本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，涉及一種腦靶向納米給藥系統(tǒng)，具體來說是一種腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米給藥系統(tǒng)及其制備方法。

背景技術：

由于血腦屏障(blood-brainbarrier,bbb)的存在，98％以上的藥物難以入腦，藥物的腦內(nèi)遞送技術已成為當今藥劑學研究的熱點。常用的腦靶向策略主要有以下幾種：①內(nèi)源性轉運蛋白介導、②納米系統(tǒng)包載、③通過鼻腔給藥繞過bbb、④bbb外排抑制、⑤短暫開放bbb。由于單一靶向策略提高藥物腦內(nèi)遞送的能力有限，還遠遠不能達到腦部疾病治療的要求，目前越來越多的腦靶向研究趨于將多種靶向策略相結合以進一步提高腦部疾病的治療效果。

中醫(yī)引經(jīng)理論認為，通過引經(jīng)可以改變其它藥物的作用方向或部位，或使其作用側重于或集中于特定的方向和部位，這種具有可以改變其它藥物的作用方向或部位的藥物稱為引經(jīng)藥。中藥的引經(jīng)理論與西藥的靶向理論有著異曲同工之妙，即都是把藥物送到病變部位，提高藥物的選擇性作用。藥物動力學實驗證實腦部引經(jīng)藥冰片可增強川芎、順鉑等多種藥物在腦內(nèi)的濃度，體現(xiàn)靶向作用，為引經(jīng)與靶向的相似性關系提供了現(xiàn)代依據(jù)。冰片、石菖蒲等芳香開竅中藥是常見的腦部引經(jīng)藥。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有腦內(nèi)藥物遞送技術中的上述技術問題，本發(fā)明提供了一種腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米給藥系統(tǒng)及其制備方法，所述的這種腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米給藥系統(tǒng)及其制備方法要解決現(xiàn)有技術中的治療腦部疾病的藥物效果不佳的技術問題。

本發(fā)明提供了一種腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米粒給藥系統(tǒng)，由腦部引經(jīng)藥，納米遞藥系統(tǒng)和腦部疾病治療藥物組成，所述的腦部引經(jīng)藥為冰片或β-細辛醚中的任意一種或者兩種的組合，所述的納米遞藥系統(tǒng)為聚合物納米?；蛘吖腆w脂質(zhì)納米粒。

進一步的，所述的聚合物納米粒為聚乙二醇化的聚酯類共聚物，其中，聚乙二醇的分子量為2000-5000，聚乙二醇化的聚酯類共聚物的分子量為20000-55000。

進一步的，所述的固體脂質(zhì)納米粒為硬脂酸和磷脂制成的固體脂質(zhì)納米粒。

具體的，所述的固體脂質(zhì)納米?？梢杂扇８视王?如三硬脂酸)，部分甘油酯(如單硬脂酸甘油酯，甾體類(膽固醇等)等經(jīng)高壓乳勻法、乳化-溶劑揮發(fā)法、薄膜分散法或乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備。

進一步的，所述的腦部疾病治療藥物為止痛藥，腦血管病治療藥物或抗腫瘤藥物。

進一步的，所述的止痛藥可以是延胡索乙素、青藤堿或冬凌草甲素；腦血管病治療藥物可以是丹參酮或葛根素；抗腫瘤藥物可以是多烯紫杉醇或阿霉素。

進一步的，所述的腦部引經(jīng)藥的質(zhì)量為腦靶向納米粒給藥系統(tǒng)總質(zhì)量的2％-20％。

本發(fā)明還提供了上述的一種腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米粒給藥系統(tǒng)的制備方法,腦部引經(jīng)藥通過物理包載或化學共價連接的方法修飾到聚乙二醇聚酯納米粒或固體脂質(zhì)納米粒上，腦部疾病治療藥物包載于腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米粒給藥系統(tǒng)中。

進一步的，將冰片/氨基修飾的冰片或β-細辛醚/氨基修飾的β-細辛醚，通過氨基-nhs或羥基-羧基共價鍵連接到聚乙二醇化的聚酯類共聚物或者硬脂酸上，得到引經(jīng)藥修飾的聚合物材料及脂質(zhì)材料。

進一步的，采用單乳法或復乳法制備腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米粒給藥系統(tǒng)。

進一步的，所述的腦部引經(jīng)藥通過物理包載或化學共價連接的方法修飾到聚乙二醇化的聚酯納米?；蚬腆w脂質(zhì)納米粒上。

進一步的，物理包載法將引經(jīng)藥與腦部疾病治療藥物一起加入到油相中制備納米粒。

進一步的，化學修飾法中引經(jīng)藥修飾的聚合物材料或脂質(zhì)材料可以但不限于：冰片硬脂酸酯，冰片接枝聚乙二醇聚乳酸，β-細辛醚接枝聚乙二醇聚乳酸。

進一步的，氨基修飾的β-細辛醚通過以下方法制備：β-細辛醚先通過碳鏈上的雙鍵與溴化氫加成，反應產(chǎn)物通過gabriel反應將碳鏈上的溴轉成氨基。即通過鄰苯二甲酰亞胺和氫氧化鉀的乙醇溶液作用發(fā)生反應轉變?yōu)猷彵蕉柞啺符}，該鹽和β-細辛醚溴代產(chǎn)物生成了n-烷基領苯二甲酰亞胺，然后在堿性的條件下水解得到了氨基修飾的β-細辛醚。

進一步的，冰片接枝聚乙二醇聚乳酸，β-細辛醚接枝聚乙二醇聚乳酸通過以下方法制備：nhs-peg-plga與(r)-(+)莰胺或氨基修飾的β-細辛醚及n，n-二異丙基乙胺，在室溫下反應即得。

進一步的，將未修飾聚合物材料或脂質(zhì)材料，引經(jīng)藥修飾聚合物材料或脂質(zhì)材料溶解于含有腦部疾病治療藥物的有機溶劑溶液形成有機相，逐滴和水相混合，攪拌后旋轉蒸發(fā)，濃縮、固化即得化學修飾法制備的腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米粒給藥系統(tǒng)。

進一步的，將未修飾聚合物材料或脂質(zhì)材料，引經(jīng)藥溶解于含有腦部疾病治療藥物的有機溶劑溶液形成有機相，逐滴和水相混合，攪拌后旋轉蒸發(fā)，濃縮、固化即得物理包載法修飾的腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米粒給藥系統(tǒng)。

進一步的，將未修飾聚合物材料或脂質(zhì)材料，引經(jīng)藥修飾聚合物材料或脂質(zhì)材料加至含有腦部疾病治療藥物的有機溶液中，溶解完全后加入水相混合，探針超聲形成初乳，再加入表面活性劑溶液，探針超聲，分散，磁力攪拌，旋蒸除去有機溶劑，即得化學修飾法制備的腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米粒給藥系統(tǒng)。

進一步的，將未修飾聚合物材料或脂質(zhì)材料，引經(jīng)藥加至含有腦部疾病治療藥物的有機溶液中，溶解完全后加入水相混合，探針超聲形成初乳，再加入表面活性劑溶液，探針超聲，分散，磁力攪拌，旋蒸除去有機溶劑，即得物理包載法修飾的腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米粒給藥系統(tǒng)。

本發(fā)明制備的腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米給藥系統(tǒng)可用于靜脈或鼻腔給藥，用于止痛、治療腦腫瘤和腦血管疾病(如腦缺血再灌注損傷)。并可進一步進行rgd等其他二級靶向分子修飾。

本發(fā)明采用的冰片或β-細辛醚為分子量小的脂溶性物質(zhì)，它們不僅本身易透過bbb，還可引藥上行，通過抑制p-糖蛋白的活性，抑制一氧化氮合成等多種機制促進其它藥物透過bbb。此外還具有調(diào)節(jié)bbb通透性，改善bbb功能和保護腦組織的作用。

本發(fā)明的遞藥系統(tǒng)由聚合物納米粒或固體脂質(zhì)納米粒組成，通過修飾的引經(jīng)藥促進納米粒跨越血腦屏障轉運。本發(fā)明將引經(jīng)理論應用于靶向給藥系統(tǒng)，以腦部引經(jīng)藥修飾微粒表面，或包載于納米粒中與治療藥物同時給藥，提供一種新型腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米給藥系統(tǒng)，由于引經(jīng)藥對腦部組織細胞的選擇性生理性改變，增加給藥系統(tǒng)對靶器官腦的識別能力，直接增強治療藥物在靶器官的濃集，從而降低毒性，增強治療效果。

本發(fā)明利用具有鼻腔粘膜和血腦屏障促透性能的腦部引經(jīng)藥為腦靶向頭基，修飾聚合物材料或脂質(zhì)材料制備的納米粒，構建得到腦部引經(jīng)藥修飾的腦靶向納米給藥系統(tǒng)。本發(fā)明利用引經(jīng)藥促進納米粒在鼻腔粘膜和血腦屏障的轉運，提供一種安全有效的提高藥物腦內(nèi)遞送的方法，具有良好的應用前景。

本發(fā)明和已有技術相比，其技術進步是顯著的。本發(fā)明以安全有效的中醫(yī)腦部引經(jīng)藥為腦靶向功能分子，提高納米系統(tǒng)的腦內(nèi)遞送能力，安全性高，且該腦靶向功能分子為小分子化合物，與多肽蛋白類靶向功能分子相比，具有制備簡單，穩(wěn)定性高的特點，具有較好的應用前景。

附圖說明

圖1為中醫(yī)腦部引經(jīng)藥修飾腦靶向納米給藥系統(tǒng)的tem圖；其中，a為物理包載法制備的冰片修飾載葛根總黃酮固體脂質(zhì)納米粒；b為化學修飾法制備的冰片修飾載葛根總黃酮固體脂質(zhì)納米粒；c為化學修飾法制備的冰片修飾載丹參酮iia聚乙二醇聚乳酸納米粒；d為化學修飾法制備的β-細辛醚修飾載丹參酮iia聚乙二醇聚乳酸納米粒；e為物理包載法制備的冰片修飾載丹參酮iia聚乙二醇聚乳酸納米粒；f為物理包載法制備的β-細辛醚修飾載丹參酮iia聚乙二醇聚乳酸納米粒；g為化學修飾法制備的冰片，rgd肽共修飾載多西紫杉醇聚乙二醇聚乳酸納米粒；h為化學修飾法制備的冰片修飾載多西紫杉醇聚乙二醇聚乳酸納米粒。

圖2為冰片(bo)和β-細辛醚(as)不同修飾方法對16hbe細胞攝取載coumarin-6聚乙二醇聚乳酸納米粒的影響*p<0.05,**p<0.01。

圖3鼻腔給予物理包載(ptf-bo-sln)和化學修飾法(ptf-bo-sa-sln)制備冰片修飾載葛根總黃酮固體脂質(zhì)納米粒后，腦內(nèi)葛根總黃酮的藥時曲線。

圖4是幾種修飾后slns的體外釋放曲線圖。

圖5顯示了，大鼠鼻腔給予含同等劑量的coumarin-6納米粒1h后，腦組織切片中coumarin-6熒光信號情況，coumarin-6-bo-sa-slns較強(a)，其次是coumarin-6-bo-slns組(b)和coumarin-6-np組(c)，原料藥組最弱(d)。

圖6顯示了包載丹參酮ⅱa納米粒對于缺血再灌注損傷的預防作用，模型組較普通納米粒組腦內(nèi)mda含量明顯升高，(p<0.05)。而與tsa-np組比較，冰片修飾bo-tsa-np組和β-細辛醚修飾as-tsa-np組的腦組織mda含量均顯著下降(p<0.01)。

具體實施方式

實施例1

冰片硬脂酸酯通過以下方法制備：精密稱取56.8g硬脂酸于250ml三頸燒瓶中于，加入28.6mgsocl2，70℃反應2h后升溫至90℃反應2h，冷卻，加50mlch2cl2備用。精密稱取30.9gbo溶于100mlch2cl2冰浴下加入上述制備的酰氯室溫攪拌反應48h，加入三乙胺，抽濾，干燥。濾液加入乙醇沉淀，抽濾干燥即得。

實施例2

以30ml0.5％poloxamer188為水相；以30ml甲醇溶解硬脂酸、冰片硬脂酸酯、磷脂e80和葛根總黃酮，作為有機相。兩相均預熱至(75±2)℃。攪拌下，用5#針頭將有機相緩慢地注入水相中，繼續(xù)攪拌，將體系濃縮至10ml，將該體系迅速傾入1000rpm攪拌的0～2℃固化水相中，固化0.5h，定容至15ml，即得冰片化學修飾載葛根總黃酮固體脂質(zhì)納米粒(ptf-bo-sa-slns)，見圖1b。

實施例3

以30ml0.1％poloxamer188水溶液為水相，硬脂酸(75mg)、bo(30mg)、磷脂e80(225mg)和ptf(60mg)溶解于10ml甲醇為有機相，將兩相均置于(75±2)℃條件下預熱。在1200rpm攪拌下，用5#針頭將有機相緩慢地注入水相中，繼續(xù)攪拌，將體系濃縮至10ml，將該體系迅速傾入1200rpm攪拌的0～2℃固化水相(2ml0.5％poloxamer188水溶液)中，固化0.5h，定容至15ml，即得冰片物理修飾載葛根總黃酮固體脂質(zhì)納米粒ptf-bo-slns，見圖1a。

實施例4

將28mg材料(bo-plga-mpeg：plga-mpeg＝1：20,w/w)加至1ml含有丹參酮(1.4mg)的二氯甲烷溶液中溶解完全后，加入50μl的超純水，探針超聲30s(210w)，再加入1％的膽酸鈉2ml，探針超聲1min(間斷2s)(210w)，最后加至20ml的0.5％膽酸鈉中，磁力攪拌30min，旋蒸除去有機溶劑，即得冰片化學修飾載丹參酮iia聚乙二醇聚乳酸納米粒，見圖1c。

實施例5

將28mg材料(as-plga-mpeg：plga-mpeg＝1：20,w/w)加至1ml含有丹參酮(1.4mg)的二氯甲烷溶液中溶解完全后，加入50μl的超純水，探針超聲30s(210w)，再加入1％的膽酸鈉2ml，探針超聲1min(間斷2s)(210w)，最后加至20ml的0.5％膽酸鈉中，磁力攪拌30min，旋蒸除去有機溶劑，即得β-細辛醚化學修飾載丹參酮iia聚乙二醇聚乳酸納米粒，見圖1d。

實施例6

將材料(28mgas-plga-mpeg和5.0μg冰片氨)加至1ml含有丹參酮(1.4mg)的二氯甲烷溶液中溶解完全后，加入50μl的超純水，探針超聲30s(210w)，再加入1％膽酸鈉2ml，探針超聲1min(間斷2s)(210w)，最后加至20ml的0.5％膽酸鈉中，磁力攪拌30min，旋蒸除去有機溶劑，即得物理修飾法制備的冰片修飾載丹參酮iia聚乙二醇聚乳酸納米粒，見圖1e。

實施例7

將材料(28mgbo-plga-mpeg和6.0μg氨基細辛醚)加至1ml含有丹參酮(1.4mg)的二氯甲烷溶液中溶解完全后，加入50μl的超純水，探針超聲30s(210w)，再加入1％膽酸鈉2ml，探針超聲1min(間斷2s)(210w)，最后加至20ml的0.5％膽酸鈉中，磁力攪拌30min，旋蒸除去有機溶劑，即得物理修飾法制備的β-細辛醚修飾載丹參酮iia聚乙二醇聚乳酸納米粒，見圖1f。

實施例8

將聚合物材料以bo-peg-plga：nhs-peg-plga：mpeg-plga＝1:1:8(w/w)的比例溶解于含有0.75mg/ml多西紫杉醇的乙腈溶液，逐滴加入2ml雙蒸水，1200rpm攪拌1h后旋轉蒸發(fā)即得化學修飾法制備的冰片修飾載多西紫杉醇聚乙二醇聚乳酸納米粒，見圖1h。

實施例9

將聚合物材料以bo-peg-plga：nhs-peg-plga：mpeg-plga＝1:1:8(w/w)的比例溶解于含有0.75mg/ml多西紫杉醇的乙腈溶液，逐滴加入2ml雙蒸水，1200rpm攪拌1h后旋轉蒸發(fā)，加入1mg/mlrgd30μl，攪拌9h，即得化學修飾法制備的冰片，rgd肽共修飾載多西紫杉醇聚乙二醇聚乳酸納米粒，見圖1g。

實施例10

將ptf-bo-sa-slns、ptf-bo-slns、ptf-slns和ptf原料藥(含ptf3mg/ml)，在漏槽條件下，分別加入50ml37℃anf和5％血漿，將介質(zhì)提前在50rpm下預熱。三種制劑(ptf-bo-sa-slns、ptf-bo-slns、ptf-slns)和ptf原料藥，每種分為6份，分別裝入透析袋中，其中3份加入人工鼻液中、另外3份加入5％血漿中，于37℃、50rpm的恒溫水浴振蕩器中。在設定時間點(0.083h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h和12h)取樣，每次取出1ml樣品，并且補充1ml的37℃同種新鮮介質(zhì)。用hplc測定樣品中pue的峰面積，通過標準曲線計算出ptf濃度，得到幾種修飾后slns的體外釋放曲線圖，見圖4。

通過圖4可以看出，引經(jīng)藥修飾后并不改變納米粒的緩釋特性，修飾后的納米粒依然具有較好的緩釋效果。

實施例11

16hbe細胞，按照10⁵個/ml的密度接種至24孔板中，培養(yǎng)一天，吸去培養(yǎng)液，加入hbss平衡液(37℃，1ml/孔)預先孵育15min后，棄去hbss平衡液后，加入用hbss稀釋后的載香豆素的未修飾(coumarin-6-np)，物理修飾(bo-loaded-coumarin-6-np，as-loaded-coumarin-6-np)和化學修飾(bo-coumarin-6-np、as-coumarin-6-np)的納米粒，考察不同修飾方法、對16hbe攝取納米粒的影響。以“攝取指數(shù)(uptakeindex)”作為評價指標，即藥物濃度與細胞蛋白濃度的比值，表示單位濃度細胞蛋白中所含有的藥物濃度，結果見圖2。

圖2表明，不同修飾方法修飾后的納米?？梢燥@著提高16hbe細胞對其的攝取。

實施例12

sd大鼠鼻腔給予載ptfslns(100μl，含ptf317.5μg)。給藥后，于0.5h、1h、2h、4h和8h處理取腦以質(zhì)譜測定腦內(nèi)ptf含量，考察不同修飾方法納米遞藥系統(tǒng)的腦內(nèi)遞藥特性，結果見圖3。

圖3表明，冰片修飾后的納米?？梢燥@著提高其所包載葛根總黃酮的入腦量。

實施例13

取雄性sd大鼠，鼻腔給予40μg/ml游離coumarin-6(圖5，d)或含同等劑量coumarin-6的未修飾(圖5，c)，物理(圖5，b)及化學(圖5，a)修飾bo的納米粒50μl。于給藥后1h處死大鼠，分離大腦，4％多聚甲醛固定。經(jīng)pbs漂洗，蔗糖溶液脫水，經(jīng)o.c.t.包埋后，冰凍切片(片厚10μm)，用1μg/mldapi進行染色，再用pbs漂洗，磷酸甘油封片。激光共聚焦顯微鏡觀察切片中coumarin-6熒光信號，并拍照記錄。由圖5可知，給藥1h后，腦組織切片中coumarin-6熒光信號以coumarin-6-bo-sa-slns較強，其次是coumarin-6-bo-slns組，原料藥組最弱。冰片修飾后的納米?？梢燥@著提高其所包載藥物的入腦量。

實施例14

大鼠在腦缺血2h再灌注24h后，進行麻醉，直接取腦，自大腦縱裂將腦切開。將左半腦秤重，按照1∶9(w/v)比例加入冰冷的生理鹽水，從而制備成10％的腦組織勻漿液，以2500rpm，離心10min后，取其上清液，于-20℃低溫冰箱保存，用作mda含量測定。結果(見圖6)表明模型組和tsa-np組相比差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。與tsa-np組比較，bo-tsa-np組和as-tsa-np組的腦組織mda含量均顯著下降(p<0.01)，提示引經(jīng)藥修飾納米粒能促進丹參酮ⅱa使腦缺血再灌注大鼠的腦組織過氧化程度受到明顯抑制，對于大鼠腦缺血再灌注損傷具有很好的保護作用。