(guò)支架材料)1h后，-20℃下預(yù)凍24h，再于-80℃凍干直至重量不再發(fā)生變化，即可制備得到組分比為2:8的新型可塑性緩釋微球型支架材料，產(chǎn)物質(zhì)量為0.159±0.003g。

實(shí)施例3：

(1)制備殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液和緩釋微球：

(1.1)配置殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液

量取1ml冰醋酸加入100ml的容量瓶無(wú)菌去離子水定容，制備得到體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液；稱取2g海藻酸鈉固體，加入100ml體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液中攪拌溶解，制備得到海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的海藻酸鈉醋酸溶液。稱取1.67g殼聚糖固體，加入100ml海藻酸鈉醋酸溶液攪拌溶解，滴加1mol/lnaoh溶液調(diào)ph＝5，制備得到100ml殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液。

(1.2)制備緩釋微球：

稱取4g海藻酸鈉固體溶解于96ml無(wú)菌去離子水溶液中制備得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的海藻酸鈉溶液稱??；15g氯化鈣固體溶解于85ml無(wú)菌去離子水溶液中制備得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％的氯化鈣溶液。量取20ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的海藻酸鈉溶液逐滴勻速滴入30ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％的氯化鈣溶液中，300r/min勻速攪拌30min，過(guò)濾，制備得到核心微球。

量取1ml冰醋酸加入100ml的容量瓶無(wú)菌去離子水定容，制備得到體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液；稱取1g殼聚糖固體，加入99ml體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液中攪拌溶解，制備得到殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的殼聚糖醋酸溶液。將制備得到的核心微球逐粒投入30ml殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的殼聚糖醋酸溶液，500r/min勻速攪拌10min，過(guò)濾，制備得到海藻酸鈉-殼聚糖單層核心球。

稱取0.5g海藻酸鈉固體溶解于99.5ml無(wú)菌去離子水溶液中制備得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％的海藻酸鈉溶液。將制備得到的海藻酸鈉-殼聚糖單層核心球逐粒投入30ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％海藻酸鈉溶液，500r/min勻速攪拌2min，過(guò)濾，制備得到海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉二層微球。

量取1ml冰醋酸加入100ml的容量瓶無(wú)菌去離子水定容，制備得到體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液；稱取1g殼聚糖固體，加入99ml體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液中攪拌溶解，制備得到殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的殼聚糖醋酸溶液。將制備得到的海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉二層微球逐粒投入30ml殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的殼聚糖醋酸溶液，500r/min勻速攪拌10min，過(guò)濾，制備得到海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉-殼聚糖三層微球。將制備得到海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉-殼聚糖三層微球于-20℃預(yù)凍24h，再于-80℃凍干直至重量不再發(fā)生變化，制備得到緩釋微球成品。

(2)制備可塑性緩釋微球型支架材料：

稱取3g氯化鈣固體溶解于97ml無(wú)菌去離子水溶液中制備得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％的氯化鈣溶液。按步驟(1.2)制備得到的緩釋微球成品與步驟(1.1)制備得到的殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液體積比為3:7，將緩釋微球成品逐粒加入殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液，300r/min勻速攪拌15min至緩釋微球分布均勻后，取2ml倒入24孔板一板孔，-20℃下預(yù)凍24h，后于-80℃凍干24h，恢復(fù)室溫后經(jīng)3％(w/v)的氯化鈣溶液浸泡處理(液面沒(méi)過(guò)支架材料)1h后，-20℃下預(yù)凍24h，再于-80℃凍干直至重量不再發(fā)生變化，即可制備得到組分比為3:7的新型可塑性緩釋微球型支架材料，產(chǎn)物質(zhì)量為0.171±0.005g。

實(shí)施例4：

(1)制備殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液和緩釋微球：

(1.1)配置殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液

量取1ml冰醋酸加入100ml的容量瓶無(wú)菌去離子水定容，制備得到體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液；稱取2g海藻酸鈉固體，加入100ml體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液中攪拌溶解，制備得到海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的海藻酸鈉醋酸溶液。稱取1.67g殼聚糖固體，加入100ml海藻酸鈉醋酸溶液攪拌溶解，滴加1mol/lnaoh溶液調(diào)ph＝5，制備得到100ml殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液。

(1.2)制備緩釋微球：

稱取4g海藻酸鈉固體溶解于96ml無(wú)菌去離子水溶液中制備得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的海藻酸鈉溶液稱取；15g氯化鈣固體溶解于85ml無(wú)菌去離子水溶液中制備得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％的氯化鈣溶液。量取20ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的海藻酸鈉溶液逐滴勻速滴入30ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％的氯化鈣溶液中，300r/min勻速攪拌30min，過(guò)濾，制備得到核心微球。

量取1ml冰醋酸加入100ml的容量瓶無(wú)菌去離子水定容，制備得到體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液；稱取1g殼聚糖固體，加入99ml體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液中攪拌溶解，制備得到殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的殼聚糖醋酸溶液。將制備得到的核心微球逐粒投入30ml殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的殼聚糖醋酸溶液，500r/min勻速攪拌10min，過(guò)濾，制備得到海藻酸鈉-殼聚糖單層核心球。

稱取0.5g海藻酸鈉固體溶解于99.5ml無(wú)菌去離子水溶液中制備得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％的海藻酸鈉溶液。將制備得到的海藻酸鈉-殼聚糖單層核心球逐粒投入30ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％海藻酸鈉溶液，500r/min勻速攪拌2min，過(guò)濾，制備得到海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉二層微球。

量取1ml冰醋酸加入100ml的容量瓶無(wú)菌去離子水定容，制備得到體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液；稱取1g殼聚糖固體，加入99ml體積分?jǐn)?shù)1％醋酸溶液中攪拌溶解，制備得到殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的殼聚糖醋酸溶液。將制備得到的海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉二層微球逐粒投入30ml殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的殼聚糖醋酸溶液，500r/min勻速攪拌10min，過(guò)濾，制備得到海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉-殼聚糖三層微球。將制備得到海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉-殼聚糖三層微球于-20℃預(yù)凍24h，再于-80℃凍干直至重量不再發(fā)生變化，制備得到緩釋微球成品。

(2)制備可塑性緩釋微球型支架材料：

稱取3g氯化鈣固體溶解于97ml無(wú)菌去離子水溶液中制備得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％的氯化鈣溶液。按步驟(1.2)制備得到的緩釋微球成品與步驟(1.1)制備得到的殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液體積比為4:6，將緩釋微球成品逐粒加入殼聚糖海藻酸鈉醋酸溶液，300r/min勻速攪拌15min至緩釋微球分布均勻后，取2ml倒入24孔板一板孔，-20℃下預(yù)凍24h，后于-80℃凍干24h，恢復(fù)室溫后經(jīng)3％(w/v)的氯化鈣溶液浸泡處理(液面沒(méi)過(guò)支架材料)1h后，-20℃下預(yù)凍24h，再于-80℃凍干直至重量不再發(fā)生變化，即可制備得到組分比為4:6的新型可塑性緩釋微球型支架材料，產(chǎn)物質(zhì)量為0.206±0.013g。

新型可塑性緩釋微球型支架材料性能測(cè)定：

表觀形態(tài)：

將實(shí)施例1制備得到新型可塑性緩釋微球型支架材料根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求制備得到合適的掃描樣品，經(jīng)表面噴金處理后，置于掃描電鏡下觀察表觀結(jié)構(gòu)。

紅外掃描：

將實(shí)施例1根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求制備得到合適的掃描樣品，置于紅外光譜儀，分析所得紅外光譜。

孔隙率測(cè)定：

采用乙醇位移法測(cè)定孔隙率，將實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4制備得到新型可塑性緩釋微球型支架材料放入干燥箱(50℃)中烘干30min，用游標(biāo)卡尺精確測(cè)量圓柱形材料的高(h)，底面半徑(r)，體積(v)＝s×h＝πr²h。分析天平稱干重為m1。將圓柱形支架材料充分浸入無(wú)水乙醇中，搖床震蕩30min使氣泡完全消失，取出立即稱重m2，無(wú)水乙醇密度記做ρ。孔隙率按以下公式計(jì)算。重復(fù)5次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

支架孔隙率(r)的計(jì)算式為：

收縮率測(cè)定：

將實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4制備得到新型可塑性緩釋微球型支架材料放置干燥箱(50℃)中烘干30min，干燥后冷卻至室溫。使用游標(biāo)卡尺精確測(cè)量24孔板孔底內(nèi)徑d0，測(cè)量圓柱體材料底面直徑d1。收縮率按以下公式計(jì)算。重復(fù)5次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

收縮率(c)的計(jì)算公式為：c＝(d0-d1)/d0×100％。

溶脹度測(cè)定：

將實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4制備得到新型可塑性緩釋微球型支架材料，放置干燥箱(50℃)中烘干30min，干燥后冷卻至室溫，稱重m1，置于無(wú)菌pbs溶液中浸泡，搖床震蕩24h，取出稱重m2。溶脹度按以下公式計(jì)算。重復(fù)5次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。

溶脹度(r)的計(jì)算公式為：r＝m2/m1×100％。

降解速率測(cè)定：

將實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4制備得到新型可塑性緩釋微球型支架材料，放置干燥箱(50℃)中烘干30min，干燥后冷卻至室溫，分析天平測(cè)得干重m0，置于無(wú)菌pbs溶液中浸泡。每隔5天，將材料從pbs溶液中取出，放置干燥箱(50℃)中烘干24h，完全干燥后冷卻至室溫，稱重m1，計(jì)數(shù)后置于pbs溶液中浸泡。直至第20天。重復(fù)5次。支架剩余質(zhì)量分?jǐn)?shù)按以下公式計(jì)算并繪制降解曲線。

支架剩余質(zhì)量分?jǐn)?shù)(w)的計(jì)算公式為：w＝m1/m0×100％。

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：

將實(shí)施例1制備得到的材料放置干燥箱(50℃)中烘干30min，干燥后冷卻至室溫，置于24孔板板孔，浸泡2ml無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)液中，放置72小時(shí)后吸出浸出液，無(wú)菌濾紙過(guò)濾1次，細(xì)菌濾器過(guò)濾3次，制備得到含支架浸出液的細(xì)胞培養(yǎng)液。0.25％胰蛋白酶消化的第三代間充質(zhì)干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×10³個(gè)/孔接種于96孔板中，將細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組更換完全細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組更換含有支架浸出液的完全細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別與24h，48h，72h取出，按照cck-8試劑盒操作，每孔100微升加入含10％cck-8試劑的完全細(xì)胞培養(yǎng)液(加入試劑前使用完全細(xì)胞培養(yǎng)基清洗一次)，37℃培養(yǎng)箱中孵育2h，吸出含10％cck-8試劑的培養(yǎng)液于新96孔板中450nm全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)o.d.值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：

表觀形態(tài)：

掃描電鏡下觀察緩釋微球型支架的結(jié)果如圖3。其表面結(jié)構(gòu)疏松多孔，各空隙間相互連通，橫斷面結(jié)構(gòu)疏松。多個(gè)鏡下視野觀察，孔徑直徑在90～240微米。疏松多孔海綿狀結(jié)構(gòu)緊密包裹緩釋微球結(jié)構(gòu)，緩釋微球結(jié)構(gòu)完整。

紅外掃描：

所得紅外光譜如圖4。圖中箭頭所指的部分為海藻酸鈉及殼聚糖特異性官能團(tuán)峰值，表明疏松多孔海綿狀結(jié)構(gòu)與緩釋微球結(jié)構(gòu)通過(guò)靜電作用結(jié)合。

物理學(xué)特性檢測(cè)：

測(cè)得實(shí)施例1樣品孔隙率為70±1％，收縮率為4.8±0.4％，溶脹度為927.8±29.0％。

測(cè)得實(shí)施例2樣品孔隙率為64±1％，收縮率為11.0±0.2％，溶脹度為784.6±24.7％。

測(cè)得實(shí)施例3樣品孔隙率為60±1％，收縮率為14.8±0.9％，溶脹度為589.1±12.3％。

測(cè)得實(shí)施例4樣品孔隙率為54±2％，收縮率為16.1±0.3％，溶脹度為489.1±8.2％。

實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3、實(shí)施例4樣品降解速率曲線見(jiàn)圖8。

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：

測(cè)得細(xì)胞生長(zhǎng)形況如圖9，數(shù)據(jù)進(jìn)行spss18.0處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，p>0.05認(rèn)為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不認(rèn)為緩釋微球支架材料浸出液對(duì)細(xì)胞增值存在毒性。