本發(fā)明涉及一種羧甲基殼聚糖的新用途，具體涉及羧甲基殼聚糖在制備或篩選用于提高免疫力的產(chǎn)品中的用途。

背景技術(shù)：

羧甲基殼聚糖是一種水溶性殼聚糖衍生物，有許多特性，如抗菌性強(qiáng)，具有保鮮作用，是一種兩性聚電解質(zhì)等。在化妝品、保鮮、醫(yī)藥等方面有多種應(yīng)用，也是近年來研究得較多的殼聚糖衍生物之一。

羧甲基甲殼素的羧甲基是在糖殘基的c6-oh上發(fā)生取代，有少量羧甲基在c3-oh上發(fā)生取代，生成的是o-羧甲基甲殼素。殼聚糖中，羧甲基既會(huì)在-oh上發(fā)生取代，也會(huì)在-nh上發(fā)生取代，生成o-羧甲基和n-羧甲基殼聚糖，實(shí)際上的取代情況有：c6-o-羧甲基、c2-n-羧甲基、c3-o-羧甲基、c6-o、c2-n-羧甲基等。由于c3上的位阻效應(yīng)以及c2和c3之間的分子內(nèi)氫鍵，使c3位上的羧甲基化比較難發(fā)生，所以羥基上的羧甲基取代，c3-o羧甲基較少一些，而以c6-o羧甲基為主。對(duì)于c6-oh與c2-nh來說，在堿性條件下羧甲基在羥基上的取代活性要高于氨基，因此，當(dāng)取代度小于1時(shí)，羧甲基的取代主要是在羥基上而不是氨基上，只有取代度接近1和高于1時(shí)，才會(huì)同時(shí)在氨基上發(fā)生羧甲基取代，形成o,n-羧甲基殼聚糖。羧甲基殼聚糖的水溶性，除了因?yàn)樗且环N羧酸鈉鹽而溶于水外，還有一個(gè)原因是羧甲基的導(dǎo)入，破壞了殼聚糖分子的二次結(jié)構(gòu)，使其結(jié)晶度大大降低，幾乎成為無定形。

現(xiàn)有技術(shù)中公開了羧甲基殼聚糖具有吸濕、保濕、抑菌的用途，但并沒有公開其具有提高免疫力的用途。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種羧甲基殼聚糖的新用途。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的或者其他目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

本發(fā)明公開了一種羧甲基殼聚糖在制備或篩選用于提高免疫力的產(chǎn)品中的用途。

具體地，所述羧甲基殼聚糖為o-羧甲基脫乙酰殼多糖。所述o-羧甲基脫乙酰殼多糖為羧甲基甲殼素脫乙?；蠡驓ぞ厶堑?-羥基氫被羧甲基取代后的部分羧甲基化的脫乙酰殼多糖。

更為具體地，所述o-羧甲基脫乙酰殼多糖的結(jié)構(gòu)式如下所示：

其中r1為ch2coona；r2為ch2coona或h；r3為ch2coona或h或coch3。

現(xiàn)有技術(shù)中羧甲基殼聚糖的種類很多，但是并不是所有的羧甲基殼聚糖具有治療皮膚瘙癢的效果。具體地，所述羧甲基殼聚糖的數(shù)均分子量為1000～20000。所述數(shù)均分子量是按照《中華人民共和國藥典(四部)》(2015年版)通則0401“紫外-可見分光光度法”方法測(cè)定a525。其原理為：乙酰丙酮試劑與標(biāo)準(zhǔn)氨基葡萄糖、羧甲基脫乙酰殼多糖或其水解液的還原性端基反應(yīng)產(chǎn)生色原；一定條件下，吸光度a525與相應(yīng)糖的摩爾濃度具有線性關(guān)系。水解后比水解前增加的還原性端基的倍數(shù)就是該羧甲基脫乙酰殼多糖的平均聚合度n，結(jié)合分子中糖單元平均分子質(zhì)量可以計(jì)算出該糖的數(shù)均分子質(zhì)量。

優(yōu)選地，所述羧甲基殼聚糖為o-羧甲基脫乙酰聚多糖；所述羧甲基殼聚糖的數(shù)均分子量為221～20000。更優(yōu)選地，所述羧甲基殼聚糖的數(shù)均分子量為1000～20000。

優(yōu)選地，所述羧甲基殼聚糖的制備方法包括將數(shù)均分子量較高的羧甲基殼聚糖原料通過雙氧水降解、酶解或酸解。優(yōu)選地，所述數(shù)均分子量較高的羧甲基殼聚糖原料中羧甲基殼聚糖的數(shù)均分子量30～70萬。更優(yōu)選地，所述數(shù)均分子量較高的羧甲基殼聚糖原料中羧甲基殼聚糖的數(shù)均分子量20～130萬。

優(yōu)選地，所述用途包括以下特征中的一種或多種：

所述數(shù)均分子量較高的羧甲基殼聚糖原料中羧甲基取代度為0.8～1.3；

所述數(shù)均分子量較高的羧甲基殼聚糖原料中羧甲基o位取代度為0.7～1.3，n位取代度不

超過0.3；

雙氧水降解的工藝為：將雙氧水在攪拌條件下加入數(shù)均分子量較高的羧甲基殼聚糖中進(jìn)

行降解反應(yīng)，降解反應(yīng)過程中加堿使得反應(yīng)體系的ph為8.0～8.5，直至反應(yīng)體系的粘度

為80～120cp時(shí)加入亞硫酸鈉停止反應(yīng)；

所述羧甲基殼聚糖的制備方法包括對(duì)雙氧水降解后的羧甲基殼聚糖進(jìn)行酸析洗滌。

更優(yōu)選地，降解反應(yīng)中，反應(yīng)溫度為25～45℃。由上述降解反應(yīng)即獲得降解后的羧甲基殼聚糖。

優(yōu)選地，所述酸析洗滌是指用酸調(diào)整雙氧水降解后的羧甲基殼聚糖料體至ph為6～7，加入乙醇至淡黃色晶體析出，再用酒精反復(fù)洗滌，甩干，干燥獲得羧甲基殼聚糖。

所述數(shù)均分子量較高的羧甲基殼聚糖原料為由國內(nèi)申請(qǐng)?zhí)枮?013105362023的發(fā)明專利公開的方法制備獲得，其公開了一種制備羧甲基殼聚糖的方法，所述的方法是以甲殼素為原料，先將甲殼素堿化，使用冷熱交替法進(jìn)行脫乙?；磻?yīng)，生產(chǎn)殼聚糖鈉鹽，再在堿性條件下進(jìn)行羧化反應(yīng)，獲得數(shù)均分子量較高的羧甲基殼聚糖產(chǎn)品。本發(fā)明方法工藝簡單且易于控制，避免了殼聚糖分子鏈脫乙?；磻?yīng)時(shí)因長期高溫反應(yīng)出現(xiàn)的斷鏈現(xiàn)象，從而獲得了一種高粘度、高取代度和水溶性更好的羧甲基殼聚糖，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。所述分子量較高的羧甲基殼聚糖溶解的ph范圍為4.5～14.0。所述的數(shù)均分子量較高的羧甲基殼聚糖可以溶解在ph為4.5～6.5的酸性溶液中。與傳統(tǒng)工藝獲得的羧甲基殼聚糖溶解的ph范圍為7.0～14.0相比，上述專利方法獲得的數(shù)均分子量較高的羧甲基殼聚糖溶解的ph范圍更寬，拓寬了其應(yīng)用領(lǐng)域。

本發(fā)明還公開了一種用于提高免疫力的組合物，所述組合物的原料組分包括羧甲基殼聚糖，所述組合物包括以下原料組分及重量份：

本發(fā)明還公開了一種如上述所述組合物的制備方法，包括如下步驟：將各原料組分干燥后粉碎過網(wǎng)篩獲得，然后混合均勻后裝入膠囊中獲得膠囊制劑。

優(yōu)選地，所述過網(wǎng)篩為過60～100目網(wǎng)篩。更優(yōu)選地，所述過網(wǎng)篩為過60～80目網(wǎng)篩。

優(yōu)選地，所述干燥的溫度為20～35℃，干燥至顆粒水分含量低于1.5％。

本發(fā)明還公開了如上述所述組合物在制備或篩選提高免疫力的藥物中的用途。

本申請(qǐng)中所采用的羧甲基殼聚糖溶解的ph范圍為4.5～14.0；人體攝入本申請(qǐng)中的羧甲基殼聚糖后，由于其能夠很好的溶于水和血液中，在胃中ph＜4.5的酸性環(huán)境下是絮狀物，不溶解，則羧甲基殼聚糖在胃中酸性條件下并沒有被破壞，達(dá)到小腸之后在小腸內(nèi)ph≥8開始被吸收，從而可以進(jìn)入血液，其在血液和體液的堿性條件下溶解性能好，此時(shí)能夠很好發(fā)揮其生物活性，羧甲基殼聚糖可以作為保健品長期服用，其對(duì)于人體高血壓疾病有很好的預(yù)防效果和提高免疫力效果。本發(fā)明中還公開了將其與其他物質(zhì)組合形成組合物形成一種提高免疫力的藥片；這種藥片含有環(huán)糊精作為吸收促進(jìn)劑、以海藻酸鈉作為粘結(jié)劑和崩解劑與具有提高免疫力效果又易于崩解的羧甲基殼聚糖共同作用使得最終獲得的組合物具有更好的提高免疫力效果；其也可以與其他的提高免疫力藥聯(lián)合使用，大大減少通常提高免疫力西藥的使用量和副作用，而且治療效果明顯，可顯著地減緩或消除其他并發(fā)癥。

具體實(shí)施方式

以下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或者按照各制造商所建議的條件。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

實(shí)施例1

本實(shí)施例中為制備數(shù)均分子量為2000的羧甲基殼聚糖。

采用數(shù)均分子量較高的羧甲基殼聚糖原料用雙氧水降解，所述數(shù)均分子量較高的羧甲基殼聚糖原料的數(shù)均分子量為30w、羧甲基取代度為0.8～1.3，其中，o為羧甲基取代度為0.7～1.0，n位取代度不超過0.3。

雙氧水降解的工藝為：將雙氧水在攪拌條件下加入數(shù)均分子量較高的羧甲基殼聚糖中進(jìn)行降解反應(yīng)，降解反應(yīng)過程中加堿使得反應(yīng)體系的ph為8.0，直至反應(yīng)體系的粘度為80～120cp時(shí)加入亞硫酸鈉停止反應(yīng)，本實(shí)施例中當(dāng)粘度達(dá)到88cp時(shí)停止反應(yīng)。降解反應(yīng)中，反應(yīng)溫度為室溫。

所述羧甲基殼聚糖的制備方法包括對(duì)雙氧水降解后的羧甲基殼聚糖進(jìn)行酸析洗滌。所述酸析洗滌是指用酸調(diào)整雙氧水降解后的羧甲基殼聚糖料體至ph為6.5，加入乙醇至淡黃色晶體析出，再用酒精反復(fù)洗滌，甩干，干燥獲得羧甲基殼聚糖。

實(shí)施例2

本實(shí)施例中采用數(shù)均分子量為8000的羧甲基殼聚糖。

采用數(shù)均分子量較高的羧甲基殼聚糖原料用雙氧水降解，所述數(shù)均分子量較高的羧甲基殼聚糖原料的數(shù)均分子量為40w、羧甲基取代度為0.8～1.3，其中，o為羧甲基取代度為0.7～1.0，n位取代度不超過0.3。

雙氧水降解的工藝為：將雙氧水在攪拌條件下加入數(shù)均分子量較高的羧甲基殼聚糖中進(jìn)行降解反應(yīng)，降解反應(yīng)過程中加堿使得反應(yīng)體系的ph為8.5，直至反應(yīng)體系的粘度為100cp時(shí)加入亞硫酸鈉停止反應(yīng)。降解反應(yīng)中，反應(yīng)溫度為室溫。

所述羧甲基殼聚糖的制備方法包括對(duì)雙氧水降解后的羧甲基殼聚糖進(jìn)行酸析洗滌。所述酸析洗滌是指用酸調(diào)整雙氧水降解后的羧甲基殼聚糖料體至ph為6，加入乙醇至淡黃色晶體析出，再用酒精反復(fù)洗滌，甩干，干燥獲得羧甲基殼聚糖。

實(shí)施例3

本實(shí)施例中采用數(shù)均分子量為15000的羧甲基殼聚糖。

采用數(shù)均分子量較高的羧甲基殼聚糖原料用雙氧水降解，所述數(shù)均分子量較高的羧甲基殼聚糖原料的數(shù)均分子量為55w、羧甲基取代度為0.8～1.3，其中，o為羧甲基取代度為0.7～1.0，n位取代度不超過0.3。

雙氧水降解的工藝為：將雙氧水在攪拌條件下加入數(shù)均分子量較高的羧甲基殼聚糖中進(jìn)行降解反應(yīng)，降解反應(yīng)過程中加堿使得反應(yīng)體系的ph為8.5，直至反應(yīng)體系的粘度為90cp時(shí)加入亞硫酸鈉停止反應(yīng)。降解反應(yīng)中，反應(yīng)溫度為室溫。

所述羧甲基殼聚糖的制備方法包括對(duì)雙氧水降解后的羧甲基殼聚糖進(jìn)行酸析洗滌。所述酸析洗滌是指用酸調(diào)整雙氧水降解后的羧甲基殼聚糖料體至ph為7，加入乙醇至淡黃色晶體析出，再用酒精反復(fù)洗滌，甩干，干燥獲得羧甲基殼聚糖。

實(shí)施例4

本實(shí)施例中采用數(shù)均分子量為20000的羧甲基殼聚糖。

采用數(shù)均分子量較高的羧甲基殼聚糖原料用雙氧水降解，所述數(shù)均分子量較高的羧甲基殼聚糖原料的數(shù)均分子量為70w、羧甲基取代度為0.8～1.3，其中，o為羧甲基取代度為0.7～1.0，n位取代度不超過0.3。

雙氧水降解的工藝為：將雙氧水在攪拌條件下加入數(shù)均分子量較高的羧甲基殼聚糖中進(jìn)行降解反應(yīng)，降解反應(yīng)過程中加堿使得反應(yīng)體系的ph為8.2，直至反應(yīng)體系的粘度為120cp時(shí)加入亞硫酸鈉停止反應(yīng)。降解反應(yīng)中，反應(yīng)溫度為室溫。

所述羧甲基殼聚糖的制備方法包括對(duì)雙氧水降解后的羧甲基殼聚糖進(jìn)行酸析洗滌。所述酸析洗滌是指用酸調(diào)整雙氧水降解后的羧甲基殼聚糖料體至ph為7，加入乙醇至淡黃色晶體析出，再用酒精反復(fù)洗滌，甩干，干燥獲得羧甲基殼聚糖。

實(shí)施例5

本實(shí)施例中采用實(shí)施例1中制備的羧甲基殼聚糖形成提高免疫力組合物。

所述組合物包括以下原料組分及重量份：

將各原料組分干燥后粉碎過網(wǎng)篩，然后混合均勻后裝入膠囊中獲得膠囊制劑。所述過篩為過60～100目網(wǎng)篩。所述干燥的溫度為35℃，干燥至顆粒水分含量低于1.5％。

實(shí)施例6

本實(shí)施例中采用實(shí)施例1中制備的羧甲基殼聚糖形成提高免疫力組合物。

所述組合物包括以下原料組分及重量份：

將各原料組分干燥后粉碎過網(wǎng)篩，然后混合均勻后裝入膠囊中獲得膠囊制劑。所述過篩為過80目網(wǎng)篩。所述干燥的溫度為20℃，干燥至顆粒水分含量低于1.5％。

實(shí)施例7

本實(shí)施例中采用實(shí)施例1中制備的羧甲基殼聚糖形成提高免疫力組合物。

所述組合物包括以下原料組分及重量份：

將各原料組分干燥后粉碎過網(wǎng)篩，然后混合均勻后裝入膠囊中獲得膠囊制劑。所述過篩為過80目網(wǎng)篩。所述干燥的溫度為30℃，干燥至顆粒水分含量低于1.5％。

實(shí)施例8

本實(shí)施例中采用實(shí)施例1中制備的羧甲基殼聚糖形成提高免疫力組合物。

所述組合物包括以下原料組分及重量份：

將各原料組分干燥后粉碎過網(wǎng)篩，然后混合均勻后裝入膠囊中獲得膠囊制劑。所述過篩為過80～100目網(wǎng)篩。所述干燥的溫度為25℃，干燥至顆粒水分含量低于1.5％。

將實(shí)施例5～8中制備的羧甲基殼聚糖作為試驗(yàn)樣品進(jìn)一步闡釋本發(fā)明所述保健品的提高免疫力效果。

實(shí)驗(yàn)組選擇大鼠，9～10周齡，體重為170～190g，雌雄兼購200只，每個(gè)劑量組10只。

實(shí)驗(yàn)設(shè)有采用實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例5、實(shí)施例6、實(shí)施例7、實(shí)施例8中的提高免疫力藥物的實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)空白對(duì)照組。

其中實(shí)施例1和實(shí)施例2中，以成人推薦量每日口服600mg/d，按照成人60kg體重計(jì)算，即10mg/(kg體重)，給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以10mg/(kg體重)的5倍、10倍、15倍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察，給予時(shí)間共4周；對(duì)照組采用空白對(duì)照。

實(shí)施例5、實(shí)施例6、實(shí)施例7和實(shí)施例8中，按照每個(gè)成年人每次服用2粒，每日需服用2次，2×2×(2粒膠囊中藥物的重量)，按照成年人體重60kg換算，給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以(2粒膠囊中藥物的重量)/15的1倍和5倍，每天攝入兩次，兩次攝入相同劑量。

具體結(jié)果見表1，其中表1中：

實(shí)施例1-1為每天采用實(shí)施例1中物質(zhì)給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以10mg/(kg體重)的5倍的劑量；

實(shí)施例1-2為每天采用實(shí)施例1中物質(zhì)給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以10mg/(kg體重)的10倍的劑量；

實(shí)施例1-3為每天采用實(shí)施例1中物質(zhì)給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以10mg/(kg體重)的15倍的劑量；

實(shí)施例2-1為每天采用實(shí)施例2中物質(zhì)給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以10mg/(kg體重)的5倍的劑量；

實(shí)施例2-2為每天采用實(shí)施例2中物質(zhì)給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以10mg/(kg體重)的10倍的劑量；

實(shí)施例2-3為每天采用實(shí)施例2中物質(zhì)給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以10mg/(kg體重)的15倍的劑量；

實(shí)施例5-1為每天采用實(shí)施例5中物質(zhì)給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以10mg/(kg體重)的1倍的劑量；

實(shí)施例5-2為每天采用實(shí)施例5中物質(zhì)給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以10mg/(kg體重)的5倍的劑量；

實(shí)施例6-1為每天采用實(shí)施例6中物質(zhì)給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以10mg/(kg體重)的1倍的劑量；

實(shí)施例6-2為每天采用實(shí)施例6中物質(zhì)給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以10mg/(kg體重)的5倍的劑量；

實(shí)施例7-1為每天采用實(shí)施例7中物質(zhì)給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以10mg/(kg體重)的1倍的劑量；

實(shí)施例7-3為每天采用實(shí)施例7中物質(zhì)給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以10mg/(kg體重)的5倍的劑量；

實(shí)施例8-1為每天采用實(shí)施例8中物質(zhì)給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以10mg/(kg體重)的1倍的劑量；

實(shí)施例8-2為每天采用實(shí)施例8中物質(zhì)給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以10mg/(kg體重)的5倍的劑量。

由表1中可以看出：將給予大鼠不同計(jì)量的本發(fā)明中的羧甲基殼聚糖及尤其形成的組合物，與對(duì)照組相比，采用本申請(qǐng)中的藥物的高劑量組可以提高大鼠免疫力(p＜0.05)。給予大鼠不同計(jì)量的提高免疫力功能的制品第四周，與空白對(duì)照組相比，所述實(shí)施例5～8中的組合物形成的片劑能夠更好的提高大鼠免疫力(p＜0.05)。

1)cona誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(mtt法)

無菌取脾，置于盛有適量無菌hank’s液的培養(yǎng)皿中，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾。用hank’s液洗2次，每次離心10分鐘(1000r/min)。然后將細(xì)胞懸浮于1ml完全培養(yǎng)液匯總，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，用rpmi1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/ml。再將細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，沒孔1ml，在其中一孔加75μlcona液，另一孔作為對(duì)照，置于5％二氧化碳，30℃培養(yǎng)72h。在培養(yǎng)結(jié)束前。每孔吸去上清液0.5ml，加入0.5ml不含小牛血清的rpmi1640培養(yǎng)液，同時(shí)加入mtt(5mg/ml)5μl/孔。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1ml酸性異丙醇，吹打混勻，使得紫色結(jié)晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔作3個(gè)平行孔，用酶標(biāo)儀，以570nm波長測(cè)定光密度值。淋巴細(xì)胞的增殖能力用加cona孔的光密度值減去不加cona孔的光密度值表示。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

2)抗體生成細(xì)胞檢測(cè)(jerne改良玻片法)

取羊血用生理鹽水洗滌，并進(jìn)行離心，將壓積srbc用生理鹽水配成2％(v/v)的細(xì)胞懸液，過200目網(wǎng)篩、洗滌、離心，最后將細(xì)胞懸浮在8mlhanks液中。計(jì)數(shù)細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×106個(gè)/ml。將表層培養(yǎng)基加熱溶解后與等量的ph為7.1,2倍濃度的hanks液混合，分裝小試管，每管0.5ml，再向管內(nèi)加入用sa液配制的10％srbc50μl(v/v)、20μl脾細(xì)胞懸液(5×106個(gè)/ml)，迅速混勻后傾倒于已刷薄層瓊脂糖的玻片上，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中溫育1.5h，將用sa液稀釋的補(bǔ)體(1:8)加入到玻片凹槽內(nèi)繼續(xù)溫育1.5h后計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)。具體結(jié)果如表2所示。

表1

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明任何形式上和實(shí)質(zhì)上的限制，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還將可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容而做出的些許更動(dòng)、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實(shí)施例；同時(shí)，凡依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對(duì)上述實(shí)施例所作的任何等同變化的更動(dòng)、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。