本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地涉及mir-1288在診斷或治療骨關(guān)節(jié)炎疾病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，oa)是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變、破壞、消失和關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生為主要病變特征的慢性進(jìn)行性疾病，隨著年齡增加，患病率顯著升高。其主要的臨床表現(xiàn)為：受累關(guān)節(jié)的疼痛、腫脹、畸形、活動(dòng)受限，x線片的主要表現(xiàn)為受累關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)間隙變窄、軟骨下骨硬化、周圍骨贅形成。目前oa的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，比較統(tǒng)一的解釋是，機(jī)械力學(xué)和生物學(xué)因素導(dǎo)致軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和軟骨下骨的退化。關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細(xì)胞、ii型膠原、蛋白聚糖和水組成。關(guān)節(jié)軟骨沒有血或神經(jīng)分布，軟骨細(xì)胞是該組織中僅有的細(xì)胞類型。軟骨細(xì)胞負(fù)責(zé)制造軟骨基質(zhì)的ii型膠原和蛋白聚糖。其后該基質(zhì)又具有允許用水使基質(zhì)飽和的物理化學(xué)特性。這種結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的凈效應(yīng)是關(guān)節(jié)軟骨具有特殊的耐磨特征，并且關(guān)節(jié)軟骨面之間發(fā)生幾乎無摩擦的移動(dòng)。在未患骨關(guān)節(jié)炎時(shí)，關(guān)節(jié)軟骨經(jīng)常在甚至高需求的身體條件下提供終生的無痛承重和無限制的關(guān)節(jié)移動(dòng)?，F(xiàn)有的骨關(guān)節(jié)炎治療方法包括運(yùn)動(dòng)、藥物、休息和關(guān)節(jié)保健、手術(shù)、疼痛緩解技術(shù)、替代治療和體重控制。由于軟骨組織病變的不可逆性，目前臨床上還未出現(xiàn)一種有效的治療方法。此外，由于骨關(guān)節(jié)炎隱匿式發(fā)生并且發(fā)展緩慢，因此骨關(guān)節(jié)炎經(jīng)常在疾病發(fā)展的晚期才得到鑒定，而不是潛在治療可能更有效的疾病發(fā)展早期。micrornas(mirnas)是一類長(zhǎng)約19-23個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈rna分子，大量的研究表明microrna是一類重要的調(diào)控因子，通過與靶基因序列特異性相互作用在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與多種生物學(xué)過程，進(jìn)化過程保守。越來越多的研究表明，mirna的表達(dá)具有時(shí)序特異性和組織特異性。每種mirna針對(duì)的數(shù)個(gè)甚至上百個(gè)潛在靶基因，mirna與risc的復(fù)合體通過堿基配對(duì)可與靶基因mrna5’-utr或者3’-utr中的互補(bǔ)序列相結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)翻譯，或是引發(fā)mrna降解，從而負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。目前普遍認(rèn)為mirna的功能是參與生命的一些基本過程如生長(zhǎng)發(fā)育、器官形成、造血、細(xì)胞增殖與凋亡、應(yīng)激反應(yīng)和腫瘤生成等。因此尋找mirnas作為早期診斷骨關(guān)節(jié)炎退行性疾病的標(biāo)志物，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎疾病的診斷和治療具有重要意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了實(shí)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎的早期發(fā)現(xiàn)，早期干預(yù)，本發(fā)明的目的之一在于提供mir-1288在制備治療shisa4基因相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之二在于提供一種治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物。本發(fā)明的目的之三在于提供一種診斷早期骨關(guān)節(jié)炎的試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了mir-1288在制備治療shisa4基因相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用，所述mir-1288包括前體mirna和成熟mirna；所述前體mirna的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述成熟的mirna為mir-1288-5p和mir-1288-3p序列分別如seqidno.2和seqidno.3所示。優(yōu)選地，所述shisa4基因相關(guān)疾病是由于shisa4基因表達(dá)下調(diào)引起的，所述疾病為骨關(guān)節(jié)炎，所述mir-1288的靶基因?yàn)閟hisa4。優(yōu)選地，所述mir-1288的核苷酸序列在骨關(guān)節(jié)炎組織中表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物，所述的藥物包含mir-1288抑制劑。優(yōu)選地，所述mir-1288抑制劑能夠抑制mir-1288的功能，進(jìn)而促進(jìn)shisa4基因的表達(dá)。優(yōu)選地，所述mir-1288抑制劑是mir-1288的反義寡核苷酸或拮抗劑，所述的mir-1288的反義寡核苷酸序列如seqidno.4所示。優(yōu)選地，所述的藥物能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和抑制軟骨細(xì)胞的凋亡。本發(fā)明的藥物可根據(jù)需要制備成各種劑型。包括但不限于，經(jīng)皮、粘膜、口頰、舌下或經(jīng)口使用的片劑、溶液劑、顆粒劑、貼劑、膏劑、膠囊劑、氣霧劑或栓劑。本發(fā)明的藥物的施用途徑不受限制，只要它能發(fā)揮期望的治療效果或預(yù)防效果即可，包括但不限于口服、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直腸灌注、鼻腔噴霧、口腔噴霧、皮膚局部或全身經(jīng)皮用藥。本發(fā)明的藥物的劑量不受限制，只要獲得期望的治療效果或者預(yù)防效果即可，可以依據(jù)癥狀、性別、年齡等來恰當(dāng)?shù)拇_定。本發(fā)明的治療藥物或預(yù)防藥物的劑量可以使用對(duì)疾病的治療效果或者預(yù)防效果作為指標(biāo)來確定。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種診斷早期骨關(guān)節(jié)炎的試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測(cè)mir-1288的表達(dá)水平的試劑。優(yōu)選地，所述的試劑包括特異性擴(kuò)增mir-1288引物或探針。優(yōu)選地，所述的引物序列包括正向引物序列和反向通用引物，其中正向引物序列如seqidno.5所示。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明公開了一種與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的mir-1288，并進(jìn)一步證實(shí)mir-1288在骨關(guān)節(jié)炎組織中表達(dá)上調(diào)。利用mir-1288檢測(cè)骨關(guān)節(jié)炎不僅能夠快速有效的做到早期檢測(cè)，而且為基因治療、藥物治療等臨床應(yīng)用提供了治療靶點(diǎn)和重要依據(jù)。附圖說明圖1rt-pcr驗(yàn)證骨性關(guān)節(jié)炎患者和對(duì)照組mir-1288的表達(dá)情況；圖2rt-pcr驗(yàn)證骨性關(guān)節(jié)炎患者和對(duì)照組shisa4的表達(dá)情況；圖3mir-1288抑制劑對(duì)oa軟骨細(xì)胞中shisa4蛋白表達(dá)的影響；圖4mir-1288抑制劑對(duì)oa軟骨細(xì)胞增殖能力的影響。圖5mir-1288抑制劑對(duì)oa軟骨細(xì)胞凋亡的影響。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常為本領(lǐng)域常規(guī)方法，如按照常規(guī)條件如sambrook等人，分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(第三版)(科學(xué)出版社，2002)中的所述條件，或按照試劑制造廠家所建議的條件。本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)10例骨性關(guān)節(jié)炎樣本及4例對(duì)照樣本進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)合生物信息學(xué)方法進(jìn)行差異性表達(dá)mirna和mrna的篩選，再進(jìn)行mirna和mrna關(guān)聯(lián)分析，共得到109個(gè)mirna-靶基因關(guān)系對(duì)，挑選了差異表達(dá)上調(diào)最明顯的mir-1288，其靶標(biāo)基因?yàn)閟hisa4?，F(xiàn)有研究中并沒有mir-1288和骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的報(bào)道，進(jìn)一步，發(fā)明人進(jìn)行了分子生物學(xué)方法驗(yàn)證，證實(shí)了mir-1288在骨性關(guān)節(jié)炎組織中表達(dá)上調(diào)，其相關(guān)制劑可用于治療骨性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明的shisa4基因是在本發(fā)明之前的已知基因，其基本信息如下：genbank登錄號(hào)：ncbigeneid:149345，來源于人類基因組。本發(fā)明還采用rt-pcr方法檢測(cè)上述mir-1288和shisa4在骨關(guān)節(jié)炎患者和正常人群中的表達(dá)，并驗(yàn)證了該mirna在骨關(guān)節(jié)炎表達(dá)上調(diào)，其靶基因shisa4在骨關(guān)節(jié)炎表達(dá)下調(diào)。實(shí)施例1高通量測(cè)序1、取樣取2012年10月到2015年12月期間在北京協(xié)和醫(yī)院骨科就診骨性關(guān)節(jié)炎患者，病例組共收集10例，對(duì)照來源于同時(shí)期骨科住院的其他疾病患者，共收集4例。獲取所有研究對(duì)象的滑液樣本，編號(hào)后置-80℃低溫冰箱保存。病例組均符合膝關(guān)節(jié)oa診斷標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行膝關(guān)節(jié)人工關(guān)節(jié)置換術(shù)患者；對(duì)照組為半月板損傷及交叉韌帶損傷進(jìn)行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)治療的患者。根據(jù)1995年美國(guó)風(fēng)濕協(xié)會(huì)骨性關(guān)節(jié)炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，診斷為重度骨性關(guān)節(jié)炎，有膝關(guān)節(jié)置換指征的患者病例。其中，臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)1995年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)所制定的標(biāo)準(zhǔn)：(1)1個(gè)月內(nèi)大多數(shù)時(shí)間有膝痛；(2)關(guān)節(jié)活動(dòng)時(shí)響聲；(3)晨僵不大于30分鐘；(4)年齡不小于40歲；(5)膝關(guān)節(jié)骨性腫脹伴彈響；(6)膝關(guān)節(jié)骨性腫脹不伴有彈響。最少存在((1)、(2)、(3)、(4)或(1)、(2)、(3)、(5)或(1)、(6)即可診斷oa。2、對(duì)滑液進(jìn)行總rna提取采用reagent(invitrogen，貨號(hào)15596-018)進(jìn)行樣本rna提取，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，具體操作如下：收集樣本后凍存于液氮，取出后把滑液放入已預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，待組織樣本成粉末狀后：①加入trizol，室溫保存5分鐘；②加氯仿0.2ml，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5分鐘-10分鐘；③12000rpm高速離心15分鐘后吸取上層水相(吸70％)到另一新離心管管中，注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì)。移入新管，加入等體積的-20℃預(yù)冷異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10分鐘；④12000rpm高速離15分鐘后小心棄掉上清液，按1ml/mltrizol的比例加入75％depc乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振蕩混合，4℃下12000rpm高速離心5分鐘；⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5分鐘以充分晾干沉淀，加入depc處理過的水溶解沉淀；⑥用nanodrop2000紫外分光光度計(jì)測(cè)量rna純度及濃度，凍存于-80℃。rna質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)：rna樣本的od260/od280值為1.7-2.2之間；總rna電泳圖譜有清晰的28s、18s條帶；70℃水浴保溫1小時(shí)后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。3、rna樣品的質(zhì)量分析rna提取后瓊脂糖凝膠電泳，從電泳結(jié)果可以初步判定提取的rna樣品質(zhì)量合格與否，是否可以用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組分析。進(jìn)而通過nanodrop1000分光光度計(jì)檢測(cè)rna樣品的提取情況，rna-seq測(cè)序的樣品要求：od260/od280為1.8-2.2。4、高通量測(cè)序測(cè)序平臺(tái)為illumina公司的hiseq2500高通量測(cè)序平臺(tái)，進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序，測(cè)序后我們運(yùn)用fast-qc(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行整體評(píng)估，包括堿基的質(zhì)量值分布，質(zhì)量值的位置分布，gc含量，pcrduplication含量，kmer的frequency等。在差異mirna及mrna表達(dá)分析時(shí)，根據(jù)得到的fpkm值，采用國(guó)際公認(rèn)算法ebseq進(jìn)行差異篩選。其中，篩選時(shí)，log2fc>1或<-1，fdr<0.05，共篩選出15個(gè)差異表達(dá)的mirna，其中表達(dá)水平上調(diào)的mirna6個(gè)，表達(dá)水平下調(diào)的mirna9個(gè)。分析過程中l(wèi)og2fc>1或<-1，fdr<0.05，共篩選出435個(gè)差異表達(dá)的mrna，其中表達(dá)水平上調(diào)的基因265個(gè)，表達(dá)水平下調(diào)的基因170個(gè)。利用包括rna22，miranda，mirdb，mirwalk，pictar2及targetscan這些算法預(yù)測(cè)差異表達(dá)mirna的靶基因，選取≥4個(gè)算法預(yù)測(cè)出來的靶基因，并在mirwalk數(shù)據(jù)庫(kù)查找已驗(yàn)證的差異表達(dá)的mirna的靶基因，然后將所有靶基因與mrna測(cè)序結(jié)果中與mirna表達(dá)負(fù)相關(guān)的基因進(jìn)行整合分析，我們共得到109個(gè)mirna-靶基因關(guān)系對(duì)，結(jié)合文獻(xiàn)我們篩選了差異表達(dá)上調(diào)最明顯的mir-1288，通過預(yù)測(cè)得到mir-1288-靶基因關(guān)系對(duì)，其靶標(biāo)基因?yàn)閟hisa4。實(shí)施例2rt-pcr驗(yàn)證骨性關(guān)節(jié)炎患者mir-1288和shisa4的表達(dá)情況1、材料選取36例骨性關(guān)節(jié)炎患者滑液及10例對(duì)照滑液，對(duì)其進(jìn)行分組及編號(hào)。病例組均符合膝關(guān)節(jié)oa診斷標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行膝關(guān)節(jié)人工關(guān)節(jié)置換術(shù)患者；對(duì)照組為半月板損傷及交叉韌帶損傷進(jìn)行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)治療的患者。2、方法2.1對(duì)滑液進(jìn)行總rna提取，同實(shí)施例1的提取方法。2.2逆轉(zhuǎn)錄(1)mrna逆轉(zhuǎn)錄采用iiireversetranscriptase(invitrogen，貨號(hào)18080-044)進(jìn)行cdna反轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，具體操作如下：使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對(duì)lμg總rna進(jìn)行逆反錄合成cdna。采用25μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣品取1μg總rna作為模板rna。獲得的cdna保存放-20℃冰箱備用。(2)mirna逆轉(zhuǎn)錄使用onestepprimescriptmirnacdnasynthesiskit(takara，codeno.d350a)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，具體操作如下：采用20μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣品取1μg總rna作為模板。獲得的cdna保存放-20℃冰箱備用。2.3real-timepcr用abi7500型熒光定量pcr儀，采用2-δδct法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。(1)mrna的rt-pcr使用powergreenpcrmastermix(invitrogen，貨號(hào)4367659)進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系如表1所示。表1mrna的rt-pcr反應(yīng)體系mrnas的表達(dá)檢測(cè)每次設(shè)置3個(gè)平行管反應(yīng)。擴(kuò)增shisa4(nm_198149.2)正向引物序列如seqidno.5所示，反向引物序列如seqidno.6所示。以gapdh作為內(nèi)參基因，其上游引物如seqidno.7所示，下游引物如seqidno.8所示。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃10min，45x(95℃15s，60℃60s)。(2)mirna的rt-pcr使用sybrprimesciptmirnart-pcrkit(takara，codeno.rr716)進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。表2mirna的rt-pcr反應(yīng)體系組分加入量sybrpremixextaqii(2×)10μlpcrforwardprimer(10μm)0.5μluni-mirqpcrprimer(10μm)0.5μlroxreferencedyeii(50×)2μl模板(cdna溶液)2μldh2o至20μlmirnas的表達(dá)檢測(cè)每次設(shè)置3個(gè)平行管反應(yīng)。擴(kuò)增mir-1288正向引物序列如seqidno.9所示，以snrnau6作為內(nèi)參，其上游引物如seqidno.10所示，下游引物如seqidno.11所示。擴(kuò)增程序：95℃30s；40x(95℃5s，60℃34s)。3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)時(shí)定量pcr擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清楚，擴(kuò)增曲線整體平行性好，表明各反應(yīng)管的擴(kuò)增效率相近，極限平而無上揚(yáng)現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說明擴(kuò)增效率較高；樣本擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線都是單峰，說明擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴(kuò)增；根據(jù)qrt-pcr的相對(duì)定量公式：2-δδct×100％，比較mir-1288和shisa4基因在骨關(guān)節(jié)炎組織和對(duì)照組織中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：qrt-pcr擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定，其中mir-1288在骨關(guān)節(jié)炎組織表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，約是對(duì)照的3.5倍，具體見圖1，而shisa4在骨關(guān)節(jié)炎組織中的表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照，約為對(duì)照的25％，具體見圖2，以上結(jié)果驗(yàn)證了高通量轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)的整合分析的結(jié)果。實(shí)施例3mir-1288與shisa4靶基因關(guān)系驗(yàn)證1、設(shè)計(jì)合成針對(duì)mir-1288的反義寡核苷酸(anti-mir-1288)根據(jù)mir-1288的序列信息由大連寶生物生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成mir-1288的反義寡核苷酸序列和隨機(jī)對(duì)照序列，mir-1288的反義寡核苷酸序列如seqidno.4所示。2、細(xì)胞培養(yǎng)用含青霉素(100u/ml)、鏈霉素(100μg/ml)的磷酸鹽緩沖液(petalbovineserum，pbs)沖洗從關(guān)節(jié)置換取下的無菌膝關(guān)節(jié)軟骨組織置于無菌培養(yǎng)皿數(shù)次后，將軟骨修剪至1mm×1mm×1mm大小；加入3倍體積的0.25％胰蛋白酶于37℃消化30-50分鐘，然后輕輕吹打棄去上清液，d-hanks(百浩生物)液沖洗3-5次；加入3倍體積的0.15％的ii型膠原酶(invitrogen)，37℃下?lián)u蕩消化6小時(shí)，每3個(gè)小時(shí)收一次細(xì)胞；200目篩網(wǎng)過濾消化后的細(xì)胞懸液，低溫離心5分鐘(約2800轉(zhuǎn)/分)后再次棄去上清液，dmem/f12(invitrogen)培養(yǎng)液沖洗3次，加入含10％胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞懸液分布均勻，從而得到含有軟骨細(xì)胞的細(xì)胞懸液；將細(xì)胞以1×108個(gè)/l接種于25cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)(5ml/瓶)，置于37℃恒溫，5％co2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)中使用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況和形態(tài)，待細(xì)胞貼壁后再第一次換液，以后每2天換液一次。原代培養(yǎng)細(xì)胞的覆蓋超過瓶子底部面積的80％時(shí)傳代。3、轉(zhuǎn)染采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，操作按照l(shuí)ipofectaminetm2000transfectionreagent試劑說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前24h將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞接種到6孔板中，細(xì)胞計(jì)數(shù)約5×104，常規(guī)培養(yǎng)至轉(zhuǎn)染當(dāng)天，細(xì)胞融合度為50-60％時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。將80nmanti-mir-1288加入到100uldmem培養(yǎng)基中，輕柔混勻；另用100uldmem培養(yǎng)基稀釋2ullipofectamintm2000脂質(zhì)體，輕柔混勻，室溫孵育5min；混合dmem-脂質(zhì)體與dmem-mirnas，室溫孵育20min，以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物；然后將上述混合物加到細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻，使他們充分混合。其中，非特異性序列作為陰性對(duì)照(anti-nc)，同期設(shè)有空白對(duì)照組。培養(yǎng)48h后提取細(xì)胞總rna進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。4、anti-mir-1288對(duì)于oa軟骨細(xì)胞mir-1288表達(dá)的作用：細(xì)胞總rna提取和pcr步驟同實(shí)施例2。real-timepcr結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組對(duì)軟骨細(xì)胞中mir-1288表達(dá)無明顯抑制作用，和空白對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，轉(zhuǎn)染的anti-mir1288組對(duì)軟骨細(xì)胞中mir-1288表達(dá)起到一定抑制作用抑制率為59％。5、anti-mir-1288對(duì)oa軟骨細(xì)胞中shisa4基因表達(dá)的影響取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞，以4×105/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，按照所述各組進(jìn)行轉(zhuǎn)染。并重復(fù)3次。48h后收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，將蛋白加入到10％sds-page進(jìn)行電泳，再將蛋白轉(zhuǎn)至pvdf膜上，經(jīng)5％脫脂奶粉封閉后，加入相應(yīng)的一抗于4℃孵育過夜，anti-shisa4antibody(1∶1000稀釋，abcam，ab167046)。二抗(goatanti-rabbitigg,hrpconjugated(cw0103))室溫孵育1h后，利用ecl液顯影，掃描儀中成像。以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，與對(duì)照組相比，觀察anti-mir-1288組中shisa4蛋白的相對(duì)表達(dá)水平情況，采用imagej分析軟件對(duì)蛋白電泳條帶灰度值進(jìn)行定量,最后得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果如圖3顯示，將anti-mir-1288轉(zhuǎn)染至oa軟骨細(xì)胞中，48h后提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，空白對(duì)照為未轉(zhuǎn)染mirna的軟骨細(xì)胞，轉(zhuǎn)染非特異性序列作為陰性對(duì)照。用wb方法檢測(cè)靶基因shisa4的蛋白表達(dá)水平變化，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染非特異性序列沒有明顯變化，轉(zhuǎn)染anti-mir-1288組中shisa4蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(p<0.01)，表明shisa4是anti-mir-1288的靶基因。實(shí)施例4mir-1288的抑制劑對(duì)oa軟骨細(xì)胞增殖能力的影響實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染anti-mir-1288實(shí)驗(yàn)組。取對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞配置成1×104/ml單細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔100μl，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，加入cck-8試劑，2h后用酶標(biāo)儀測(cè)定其450nm波長(zhǎng)吸光度值作為零點(diǎn)。以后連續(xù)5d每過24h，每孔加入cck-8試劑10μl溫育2h后，酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞吸光度值，并繪制細(xì)胞增殖曲線。結(jié)果如圖4顯示，與對(duì)照組相比較，陰性對(duì)照組細(xì)胞增殖無顯著差異，而經(jīng)anti-mir-1288轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞，其細(xì)胞增殖能力顯著上升(p<0.05)。實(shí)施例5mir-1288抑制劑對(duì)oa軟骨細(xì)胞凋亡的影響按照實(shí)施例3的方法對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行anti-mir-1288和anti-nc的轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，將細(xì)胞用不含edta的胰酶消化收集(注：胰酶消化時(shí)間不易過長(zhǎng)，否則容易引起假陽(yáng)性)；用pbs洗滌細(xì)胞二次(2000rpm離心5min)收集1～5×105細(xì)胞；按照annexinv-fitc/pi雙染試劑盒(購(gòu)自invitrogen公司)的操作說明進(jìn)行細(xì)胞處理。加入500μl的bindingbuffer(凱基，南京)懸浮細(xì)胞；加入5μlannexinv-fitc(凱基，南京)混勻后，加入5μlpropidiumiodide(凱基，南京)，混勻；室溫、避光、反應(yīng)5-15min后進(jìn)行流式細(xì)胞儀的檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用spss19.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果如圖5所示，與轉(zhuǎn)染anti-nc細(xì)胞組相比，轉(zhuǎn)染anti-mir-1288的細(xì)胞凋亡率降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。序列表<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院<120>mir-1288在診斷或治療骨關(guān)節(jié)炎疾病中的應(yīng)用<130>16zjp115<160>11<170>patentinversion3.5<210>1<211>75<212>rna<213>rna序列<400>1gaggguguugaucagcagaucaggacuguaacucaccauagugguggacugcccugaucu60ggagaccacugccuu75<210>2<211>23<212>rna<213>rna序列<400>2gcagaucaggacuguaacucacc23<210>3<211>21<212>rna<213>rna序列<400>3uggacugcccugaucuggaga21<210>4<211>21<212>rna<213>人工序列<400>4accugacgggacuagaccucu21<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5tcagtcgcatcattggaccc20<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列<400>6tgtagtgcaaacgagcatctct22<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列<400>7ggagcgagatccctccaaaat21<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列<400>8ggctgttgtcatacttctcatgg23<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列<400>9tggactgccctgatctggaga21<210>10<211>23<212>dna<213>人工序列<400>10gtgctcgcttcggcagcacatat23<210>11<211>22<212>dna<213>人工序列<400>11aaaatatggaacgcttcacgaa22當(dāng)前第1頁(yè)12