本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及缺血缺氧環(huán)境下丹參酚酸b抑制ipscs凋亡的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

具備多向分化能力的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells，ipscs)是治療心肌梗死的理想種子細(xì)胞，但心梗后局部缺血缺氧微環(huán)境限制了其應(yīng)用。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，丹參可降低血液粘稠度，降壓，擴(kuò)血管，降血脂，抗動(dòng)脈粥樣硬化，加強(qiáng)心肌收縮力，減輕心肌缺血損傷，促進(jìn)心肌修復(fù)等功能。有學(xué)者應(yīng)用膜刮鉗技術(shù)證實(shí)丹參素能激活心肌內(nèi)向整流鉀通道，使其開(kāi)放概率和開(kāi)放數(shù)量增加，從而保護(hù)心肌。此外，丹參還有抑制細(xì)胞膜上nadh/nadph氧化酶激活、清除氧自由基并抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、抑制血管緊張素ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥大，保護(hù)心肌和血管內(nèi)皮細(xì)胞。丹參酚酸b作為丹參有效單體成份之一，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

目前尚無(wú)丹參酚酸b抑制氯化鈷預(yù)處理的ipscs凋亡方面的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種缺血缺氧環(huán)境下丹參酚酸b抑制ipscs凋亡的應(yīng)用。

目前尚無(wú)丹參酚酸b對(duì)提高ipscs缺血缺氧環(huán)境下耐受方面的研究，我們開(kāi)展了相關(guān)的前期研究，研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)牡⒎铀醔可有效提高ipscs對(duì)缺血缺氧微環(huán)境的耐受。本發(fā)明提供一種有效保護(hù)ipscs的藥物。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明提供缺血缺氧環(huán)境下丹參酚酸b抑制ipscs凋亡的應(yīng)用。

所述的丹參酚酸b的濃度為1～100μmol/l；優(yōu)選為10～100μmol/l。

所述的丹參酚酸b可有效增強(qiáng)ipscs增殖能力。

通過(guò)600μmol/l氯化鈷預(yù)處理ipscs12h，模擬心肌梗死后缺血缺氧環(huán)境，輔以不同濃度的丹參酚酸b(1、10、100μmol/l)處理24h后，ldh釋放檢測(cè)試劑盒westernblots證實(shí)丹參酚酸b可有效抑制ipscs凋亡蛋白(bax、casepase3、casepase9、cyt-c)表達(dá)，增加增殖相關(guān)蛋白(p-akt、p-enos、blc-2、blc-x)的表達(dá)，減少ldh的釋放。

本發(fā)明的機(jī)理是：本申請(qǐng)通過(guò)丹參酚酸b(salvianolicacidb，salb)干預(yù)氯化鈷預(yù)處理的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells，ipscs)，觀察丹參酚酸b對(duì)缺血缺氧誘導(dǎo)預(yù)處理的ipscs的保護(hù)作用。急性心肌梗死后心肌易缺血缺氧，心肌細(xì)胞受損纖維化后心臟功能下降。ipscs具有多向分化能力，能有效分化為心肌細(xì)胞，有效提高ipscs抗缺血缺氧能力在預(yù)防和治療心肌損傷相關(guān)心血管疾病(如缺血性心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓)等方面有廣闊的應(yīng)用前景。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

本發(fā)明通過(guò)丹參酚酸b干預(yù)氯化鈷預(yù)處理的ipscs凋亡，并通過(guò)ldh釋放檢測(cè)試劑盒和westernblots證實(shí)丹參酚酸b可有效減少ldh的釋放，抑制ipscs凋亡蛋白(bax、casepase3、casepase9、cyt-c)表達(dá)，增加增殖相關(guān)蛋白(p-akt、p-enos、blc-2、blc-x)的表達(dá)，且akt阻斷劑可有效阻斷丹參酚酸b對(duì)凋亡蛋白以及增殖蛋白的調(diào)節(jié)，證實(shí)丹參酚酸b主要通過(guò)akt信號(hào)途徑干預(yù)細(xì)胞的增殖凋亡。

附圖說(shuō)明

圖1是ldh釋放檢測(cè)分析。

圖2是凋亡蛋白表達(dá)情況分析(bax、casepase3、casepase9、cyt-c)。

圖3是增殖蛋白表達(dá)情況分析(p-akt、p-enos、blc-2、blc-x)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件或按照制造廠商所建議的實(shí)驗(yàn)條件。未注明具體來(lái)源的試劑及生物材料，均為市售產(chǎn)品。

實(shí)施例1制備ipscs

(1)滋養(yǎng)層(mef)的制備：0.1％(體積分?jǐn)?shù))的明膠加入t25培養(yǎng)瓶，搖勻覆蓋即可，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置20min后將其吸除，加入5～6ml預(yù)熱37℃的mef培養(yǎng)液，與此同時(shí)將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mef)(購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù))從液氮中快速取出，置于37℃水浴中快速融解并立即用體積分?jǐn)?shù)為75％的酒精擦拭凍存管后拿到超凈臺(tái)內(nèi)，將凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含mef培養(yǎng)液的15ml離心管內(nèi)，以1000rpm離心5min，棄上清液重懸后加入到t25培養(yǎng)瓶中，放置到co2恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h后得到滋養(yǎng)層即可加入ipscs；

(2)ipscs的培養(yǎng)以及傳代：步驟(1)中培養(yǎng)24h后得到的滋養(yǎng)層，4倍顯微鏡下可見(jiàn)已經(jīng)均勻鋪滿t25培養(yǎng)瓶，此時(shí)可迅速?gòu)囊旱腥〕鰅pscs(中科院上海生科院生化細(xì)胞所和中科院上海生科院生化細(xì)胞所干細(xì)胞平臺(tái)提供)凍存管，復(fù)蘇過(guò)程類似小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，將復(fù)蘇的ipscs直接傳入mef鋪板的t25培養(yǎng)瓶，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，每日換液并且觀察細(xì)胞集落形態(tài)的變化。待細(xì)胞集落長(zhǎng)到合適大小及時(shí)傳代，pbs(不含鈣鎂離子)輕輕沖洗一遍后加入0.25％(體積分?jǐn)?shù))胰酶(含edta)消化，小鼠ipscs培養(yǎng)液終止消化，以1000rpm離心5min，棄上清加培養(yǎng)液吹打制備成單細(xì)胞懸液。

實(shí)施例2氯化鈷以及丹參酚酸b預(yù)處理ipscs

ipscs接種于6孔板(1×10⁴/孔)，600μmol/l氯化鈷預(yù)處理ipscs12h，模擬心肌梗死后缺血缺氧環(huán)境，輔以不同濃度的丹參酚酸b(1、10、100μmol/l)處理24h后，再給予適當(dāng)?shù)腶kt信號(hào)阻斷劑ly294002(10、50、100μmol/l)30min處理。

實(shí)施例3乳酸脫氫酶釋放(lactatedehydrogenasereleaseassay，ldh)檢測(cè)

分組：對(duì)照組(ipscs細(xì)胞)；cocl2組；cocl2+salb100mol/l組；cocl2+salb10μmol/l組；cocl2+salb1μmol/l組；salb100μmol/l組；salb10μmol/l組；salb1μmol/l組。cocl2為600μmol/l、12h；salb處理時(shí)間為24h。

適量ipscs接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使待檢測(cè)時(shí)細(xì)胞密度不超過(guò)80～90％滿。吸去培養(yǎng)液后pbs液洗滌一次。換新鮮培養(yǎng)液(無(wú)血清培養(yǎng)液)，600μmol/l氯化鈷預(yù)處理ipscs12h，模擬心肌梗死后缺血缺氧環(huán)境，輔以不同濃度的丹參酚酸b(1、10、100μmol/l)處理24h后處理后，利用乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，到預(yù)定的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)前1小時(shí)，從細(xì)胞培養(yǎng)箱里取出細(xì)胞培養(yǎng)板，加入試劑盒中提供的ldh釋放試劑，加入量為原有培養(yǎng)液體積的10％。加入

ldh釋放試劑后，反復(fù)吹打數(shù)次混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，到達(dá)預(yù)定時(shí)間后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。分別取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測(cè)定。

ldh釋放檢測(cè)分析，結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明：600μmol/l氯化鈷顯著增加ipscs乳酸脫氫酶的釋放，但1～100μmol/l濃度的丹參酚酸b均可有效阻斷氯化鈷的效應(yīng)；而丹參酚酸b單獨(dú)預(yù)處理ipscs，對(duì)其乳酸脫氫酶釋放無(wú)顯著效果。

實(shí)施例4凋亡蛋白以及增殖蛋白檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)分組：

(1)對(duì)照組(ipscs不做任何處理)；

(2)cocl2組；

(3)cocl2+salb1mol/l組；

(4)cocl2+salb10μmol/l組；

(5)cocl2+salb100μmol/l組；

(6)salb100μmol/l組；

(7)cocl2+salb100mol/l+ly29400210μmol/l組；

(8)cocl2+salb100mol/l+ly29400250μmol/l組；

(9)cocl2+salb100mol/l+ly294002100μmol/l組。

cocl2為600μmol/l、12h；salb處理時(shí)間為24h；(7)～(9)組：待cocl2處理后ly294002處理，最后再salb處理。

細(xì)胞接種至6孔板，37℃，5％co2常規(guī)條件下培養(yǎng)24h。待細(xì)胞穩(wěn)定后按各分組處理方法處理。提取各組蛋白并進(jìn)行sds-page電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜用含5％脫脂奶粉的tbst37℃封閉60min，用相應(yīng)抗體4℃孵育過(guò)夜。tbst漂洗3次后加入相應(yīng)二抗后37℃孵育60min。然后用tbst漂洗5次后檢測(cè)。采用圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算條帶與β-actin的相對(duì)積分光密度值。

凋亡蛋白表達(dá)情況分析(bax、casepase3、casepase9、cyt-c)，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明：氯化鈷可通過(guò)上調(diào)bax、casepase3、casepase9、cyt-c凋亡蛋白表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而丹參酚酸b可有效阻斷這四種凋亡蛋白的表達(dá)。1～100μmol/l丹參酚酸b濃度依賴性下調(diào)casepase9、cyt-c的表達(dá)；10～100μmol/l丹參酚酸b濃度依賴性下調(diào)bax、casepase3的表達(dá)。而10～100μmol/lakt信號(hào)阻斷劑ly294002均可有效干擾丹參酚酸b對(duì)這四種凋亡蛋白的調(diào)節(jié)，結(jié)果證實(shí)丹參酚酸b可有效抗凋亡，且與下調(diào)bax、casepase3、casepase9、cyt-c相關(guān)。

增殖蛋白表達(dá)情況分析(p-akt、p-enos、blc-2、blc-x)結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明：相比對(duì)照而言，丹參酚酸b可有效上調(diào)p-akt、p-enos、blc-2、blc-x增殖蛋白；氯化鈷則下調(diào)這四種蛋白；氯化鈷引起的blc-2蛋白的下調(diào)可被1～100μmol/l丹參酚酸b阻斷，而p-enos和blc-x只可被100μmol/l丹參酚酸b干擾，10～100μmol/l丹參酚酸b可上調(diào)p-akt。丹參酚酸b對(duì)于氯化鈷引起的凋亡均可被ly294002阻斷。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。