本發(fā)明涉及植物活性成分小檗堿，具體涉及載小檗堿的羧甲基β-環(huán)糊精功能化蒙脫石釋藥系統(tǒng)。

背景技術：

細菌造成的感染是危害人類健康的重要因素之一。在全球范圍內(nèi)，5歲以下因病致死的兒童中，就有15％是由細菌感染引起的腹瀉致死，緊隨肺炎(18％)之后高居致死率第二位。近一個世紀以來，抗生素藥物已經(jīng)被廣泛應用于臨床細菌感染的預防和治療，然而使用抗生素治療的細菌感染患者中，約有5-25％的患者會出現(xiàn)腹瀉、炎癥等副作用。除此之外，抗生素濫用使得細菌耐藥問題變得日益嚴重，同時也造成抗生素療效的大幅降低?，F(xiàn)有的抗菌藥物已經(jīng)不能充分滿足臨床應用的需求，因此開發(fā)新的抗菌藥物成為大勢所趨。

在這個大背景下，開發(fā)植物來源的天然抗菌化合物成為了解決現(xiàn)存問題的一大策略。從黃連、刺檗、白毛茛、海膽亞目、黃柏、古山龍等中草藥中提取得到的植物活性成分小檗堿，具有較強的抗菌活性，近年來備受藥物學家關注。小檗堿屬于異喹啉類生物堿，在水中難溶，同時其是細菌多藥耐藥泵(mdrs)的底物，因此極易被mdrs排出，以致難以進入細胞，所以直接用小檗堿殺菌，生物利用度較低。小檗堿結(jié)構式如下：

蒙脫石(mmt)，是具有層狀結(jié)構的硅酸鹽，化學式為[(na,ca)0.33(al,mg)2(si4o10)(oh)2·nh2o]，由一個八面體構和兩個四面體片層所組成。蒙脫石具有較大的表面積，較強的吸附能力，較高的陽離子交換容量以及更大的層空間以容納有機藥物分子。經(jīng)查，目前未有蒙脫石裝載小檗堿的抗菌研究報道。在研究蒙脫石載小檗堿釋藥系統(tǒng)過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)載藥系統(tǒng)中的蒙脫石微粒容易聚集沉淀，從而影響活性成分小檗堿的釋放與吸收。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術中的問題，根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明的目的在于提供一種羧甲基β-環(huán)糊精功能化蒙脫石(cmcd-aptes-mmt)超分子網(wǎng)絡材料。

除特殊說明外，本發(fā)明所述份數(shù)均為重量份，所述百分比均為質(zhì)量百分比。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：

一種羧甲基β-環(huán)糊精功能化蒙脫石超分子網(wǎng)絡材料，其特征在于：產(chǎn)生的紅外光譜在3421cm^-1,2934cm^-1,1637cm^-1,1414cm^-1,1159cm^-1,1087cm^-1,1039cm^-1,745cm^-1,613cm^-1,587cm^-1左右顯示出吸收峰。

上述羧甲基β-環(huán)糊精功能化蒙脫石超分子網(wǎng)絡材料，其特征在于：在衍射角度2θ為5.39±0.2°、8.72±0.2°處有衍射峰。

上述羧甲基β-環(huán)糊精功能化蒙脫石超分子網(wǎng)絡材料，其特征在于：在熱重分析過程中，90±2℃失去水分子，在411±2℃受熱分解。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明的目的在于提供上述羧甲基β-環(huán)糊精功能化蒙脫石超分子網(wǎng)絡材料的制備方法。

本發(fā)明羧甲基β-環(huán)糊精功能化蒙脫石超分子網(wǎng)絡材料的制備方法，其特征在于：采用β-環(huán)糊精在堿性條件下(如氫氧化鈉)與一氯乙酸反應合成羧甲基環(huán)糊精；對蒙脫石進行硅烷化，得到三氨丙基三乙氧基硅烷硅烷化的蒙脫石；在室溫條件下通過1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基琥珀酰亞胺催化，使羧甲基環(huán)糊精與三氨丙基三乙氧基硅烷硅烷化的蒙脫石反應，得到羧甲基環(huán)糊精功能化的蒙脫石材料。

超分子是指由兩種或兩種以上分子通過分子間相互作用結(jié)合在一起的一類復雜的、有組織的聚集體，它們顯示明確的微觀結(jié)構并保持其完整性，并具有獨特的理化特征。分子間作用力通常包括氫鍵，配位鍵，靜電作用，疏水鍵等。本發(fā)明合成cmcd-aptes-mmt作為自組裝單元。cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)狀自組裝體的形成，主要依賴于兩種分子間氫鍵：一種是一分子組裝單元中蒙脫石表面硅氧四面體中的氧原子與另一組裝單元中環(huán)糊精的羥基之間形成的氫鍵；另一種是一分子組裝單元中的羰基氧與另一組裝單元中酰胺鍵上的氫形成的氫鍵。兩種氫鍵的協(xié)同作用促使cmcd-aptes-mmt發(fā)生自組裝形成超分子網(wǎng)狀結(jié)構，并以此作為裝載藥物的新型載體材料。與蒙脫石或者環(huán)糊精相比，該材料是一個多宿主系統(tǒng)，蒙脫石和環(huán)糊精的特性兼而有之，因此具有有機-無機雜化材料的優(yōu)勢。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明的目的在于提供一種載小檗堿的羧甲基β-環(huán)糊精功能化蒙脫石釋藥系統(tǒng)的制備方法，該方法使用上述羧甲基β-環(huán)糊精功能化蒙脫石超分子網(wǎng)絡材料裝載小檗堿制備的釋藥系統(tǒng)，對革蘭陰性菌及革蘭陽性菌的抑制作用遠高于游離藥物。

本發(fā)明載小檗堿的羧甲基β-環(huán)糊精功能化蒙脫石釋藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，采用以下步驟：

將鹽酸小檗堿用超純水溶解得到濃度為50μg/ml～350μg/ml的小檗堿水溶液，按照小檗堿與羧甲基β-環(huán)糊精功能化蒙脫石超分子網(wǎng)絡材料質(zhì)量比為5～35：100加入羧甲基β-環(huán)糊精功能化蒙脫石超分子網(wǎng)絡材料，在溫度為30-80℃、ph為2-11的條件下，反應0.5-6小時，將得到的混懸液離心、微孔濾膜過濾，收集上清液，用紫外分光光度計于345nm波長處測定未被裝載的游離鹽酸小檗堿的含量；然后按以下公式計算載藥量

優(yōu)選的，上述小檗堿水溶液的濃度為250μg/ml～350μg/ml。

優(yōu)選的，上述反應時間為3-6小時。

優(yōu)選的，上述反應ph為9-11。

優(yōu)選的，上述反應溫度為50-80℃。

本發(fā)明載小檗堿的羧甲基β-環(huán)糊精功能化蒙脫石釋藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，采用以下步驟：

(1)、羧甲基β-環(huán)糊精功能化蒙脫石超分子網(wǎng)絡材料的制備；

采用β-環(huán)糊精在堿性條件下(如氫氧化鈉)與一氯乙酸反應合成羧甲基環(huán)糊精；對蒙脫石進行硅烷化，得到三氨丙基三乙氧基硅烷硅烷化的蒙脫石；在室溫條件下通過1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基琥珀酰亞胺催化，使羧甲基環(huán)糊精與三氨丙基三乙氧基硅烷硅烷化的蒙脫石反應，得到羧甲基環(huán)糊精功能化的蒙脫石材料；

(2)、載小檗堿的羧甲基β-環(huán)糊精功能化蒙脫石釋藥系統(tǒng)的制備

將鹽酸小檗堿用超純水溶解得到濃度為250μg/ml～350μg/ml的小檗堿水溶液，按照小檗堿與羧甲基β-環(huán)糊精功能化蒙脫石超分子網(wǎng)絡材料質(zhì)量比為25～35：100加入羧甲基β-環(huán)糊精功能化蒙脫石超分子網(wǎng)絡材料，在溫度為50-80℃、ph為9-11的條件下，反應3-6小時，將得到的混懸液離心、用0.45μm的微孔濾膜過濾，收集上清液，用紫外分光光度計于345nm波長處測定未被裝載的游離鹽酸小檗堿的含量；然后按以下公式計算載藥量

有益效果：

本發(fā)明提供一種羧甲基β-環(huán)糊精功能化蒙脫石(cmcd-aptes-mmt)超分子網(wǎng)絡材料，該材料產(chǎn)生的紅外光譜在3421cm^-1,2934cm^-1,1637cm^-1,1414cm^-1,1159cm^-1,1087cm^-1,1039cm^-1,745cm^-1,613cm^-1,587cm^-1左右顯示出吸收峰；相較蒙脫石(mmt)和硅烷化蒙脫石(aptes-mmt)，本發(fā)明cmcd-aptes-mmt在2934cm^-1附近均出現(xiàn)了新的吸收峰，該峰是屬于-ch2的伸縮振動峰，這說明aptes成功嫁接于mmt。熱重分析曲線顯示，本發(fā)明cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡材料分別在90℃和411℃出現(xiàn)兩次明顯失重，90℃時發(fā)生的失重是由于殘存在材料上的水分的蒸發(fā)，而411℃時的失重則是由嫁接于其上的aptes和cmcd基團的熱分解所致。粉末衍射顯示，本發(fā)明cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡材料在2θ＝8.67°處出現(xiàn)新的衍射峰，而27.57°、28.43°(2θ)處的衍射峰消失，說明相比mmt和aptes-mmt，本發(fā)明cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡材料的晶體結(jié)構發(fā)生了變化；并且，mmtd001特征峰的2θ＝6.97°、d＝1.26nm，aptes-mmt的d001峰2θ＝6.11°、d＝1.47nm，而cmcd-aptes-mmt的d001峰2θ＝5.39°，d＝1.64nm，d001峰左移以及層空間的擴大，都說明cmcd基團不僅嫁接于mmt的表面，還同時層插于mmt的層間。本發(fā)明cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡材料經(jīng)掃描電鏡顯示，材料呈現(xiàn)不規(guī)則的網(wǎng)絡狀，網(wǎng)絡密度隨材料濃度遞增，當材料濃度達到1.2mg/ml時，呈現(xiàn)單層疏松的網(wǎng)絡初始形態(tài)；當材料濃度達到1.8mg/ml時致密網(wǎng)絡結(jié)構形成，其平均孔徑小于1μm。

游離鹽酸小檗堿抗菌活性弱的主要原因是其水溶性差以及細菌多藥耐藥泵對其的外排作用，使其難以進入細菌細胞內(nèi)發(fā)揮抗菌作用。本發(fā)明使用cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡作為鹽酸小檗堿的載體制備的釋藥系統(tǒng)，鹽酸小檗堿在水中分散性和溶解性明顯增加，有效提高了鹽酸小檗堿的生物利用度；相對于蒙脫石作為載體的載藥系統(tǒng)，載藥量明顯提高，局部釋藥量大大提高，具有更強的抗菌效果。本發(fā)明使cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡作為鹽酸小檗堿的載體制備的釋藥系統(tǒng)，對細菌具有很強的捕獲能力，同時cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡也能對細菌菌體進行包裹，以加強裝載于其中的鹽酸小檗堿跟細菌的接觸，從而提升鹽酸小檗堿的抗菌性能。體外抑菌試驗結(jié)果表明，本發(fā)明使用cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡作為鹽酸小檗堿的載體制備的釋藥系統(tǒng)對大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)和金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)的抑制作用遠高于游離藥物小檗堿，并且抑菌性能呈現(xiàn)濃度依賴性和長效性，本發(fā)明使用cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡材料作為鹽酸小檗堿的載體制備的釋藥系統(tǒng)對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制率分別可達到98.45％和97.81％。

附圖說明

圖1是實施例1制備的cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡材料紅外分析圖譜圖；

圖2是實施例1制備的cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡材料熱重分析圖；

圖3是實施例1制備的cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡材料x射線粉末衍射圖譜；

圖4是實施例1制備的cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡材料場發(fā)射掃描電鏡圖，其中a為低濃度稀疏形態(tài)的cmcd–aptes–mmt超分子網(wǎng)絡材料，b為a圖的局部放大，c為高濃度致密形態(tài)的cmcd–aptes–mmt超分子網(wǎng)絡材料，d為c圖的局部放大；

圖5是實施例3中反應時間對cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡材料載藥率的影響圖；

圖6是實施例3中bbh初始濃度對cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡材料載藥率的影響圖；

圖7是實施例3中溫度對cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡材料載藥率的影響圖；

圖8是實施例3中ph對cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡材料載藥率的影響圖；

圖9是實施例3中模擬生理條件(ph7.4,37℃)下鹽酸小檗堿的釋放曲線圖；

圖10是實施例3cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡材料在水溶性介質(zhì)中的溶脹行為圖，其中a為第1天，b為第3天，c為第5天；

圖11是實施例4場發(fā)射掃描電鏡圖，其中(a)金葡菌原菌，(b)大腸桿菌原菌，(c)載藥cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡材料與金葡菌接觸12小時，(d)載藥cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡材料與大腸桿菌接觸12小時(e)，載藥cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡材料與金葡菌接觸24小時，(f)載藥

cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡材料與大腸桿菌接觸24小時。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明進行具體描述，在此指出以下實施例只用于對本發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，本領域的技術熟練人員可以根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容對本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。

原料與試劑

本發(fā)明所有原料及試劑均為市售產(chǎn)品。其中鹽酸小檗堿標準品(阿拉丁試劑)；鈉基蒙脫石(浙江豐虹新材料股份有限公司，型號為cec80mmol/100g)；β-環(huán)糊精(國藥集團化學試劑有限公司)；三氨丙基三乙氧基硅烷(sigma)；edc(上海麥克林生化科技有限公司)；monochloroaceticacid(上海麥克林生化科技有限公司)；n-hydroxysuccinimide(上海麥克林生化科技有限公司)；十六烷基溴化銨(sigma)；大腸桿菌凍干菌粉(蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術有限公司，編號cmcc(b)44102)；金黃色葡萄球菌凍干菌粉(蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術有限公司，編號cmcc(b)26003)；lb肉湯培養(yǎng)基(青島日水生物技術有限公司)；lb瓊脂培養(yǎng)基(青島日水生物技術有限公司)。

實施例1羧甲基β-環(huán)糊精功能化蒙脫石材料的制備

羧甲基環(huán)糊精(cmcd)的制備

稱取9.3g氫氧化鈉于圓底燒瓶中，加入37ml去離子水置于冰水浴中攪拌至完全溶解。再加入10gβ-環(huán)糊精攪拌溶解。配制27ml16.3％的一氯乙酸水溶液，備用。將上述圓底燒瓶置于60℃的恒溫水浴鍋中，緩慢滴加入一氯乙酸水溶液(20分鐘內(nèi)加完)，待反應5小時之后，將反應溶液倒入大燒杯中，冷卻后邊攪拌邊滴加入濃鹽酸至ph試紙檢測為中性。加入大量無水甲醇于燒杯中，快速攪拌，可見白色沉淀析出。抽濾，收集白色沉淀于燒杯中，加入少量去離子水(約5ml)使沉淀完全溶解于水中即可，復加入無水甲醇(約800ml)，使白色沉淀再次析出，抽濾用甲醇洗滌5次，收集白色沉淀，此白色沉淀即為羧甲基環(huán)糊精。

硅烷化蒙脫石(aptes-mmt)的制備

配制200ml乙醇-水溶液(體積比：75/25)于圓底燒瓶中，稱取2.5g蒙脫石，分散于200ml乙醇-水溶液中，磁力攪拌30分鐘至分散均勻。最后加入2.1ml三氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，水浴加熱至80℃，回流反應8小時。反應結(jié)束后，冷卻至室溫，過濾，用水醇混合溶液洗滌過濾5次，清除未反應完的aptes，至濾液茚三酮檢測不顯色為止(茚三酮可與伯胺基反應顯粉色)。

cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡材料的制備

稱取0.7gaptes-mmt分散于10mlph5.8的pbs(磷酸緩沖液)中，備用。稱取1.193gcmcd和0.115gnhs(n-羥基琥珀酰亞胺)于40mlpbs(ph＝5.8)中，磁力攪拌30分鐘，再加入0.192gedc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)活化羧基，活化持續(xù)30分鐘。活化完畢后，然后加入10mlaptes-mmt混懸液。室溫下，磁力攪拌24小時。反應完后，用去離子水洗滌、抽濾，收集產(chǎn)物，置于真空干燥箱中50℃干燥過夜，即得。

紅外光譜分析

取適量mmt、cmcd、aptes-mmt、cmcd-aptes-mmt樣品以及光譜純kbr，置于80℃烘箱中干燥24小時，備用。采用干燥充分的kbr壓片制備待測樣品，于波數(shù)4000-400cm^-1范圍內(nèi)進行紅外掃描。紅外光譜如圖1所示，本發(fā)明cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡材料，產(chǎn)生的紅外光譜在3421cm^-1,2934cm^-1,1637cm^-1,1414cm^-1,1159cm^-1,1087cm^-1,1039cm^-1,745cm^-1,613cm^-1,587cm^-1左右顯示出吸收峰。相較mmt，aptes-mmt和cmcd-aptes-mmt在2934cm^-1附近均出現(xiàn)了新的吸收峰，該峰是屬于-ch2的伸縮振動峰，這說明aptes成功嫁接于mmt。同時，本發(fā)明cmcd-aptes-mmt在587、613、745cm^–1處出現(xiàn)了典型的β-環(huán)糊精環(huán)結(jié)構的振動吸收峰，以及在1159cm^–1出現(xiàn)c–o–c伸縮振動和o–h彎曲振動峰；1039和1037cm^–1的吸收峰均是由c–o、c–c伸縮振動和o–h彎曲振動引起的；1414cm^–1的吸收峰是c–h和o–h的彎曲振動峰；3421cm^-1是來自于mmt表面以及環(huán)糊精上-oh的伸縮振動峰；而1637cm^–1的酰胺鍵伸縮振動峰則確證了cmcd和aptes-mmt之間縮合反應的發(fā)生，cmcd通過酰胺鍵成功嫁接于apte-mmt之上。

熱重分析

分別稱取約8mgmmt、cmcd、aptes-mmt、cmcd-aptes-mmt樣品，在氬氣環(huán)境下，均以15℃/min的加熱速率，由30℃升溫至800℃。熱重分析曲線如圖2所示，在30-800℃范圍內(nèi)，mmt發(fā)生兩次明顯失重，第一次是在89℃時失重4.5％，這一部分的重量損失是由于樣品中殘留水分的蒸發(fā)。第二次在622℃失重3.4％。則是由于mmt本身的解離。而aptes-mmt則分別在111、494℃失重明顯，111℃的失重同樣是因為殘留水分的蒸發(fā)，而494℃的失重則源自于嫁接在mmt上的aptes基團的分解，失重比率約為6.3％。本發(fā)明cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡材料的tga曲線顯示，其分別在90℃和411℃出現(xiàn)兩次明顯失重，90℃時發(fā)生的失重是由于殘存在材料上的水分的蒸發(fā)，而411℃時的失重則是由嫁接于其上的aptes和cmcd基團的熱分解所致；其在128-411℃高達16.6％的質(zhì)量損失。從以上數(shù)據(jù)可以計算出，cmcd-aptes-mmt中cmcd基團的質(zhì)量占比約為6.9％。

x射線粉末衍射分析

采用cukα輻射功率40kv×200ma，分別測定mmt、aptes-mmt和cmcd-aptes-mmt樣品的晶體結(jié)構。如圖3所示，比較三個樣品的衍射圖譜，cmcd-aptes-mmt在2θ＝8.67°處出現(xiàn)新的衍射峰，而27.57°、28.43°(2θ)處的衍射峰消失，說明cmcd-aptes-mmt的晶體結(jié)構相比mmt和aptes-mmt發(fā)生了變化。并且，mmtd001特征峰的2θ＝6.97°、d＝1.26nm，aptes-mmt的d001峰2θ＝6.11°、d＝1.47nm，而cmcd-aptes-mmt的d001峰2θ＝5.39°，d＝1.64nm，d001峰左移以及層空間的擴大，都說明cmcd基團不僅嫁接于mmt的表面，還同時層插于mmt的層間。

場發(fā)射掃描電鏡分析

稱取18mgcmcd-aptes-mmt于圓底燒瓶中，加入10ml去離子水，磁力攪拌30分鐘得到均一的cmcd-aptes-mmt混懸液。用滴管取一滴混懸液樣品，置于單晶硅片上，密封好后室溫干燥24小時，對干燥后樣品進行噴金，已備觀察。場發(fā)射掃描電鏡分析如圖4所示，a為低濃度(1.2mg/ml)cmcd-aptes-mmt形成的結(jié)構松散的網(wǎng)絡材料，從a圖的局部放大(圖b)可看出，在致密的超分子網(wǎng)絡形成前，自組裝體剛開始形成網(wǎng)絡的最初形態(tài)，隨著cmcd-aptes-mmt濃度提高(1.8mg/ml)，cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡最終形成(圖c、d)。根據(jù)場發(fā)射掃描電鏡觀察得知，本發(fā)明cmcd-aptes-mmt超分子材料呈現(xiàn)不規(guī)則的網(wǎng)絡狀，網(wǎng)絡密度隨材料濃度遞增，當材料濃度達到1.2mg/ml時，呈現(xiàn)單層疏松的網(wǎng)絡初始形態(tài)；當材料濃度達到1.8mg/ml時致密網(wǎng)絡結(jié)構形成，其平均孔徑小于1μm。

實施例2鹽酸小檗堿紫外分光光度法含量測定方法的建立

鹽酸小檗堿(bbh)紫外吸收波長的確定

精密稱取105℃干燥至恒重的鹽酸小檗堿標準品18mg，用超純水完全溶解后，定容于25ml容量瓶中，得鹽酸小檗堿儲備液。精密吸取1ml鹽酸小檗堿儲備液于25ml容量瓶中定容，最終制得濃度為29μg/ml的鹽酸小檗堿溶液。用紫外-可見分光光度計在200-600nm范圍內(nèi)掃描測定吸光度。結(jié)果顯示，鹽酸小檗堿在228、263、345nm三個波長處均有最大吸收，為了避免200nm低波長附近可能存在的雜質(zhì)干擾，故選擇較高波長處345nm作為檢測波長。

標準曲線的繪制

稱取7mgbbh標準品，加入適量超純水，加熱溶解后，置于100ml容量瓶中，超純水定容。制得濃度為70μg/ml的bbh儲備液。分別精密量取1,1.5,2,2.5,3,3.5,4ml的bbh儲備液于25ml容量瓶中，均用超純水定容。以超純水為空白對照，采用紫外分光光度法于345nm波長處測定吸光度。由表1可知，鹽酸小檗堿在2.8-11.2μg/ml濃度范圍內(nèi)，濃度與吸光度呈良好線性關系，回歸方程：a＝0.0599c-0.0078，r＝0.9995。

表1鹽酸小檗堿標準曲線測定結(jié)果(n＝7)

精密度試驗

精密吸取鹽酸小檗堿標準品儲備液，分別配置成3、7、11μg/ml三種濃度的鹽酸小檗堿溶液。三份樣品于1天內(nèi)，間隔相同時間段重復測定5次吸光度，考查日內(nèi)精密度；三份樣品每天測一次吸光度，連續(xù)測定5天，考查日間精密度。由表2可知，高中低三中濃度標準品溶液的日內(nèi)和日間rsd值均小于1％，說明儀器精密度良好，可滿足紫外測定要求。

表2精密度試驗結(jié)果(n＝5)

實施例3cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡材料載藥性能考查實驗

根據(jù)下列公式計算cmcd-aptes-mmt的載藥率：

載藥時間對載藥率的影響

稱取50mg鹽酸小檗堿于圓底燒瓶中，加入100ml超純水加熱溶解，稱取100mgcmcd-aptes-mmt均勻分散上述藥物溶液中，持續(xù)攪拌，并于選定時間點：0.5、1、2、3、4、5、6小時精密吸取混懸液，于12,000rpm離心5分鐘，收集上清液，并用0.45μm微孔濾膜過濾上清液去除懸浮粒子。采用紫外分光光度法于345nm波長處測定上清液中游離鹽酸小檗堿的含量。所有樣品一式三份，平行試驗。由圖5可知，載藥0.5小時載藥率為3.01％；載藥1小時載藥率為5.67％；載藥2小時載藥率為12.11％；載藥3小時載藥率為15.02％；載藥4小時載藥率為15.56％；載藥5小時載藥率為17.23％。5小時內(nèi)cmcd-aptes-mmt的載藥率隨著載藥時間的增加而提高，因此本發(fā)明選定5小時作為最優(yōu)載藥時間進行后續(xù)試驗。

初始藥物濃度對載藥率的影響

分別稱取5、10、15、20、25、30、35mg鹽酸小檗堿于圓底燒瓶中，再分別加入100ml超純水加熱溶解。稱取100mgcmcd-aptes-mmt分別加入上述7個濃度的鹽酸小檗堿溶液中，于室溫持續(xù)攪拌5小時。反應結(jié)束后，同上法收集上清液，并測定上清液中游離鹽酸小檗堿的含量。由圖6可知，當鹽酸小檗堿的初始濃度為50μg/ml時，cmcd-aptes-mmt的載藥率為5.69％；初始濃度為100μg/ml時，載藥率為7.33％；初始濃度為150μg/ml時，載藥率為10.68％；初始濃度為200μg/ml時，載藥率為13.23％；初始濃度為250μg/ml時，載藥率為16.41％；初始濃度為300μg/ml時，載藥率為18.73％?？梢婋S著初始濃度的增加，cmcd-aptes-mmt的載藥率也相應提高，直到初始濃度增加到350μg/ml時，載藥率降為18.10％，因此選定初始濃度300μg/ml進行后續(xù)試驗。

溫度對載藥率的影響

稱取30mg鹽酸小檗堿加熱溶解于100ml超純水，再加入100mgcmcd-aptes-mmt，分別于30、40、50、60、70、80℃條件下持續(xù)攪拌5小時，同上法測定游離bbh含量。由圖7可知，cmcd-aptes-mmt的載藥率隨著溫度增加而提高，到50℃時達到27.8％，在此之后繼續(xù)升高溫度，載藥率提高不明顯。因此從節(jié)能方面考慮，選擇50℃作為最優(yōu)載藥溫度。

ph對載藥率的影響

稱取適量0.1mkh2po4溶解于超純水中，分別加入不同量的0.1mhcl和0.1mnaoh，采用ph計調(diào)節(jié)ph，制得ph2-11系列緩沖液。分別加入30mgbbh加熱溶解，再分別加入100mgcmcd-aptes-mmt，于50℃持續(xù)攪拌5小時后，用紫外分光光度計測定游離藥物含量，依公式計算不同ph條件下cmcd-aptes-mmt的載藥率。如圖8可知，隨著ph值的升高，載藥率也呈現(xiàn)上升趨勢，在ph＝10時，載藥率達到最大值27.8％。cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡材料體外釋放度考查

稱取200mg載藥cmcd-aptes-mmt于透析袋中(截留分子量8,000–12,000da))，加入2mlofpbs(0.1m,ph7.4)后封緊袋口。將透析袋置于裝有100mlpbs(0.1m,ph7.4)的錐形瓶中，將錐形瓶放于37±0.5℃的恒溫振蕩箱中以150rpm持續(xù)振搖，并在選定時間間隔內(nèi)，于溶出介質(zhì)取樣4ml，并補充入新的等量的pbs溶液。采用紫外分光光度計于345nm處，測定溶出介質(zhì)中bbh含量。載藥超分子網(wǎng)絡材料歷時5天的體外模擬釋放試驗可看出(圖9)，載體中鹽酸小檗堿的釋放主要分兩步，在前12小時的釋放度可達49.3％，之后釋放減慢展現(xiàn)出緩釋特征，5天內(nèi)總釋放率為63.7％。

本發(fā)明cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡載體中鹽酸小檗堿的釋放行為受多種因素影響，通場發(fā)射掃描電鏡觀察可知，蒙脫石材料本身在水中極易發(fā)生溶脹(圖10)，隨著溶脹的發(fā)生，裝載于蒙脫石層間的鹽酸小檗堿分子逐步釋放出來，因此溶脹的程度可對釋放行為產(chǎn)生影響；蒙脫石的陽離子交換屬性，使溶出介質(zhì)中的離子可與裝載于蒙脫石層間的陽離子化合物放生置換，從而影響釋放。

本發(fā)明通過溫和、環(huán)保的反應條件和試劑，首次成功合成了cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡材料。經(jīng)體外載藥、釋放試驗證明，cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡對模型藥物鹽酸小檗堿有較高的裝載率，在模擬生理環(huán)境條件下，載藥cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡具有長效緩釋性能。

實施例4本發(fā)明釋藥系統(tǒng)的體外抗菌性能實驗

菌懸液的制備

lb培養(yǎng)基的制備

稱取1.25glb肉湯培養(yǎng)基粉末于錐形瓶中，加入50mlpbs加熱溶解制得lb肉湯培養(yǎng)基備用。稱取4glb瓊脂培養(yǎng)基加入100mlpbs加熱溶解后，在未冷卻前與肉湯培養(yǎng)基一起放入高壓滅菌鍋于121℃滅菌30分鐘。取滅完菌的瓊脂培養(yǎng)，在瓊脂未凝固前快速倒入一次性無菌培養(yǎng)皿(約15ml)，待瓊脂凝固后，倒置備用。

菌種的復蘇與傳代

取適量凍干菌粉于肉湯培養(yǎng)基中，將錐形瓶置于37℃恒溫振蕩器中，以150rpm培育24小時，得1代菌。用接種環(huán)沾取含有1代菌的肉湯，于瓊脂平板上劃線接種。將瓊脂平板倒置放于生化培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24小時。得第2代菌。在瓊脂平板上，挑取2個菌落，再接種于50ml肉湯培養(yǎng)基中。經(jīng)37℃振蕩培育24小時，得濃度約為10⁷cfu/ml的第3代菌的菌懸液，用于后續(xù)的抗菌試驗。

大腸桿菌和金黃色葡萄球菌存活時限考查

本發(fā)明首先對大腸桿菌(e.coli)和金黃色葡萄球菌(s.aureus)在有限營養(yǎng)條件下的生存時限進行了實驗。分別取濃度為10⁷cfu/ml的兩種菌菌懸液0.1ml于錐形瓶中，再分別加入4ml肉湯。將錐形瓶置于37℃恒溫振蕩器中100rpm培育5天，每天取樣0.1ml采用平板稀釋法觀察活菌數(shù)，考查2種菌在5天內(nèi)的存活情況。分別含有大腸桿菌和金葡菌菌懸的肉湯培養(yǎng)基，經(jīng)過5天的培育，每天取樣取涂布平板，于24小時后觀察菌落數(shù)。結(jié)果表明，在1-3天，兩種的菌的活菌數(shù)差異不大，但在培育第4天后，肉湯中活菌數(shù)開始明顯降低。說明在有限的營養(yǎng)條件下，大腸桿菌和金葡菌在3天內(nèi)的存活度不受影響，但在4天后細菌由于得不到充足的營養(yǎng)供給和自身有毒物質(zhì)的排出，導致細菌死亡。因此為了排除條件因素的干擾，真實反映載藥材料抗菌活性數(shù)據(jù)的可靠性，后續(xù)所有抗菌試驗的培育時間都控制在3天以內(nèi)。

載藥cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡抗菌活性考查

分別稱取bbh0.6mg和2mg；載藥cmcd-aptes-mmt(含600μgbbh)2mg和7mg，于超凈臺內(nèi)紫外照射30分鐘后，分別分散于1ml滅菌pbs中。再分別加入裝有4ml菌懸液(10⁷cfu/ml)的錐形瓶中，使最終s.aureus菌懸液中bbh含量為150μg/ml，e.coli菌懸液中bbh含量為400μg/ml。37℃振蕩培養(yǎng)24小時。各取0.5ml培育后的菌懸液，適當稀釋后，再吸取0.1ml稀釋的菌液于瓊脂平板上，均勻涂布，靜置10分鐘，待菌液被瓊脂充分吸收后倒置平板于37℃生化培養(yǎng)箱，培育24小時。計算菌落數(shù)。通過比較瓊脂平板上的菌落數(shù)，可明顯看出無論是對大腸桿菌還是金黃色葡萄球菌，載藥cmcd-aptes-mmt的抗菌活性都明顯高于游離的bbh。實驗結(jié)果顯示，載藥cmcd-aptes-mmt分別于金葡菌、大腸桿菌一起培育24小時之后，活菌濃度從初始的10⁷cfu/ml分別下降到10¹cfu/ml(金葡菌)和10²cfu/ml(大腸桿菌)，而經(jīng)游離bbh處理的菌懸液中的活菌數(shù)則為10⁴和10⁷。因此，采用cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡材料作為bbh載體，極大的提高了bbh的抗菌活性。

載藥cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡濃度對抗菌活性的影響

稀釋平板計數(shù)法觀測活菌數(shù)

分別稱取適量載藥cmcd-aptes-mmt，紫外線照射滅菌后，分散于pbs中，得到50-600μg/ml不同濃度的載藥cmcd-aptes-mmt混懸液，再分別加入裝有10⁷cfu/mle.coli和s.aureus菌懸液的錐形瓶中，于37℃振搖培育24小時。以不含藥的pbs作為空白。培育完畢后，于各錐形瓶中取樣0.5ml，適當稀釋后，取0.1ml涂布平板，倒置培育24小時后計算菌落數(shù)并拍照。結(jié)果顯示，載藥cmcd-aptes-mmt對金葡菌和大腸桿菌的抑制作用均呈現(xiàn)出濃度依賴的特性。當載藥cmcd-aptes-mmt濃度達到600μg/ml時，其對大腸桿菌的抑制率達到91.57±2.11％；當載藥cmcd-aptes-mmt濃度達到250μg/ml時，其對金葡菌的抑制率則達到93.9±1.35％。

熒光顯微鏡觀測細菌胞內(nèi)鹽酸小檗堿濃度

將濃度為50-600μg/ml的載藥超分子載體分別加入菌濃度為10⁷cfu/ml的lb肉湯中，經(jīng)過37℃，24小時培育后，分別取樣，將載體肉湯混懸液以500rpm離心10分鐘，除去載體材料，收集上清液，再于4000rpm離心20分鐘。收集菌體，用pbs重新離心3次，再復懸于超純水中已備熒光觀察。熒光顯微鏡選用激發(fā)波長355nm，發(fā)射波長517nm。由于小檗堿自身具有的熒光性，因此可采用熒光顯微鏡來觀察細菌對鹽酸小檗堿的吸收。結(jié)果顯示，隨著載藥cmcd-aptes-mmt濃度的提高，鹽酸小檗堿進入細菌的量也逐漸增多，因此細菌的熒光強度逐漸增強。熒光顯色直觀的印證了載藥cmcd-aptes-mmt濃度依賴的抗菌活性。

載藥cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡長效抑菌性能考查

將濃度為50-600μg/ml的載藥超分子載體分別分散于1mlofpbs中，再將混懸液分別加入4ml菌液濃度為10⁷cfu/ml的肉湯中?？瞻捉M的含菌肉湯只加入pbs。上述樣品全部于37℃，100rpm振搖培育，分別于4、8、12、18、24、36、48和72小時取樣，采用紫外分光光度法于600nm波長處測定光密度值。結(jié)果顯示，在3天內(nèi)選定的時段對經(jīng)載藥cmcd-aptes-mmt處理的菌懸液的光密度進行了檢測，隨著載藥cmcd-aptes-mmt濃度的增加，光密度值明顯降低。在處理三天后，濃度為600μg/ml的載藥cmcd-aptes-mmt對大腸桿菌的抑制率達到98.45％；濃度為250μg/ml的載藥cmcd-aptes-mmt對金黃色葡萄球菌的抑制率達97.81％。

通過場發(fā)射掃描電鏡觀察，載藥cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡可對細菌菌體進行包裹，從而加強了鹽酸小檗堿與細菌之間的接觸。如圖11，在載藥cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡與金葡菌和大腸桿菌分別接觸24小時之后，材料對菌體實現(xiàn)了完全的包裹，并使菌體發(fā)生了扭曲變形。裝載鹽酸小檗堿的cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡的體外抑菌試驗結(jié)果表明，其對大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)和金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)的的抑制作用遠高于游離藥物，并且抑菌性能呈現(xiàn)濃度依賴性和長效性，在本發(fā)明中載藥cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制率分別可達到98.45％和97.81％。

材料毒性考查

分別稱取與裝載50-600μg/mlbbh等量的不含藥的cmcd-aptes-mmt載體材料，分別加入菌液濃度為10⁷cfu/ml的肉湯中，于37℃真要培育24小時。采用稀釋平板計數(shù)法計算培育后的活菌數(shù)。結(jié)果顯示，經(jīng)過37℃，72小時的培育，在50-600μg/ml劑量范圍內(nèi)，空白材料對細菌的生長，幾乎沒有抑制作用，因此cmcd-aptes-mmt網(wǎng)絡材料是安全可靠的。

在本發(fā)明中，由cmcd-aptes-mmt自組裝而形成的超分子網(wǎng)絡首次被合成并對其作為抗菌藥物載體的各項性能進行了體外評估。cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡中，蒙脫石和環(huán)糊精可同時作為藥物載體，裝載模型藥物鹽酸小檗堿，因此cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡相比單一的蒙脫石材料，載藥率得到了極大提升，在體外最優(yōu)條件下載藥率可達27.8％。載藥率的提高使得在藥物釋放的過程中，局部的藥物濃度也相對增加，因此作用于細菌的藥物的濃度提高，抗菌作用增強。通過體外抑菌試驗也可發(fā)現(xiàn)，游離藥物在抑制大腸桿菌生長時，所需的藥物濃度大大高于抑制金黃色葡萄球菌所需藥物，這主要是由于革蘭氏陰性菌的細胞外層有一層特殊的外膜結(jié)構，阻礙了藥物的進入。雖然載藥cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡對抗大腸桿菌所需濃度也高于金黃色葡萄球菌，但相比游離藥物，載藥cmcd-aptes-mmt超分子網(wǎng)絡對抑制大腸桿菌的最小抑菌濃度有明顯降低。