重組口蹄疫三價滅活疫苗及其制備方法和應用與流程
本發(fā)明涉及一種重組高效口蹄疫o型、a型、asia1型三價滅活疫苗及其制備方法和應用，屬于生物技術和生物制品領域。
背景技術：
口蹄疫(foot-and-mouthdisease，fmd)是由fmd病毒(foot-and-mouthdiseasevirus，fmdv)引起的豬、牛和羊等偶蹄動物感染的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。fmdv具有a、o、asial、c、sat1、sat2和sat3共7個不同的血清型，血清型間無交叉保護。
近年來，受我國周邊國家地區(qū)的影響，多省份口蹄疫疫情連綿不斷，o型、a型、asia1型三個血清型的不同流行毒株嚴重危害我國養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。鑒于國內(nèi)口蹄疫流行的復雜情況及口蹄疫各血清型之前無交叉免疫的現(xiàn)象，需要研制針對o型、a型和asia1型流行毒株的針對性疫苗，且要求該疫苗具備高效性，廣譜性，免疫一針能同時預防多個毒株，對國內(nèi)流行毒株都有效保護等特點，以確保我國家畜健康與安全。
反向遺傳操作技術能實現(xiàn)對病毒基因的修飾與改造，克服了從流行毒株馴化疫苗株耗時費力，抗原性差，抗體應答晚等自然屬性制約，實現(xiàn)更為主動的疫苗毒株構建和改良。因此，本研究利用已建立的具有較強細胞免疫應答毒株的反向遺傳操作系統(tǒng)為框架，制備含篩選的o型mya98毒株抗原骨架的疫苗株，聯(lián)合利用反向遺傳技術已研制成功的a型口蹄疫重組疫苗株和asia1型口蹄疫重組疫苗株，制備口蹄疫o型、a型、asia1型三價滅活疫苗，獲得生產(chǎn)性能好、抗原匹配性好，抗原譜廣，能夠同時預防o型、a型和asia1型口蹄疫，早期免疫應答提高，免疫效力強，免疫持續(xù)期長等為特征的三價疫苗。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明涉及一種口蹄疫病毒疫苗組合物、一種制備所述口蹄疫病毒疫苗組合物的方法、以及所述口蹄疫病毒疫苗組合物在制備用于預防和/或控制動物口蹄疫疾病的藥物中的用途。
一方面，本發(fā)明涉及一種口蹄疫病毒疫苗組合物。
在某些實施方式中，所述口蹄疫病毒疫苗組合物包含第一口蹄疫病毒疫苗、第二口蹄疫病毒疫苗和第三口蹄疫病毒疫苗，所述第一口蹄疫病毒疫苗包含含有第一口蹄疫重組核酸或由第一口蹄疫重組核酸編碼的第一口蹄疫病毒，所述第一口蹄疫重組核酸的序列包含非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株的核酸序列，但是非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株的核酸序列中相互毗鄰的l基因、p1基因及p2基因被口蹄疫病毒株o/jscz/2013株的核酸序列中相對應的基因片段替換，所述第二口蹄疫病毒疫苗和所述第三口蹄疫病毒疫苗為非o型的口蹄疫病毒株，并且所述第二口蹄疫病毒疫苗和所述第三口蹄疫病毒疫苗不同。
在本申請中，“非o型的口蹄疫病毒株”是指口蹄疫病毒的核酸的部分或全部不是來源于o型血清型的毒株，例如，可以是來自于a、asial、c、sat1、sat2或者sat3型的口蹄疫病毒株。
在某些實施方式中，所述o/jscz/2013株的核酸序列中相對應的基因片段與所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株的相互毗鄰的l基因、p1基因及p2基因等長或者不等長。在某些實施方式中，所述o/jscz/2013株的核酸序列中相對應的基因片段如seqidno:1所示。在某些實施方式中，所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株中被替換的l基因的序列為所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株的l基因中與p1基因相連接的至少100個連續(xù)的核苷酸序列，例如105個、110個、115個、120個、125個、130個、135個、140個、145個、150個、155個、160個、165個、170個、171個、172個、173個、174個、175個、176個、177個、178個、179個或者180個連續(xù)的核苷酸序列。在某些實施方式中，所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株中被替換的l基因的序列為所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株的l基因中與p1基因相連接的177個連續(xù)的核苷酸序列。在某些實施方式中，所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株中被替換的p2基因的序列為所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株的p2基因中與p1基因相連接的至少1000個連續(xù)的核苷酸序列，例如1050個、1100個、1150個、1200個、1201個、1202個、1203個、1204個、1205個、1206個、1207個、1208個、1209個或者1210個連續(xù)的核苷酸序列。在某些實施方式中，所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株中被替換的p2基因的序列為所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株的p2基因中與p1基因相連接的1206個連續(xù)的核苷酸序列。在某些實施方式中，所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株的l基因中與p1基因相連接的177個連續(xù)的核苷酸序列、全部p1基因、以及p2基因中與p1基因相連接的1206個連續(xù)的核苷酸序列被如seqidno:1所示的序列替換。
在某些實施方式中，所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株為o/cha/99株。
如本領域技術人員所知，在口蹄疫病毒的基因組中，l基因、p1基因和p2基因從5’端至3’端依次排列。在本申請中，“相互毗鄰的l基因、p1基因及p2基因”是指l基因的3’端與p1基因的5’端可操作地連接，p1基因的3’端與p2基因的5’端可操作地連接。
在本申請中，“l(fā)基因”是指口蹄疫病毒的基因組中l(wèi)基因的一部分或全部，例如，l基因中與p1基因相連接的至少100個連續(xù)的核苷酸序列，例如105個、110個、115個、120個、125個、130個、135個、140個、145個、150個、155個、160個、165個、170個、171個、172個、173個、174個、175個、176個、177個、178個、179個或者180個連續(xù)的核苷酸序列。
在本申請中，“p2基因”是指口蹄疫病毒的基因組中p2基因的一部分或全部，例如，p2基因中與p1基因相連接的至少1000個連續(xù)的核苷酸序列，例如1050個、1100個、1150個、1200個、1201個、1202個、1203個、1204個、1205個、1206個、1207個、1208個、1209個或者1210個連續(xù)的核苷酸序列。
在本申請中，“口蹄疫病毒株o/jscz/2013株的核酸序列中相對應的基因片段”是指口蹄疫病毒株o/jscz/2013株的基因組中相互毗鄰的l基因、p1基因及p2基因，其中l(wèi)基因可以是o/jscz/2013株l基因的全部或者一部分，p2基因可以是o/jscz/2013株p2基因的全部或者一部分。
在本申請中，“非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株”是指口蹄疫病毒的核酸的部分或全部不是來源于o/jscz/2013株的毒株，例如，可以是來自于o/cha/99株、o/gdby/2010株、a/gd/2013株及oie推薦的高效疫苗株等口蹄疫病毒株。在某些實施方式中，所述非o/jscz/2013株的口蹄疫病毒株為o/cha/99株。
在某些實施方式中，所述第一口蹄疫病毒疫苗為o型口蹄疫病毒疫苗株。在某些實施方式中，所述第一口蹄疫病毒疫苗能夠激發(fā)對o型口蹄疫病毒株的免疫活性。在某些實施方式中，所述o型口蹄疫病毒株為mya-98、panasia或cathay譜系毒株。在某些實施方式中，所述o型口蹄疫病毒株為o/by/cha/2010、o/0834或o/0718，并且所述第一口蹄疫病毒疫苗對o/by/cha/2010、o/0834或o/0718的pd50值均大于6。
在某些實施方式中，所述第二口蹄疫病毒疫苗包含a、asial、c、sat1、sat2和sat3型中任一血清型的口蹄疫病毒疫苗株。在某些實施方式中，所述第二口蹄疫病毒疫苗為a型口蹄疫病毒疫苗株。在某些實施方式中，所述第二口蹄疫病毒疫苗能夠激發(fā)對a型口蹄疫病毒株的免疫活性。在某些實施方式中，所述a型口蹄疫病毒株為sea-97g1或sea-97g2毒株。在某些實施方式中，所述a型口蹄疫病毒株為a/wh/09或a/gdmm/2013，并且所述第二口蹄疫病毒疫苗對a/wh/09和a/gdmm/2013的pd50值均大于6。在某些實施方式中，所述第二口蹄疫病毒疫苗為a型口蹄疫病毒重組疫苗株。在某些實施方式中，所述a型口蹄疫病毒重組疫苗株包含如seqidno:4所示的核酸序列。
在某些實施方式中，所述a型口蹄疫病毒重組疫苗株的基因組包含口蹄疫病毒株o/cha/99株的核酸序列，但是其中相互毗鄰的部分l基因與p1基因片段被口蹄疫病毒株a/wh/cha/09株的核酸序列中相對應的基因片段替換。在某些實施方式中，所述a/wh/cha/09株的核酸序列中相對應的基因片段與所述o/cha/99株的部分l基因與p1基因片段等長或者不等長。在某些實施方式中，所述a/wh/cha/09株的核酸序列中相對應的基因片段如seqidno:4所示。
在本申請中，“相互毗鄰的部分l基因與p1基因片段”是指部分l基因的3’端與p1基因的5’端可操作地連接。
在本申請中，“口蹄疫病毒株a/wh/cha/09株的核酸序列中相對應的基因片段”是指口蹄疫病毒株a/wh/cha/09株的基因組中相互毗鄰的l基因和p1基因片段，其中l(wèi)基因可以是a/wh/cha/09株l基因的全部或者一部分，p1基因可以是a/wh/cha/09株p1基因的全部或者一部分。
在某些實施方式中，所述第三口蹄疫病毒疫苗包含a、asial、c、sat1、sat2和sat3型中任一血清型的口蹄疫病毒疫苗株。在某些實施方式中，所述第三口蹄疫病毒疫苗為asia1型口蹄疫病毒疫苗株。在某些實施方式中，所述第三口蹄疫病毒疫苗能夠激發(fā)對asia1型口蹄疫病毒株的免疫活性。在某些實施方式中，所述asia1型口蹄疫病毒株為gv或gii毒株。在某些實施方式中，所述asia1型口蹄疫病毒株為asia1/hn/06，并且所述第三口蹄疫病毒疫苗對asia1/hn/06的pd50值大于6。在某些實施方式中，所述第三口蹄疫病毒疫苗為asia1型口蹄疫病毒重組疫苗株。在某些實施方式中，所述asia1型口蹄疫病毒重組疫苗株包含如seqidno:7所示的核酸序列。
在某些實施方式中，所述asia1型口蹄疫病毒重組疫苗株的基因組包含口蹄疫病毒株o/cha/99株的核酸序列，但是其中相互毗鄰的部分l基因與p1基因及部分p2基因片段被口蹄疫病毒株asia1/hn/06株的核酸序列中相對應的基因片段替換。在某些實施方式中，所述asia1/hn/06株的核酸序列中相對應的基因片段與所述o/cha/99株的部分l基因與p1基因及部分p2基因片段等長或者不等長。在某些實施方式中，所述asia1/hn/06株的核酸序列中相對應的基因片段如seqidno:7所示。
在本申請中，“口蹄疫病毒株asia1/hn/06株的核酸序列中相對應的基因片段”是指口蹄疫病毒株asia1/hn/06株的基因組中相互毗鄰的l基因、p1基因及p2基因片段，其中l(wèi)基因可以是asia1/hn/06株l基因的全部或者一部分，p2基因可以是asia1/hn/06株p2基因的全部或者一部分。
在某些實施方式中，所述第一口蹄疫病毒疫苗、所述第二口蹄疫病毒疫苗和所述第三口蹄疫病毒疫苗之間無免疫抑制。在本申請中，“無免疫抑制”是指所述第一口蹄疫病毒疫苗、所述第二口蹄疫病毒疫苗和所述第三口蹄疫病毒疫苗在免疫動物以后不會顯著削弱對方的免疫效果。
在某些實施方式中，所述口蹄疫病毒疫苗組合物能夠激發(fā)對o型口蹄疫病毒株的免疫活性。在某些實施方式中，所述o型口蹄疫病毒株為mya-98、panasia或cathay譜系的流行毒株。在某些實施方式中，所述o型口蹄疫病毒株為o/by/cha/2010、o/0834或o/0718，并且所述疫苗組合物對o/by/cha/2010、o/0834或o/0718的pd50值均大于6。
在某些實施方式中，所述口蹄疫病毒疫苗組合物能夠激發(fā)對a型口蹄疫病毒株的免疫活性。在某些實施方式中，所述a型口蹄疫病毒株為sea-97g1或sea-97g2毒株。在某些實施方式中，所述a型口蹄疫病毒株為a/wh/09或a/gdmm/2013，并且所述疫苗組合物對a/wh/09和a/gdmm/2013的pd50值均大于6。
在某些實施方式中，所述口蹄疫病毒疫苗組合物能夠激發(fā)對asia1型口蹄疫病毒株的免疫活性。在某些實施方式中，所述asia1型口蹄疫病毒株為gv或gii毒株。在某些實施方式中，所述asia1型口蹄疫病毒株為asia1/hn/06，并且所述疫苗組合物對asia1/hn/06的pd50值大于6。
另一方面，本發(fā)明涉及一種制備口蹄疫病毒疫苗組合物的方法，其包含如下步驟：(a)培養(yǎng)第一口蹄疫病毒疫苗株并采集；(b)培養(yǎng)第二口蹄疫病毒疫苗株并采集；(c)培養(yǎng)第三口蹄疫病毒疫苗株并采集；(d)將步驟(a)中采集的第一口蹄疫病毒疫苗株、步驟(b)中采集的第二口蹄疫病毒疫苗株和步驟(c)中采集的第三口蹄疫病毒疫苗株分別滅活后進行混合。在某些實施方式中，在混合之后再對口蹄疫病毒疫苗株進行乳化。在某些實施方式中，所述乳化是與isa206佐劑以體積比1:1進行。
在某些實施方式中，所述步驟(a)包含如下步驟：
1)、用特異性引物op12a-f和op12a-r與o/jscz/2013毒株的cdna核酸混合，以擴增得到o/jscz/2013毒株的l基因與p1基因及p2基因片段，將獲得的基因片段替換插入真核轉錄質粒pro/cha/99中，得到pro-fmdv的重組質粒，所述特異性引物分別是：
op12a-f:5'-ttttccttaagggacaggaacacgccgtgtttgcctgcgt-3'(seqidno:2)
op12a-r:5'-actcacatcgatgtcaaagtgaaaccttc-3'(seqidno:3)；
2)、用步驟1)得到的真核轉錄質粒pro-fmdv轉染口蹄疫病毒敏感細胞，獲得第一口蹄疫病毒疫苗株。
在某些實施方式中，所述o/jscz/2013毒株的l基因、p1基因及p2基因包含如seqidno:1所示的核酸序列。在某些實施方式中，所述口蹄疫病毒敏感細胞為bhk-21細胞或ibrs-2細胞。在某些實施方式中，獲得的所述第一口蹄疫病毒疫苗株的146s抗原含量為4.0μg/ml以上(146s抗原含量的測定方法如中國發(fā)明專利zl201310017378.8所述，其全文通過引用并入本申請)。在某些實施方式中，所述滅活用二乙烯亞胺進行。在某些實施方式中，在所述滅活之后對所述第一口蹄疫病毒疫苗株進行乳化。在某些實施方式中，所述乳化是與isa206佐劑以體積比1:1進行。
在某些實施方式中，所述步驟(b)包含如下步驟：
1)、用特異性引物ap1-f和ap1-r與a/wh/cha/09毒株的cdna核酸混合，以擴增得到a/wh/cha/09毒株的部分l基因與p1基因片段，將獲得的基因片段替換插入真核轉錄質粒pro/cha/99中，得到pra-fmdv的重組質粒，所述特異性引物分別是：
ap1-f：5'-ttttccttaagggacaggaacatgctgtgtttgcctgcgt-3'(seqidno:5)；
ap1-r：5'-tattttcaccggtgcaataattttctgcttgtgtctgtc-3'(seqidno:6)；
2)、用步驟1)得到的真核轉錄質粒ra-fmdv轉染口蹄疫病毒敏感細胞，獲得第二口蹄疫病毒疫苗株。
在某些實施方式中，所述第二口蹄疫病毒疫苗株包含如seqidno:4所示的核酸序列。在某些實施方式中，所述口蹄疫病毒敏感細胞為bhk-21細胞或ibrs-2細胞。在某些實施方式中，獲得的所述第二口蹄疫病毒疫苗株的146s抗原含量為4.0μg/ml以上(146s抗原含量的測定方法如中國發(fā)明專利zl201310017209.4所述，其全文通過引用并入本申請)。在某些實施方式中，所述滅活用二乙烯亞胺進行。在某些實施方式中，在所述滅活之后對所述第二口蹄疫病毒疫苗株進行乳化。在某些實施方式中，所述乳化是與isa206佐劑以體積比1:1進行。
在某些實施方式中，所述步驟(c)包含如下步驟：
1)、用特異性引物asia1p12a-f和asia1p12a-r與asia1/hn/06毒株的cdna核酸混合，以擴增得到asia1/hn/06毒株的部分l基因與p1基因和部分p2基因片段，擴增產(chǎn)物與pmd20-t載體連接過夜，連接產(chǎn)物轉化jm109感受態(tài)細胞，測序鑒定陽性克隆，獲得重組質粒命名為pmd20-asia1p12a，所述特異性引物分別是：
asia1p12a-f:5'-ttttccttaagggacaagaacatgctgtgtttgcctgtgt-3'(seqidno:8)
asia1p12a-r:5'-actcacatcgatgtcaaagtgaaacctcc-3'(seqidno:9)；
2)、以鑒定正確的重組質粒pmd20-asia1p12a為模板，用磷酸化突變引物s-p和rsd-p進行pcr擴增，在以上的磷酸化的點突變引物中，將asia1/hn/06毒株擴增序列中受體結合位點rgd點突變?yōu)閞sd，用該引物進行平末端擴增，純化回收pcr產(chǎn)物，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌jm109，測序鑒定點突變后的陽性克隆，將得到的定點突變重組質粒命名為pmd20-asia1p12a-rsd，上述5'磷酸化的點突變引物分別是：
s-p：5'-cacgcagagtgagcaaccggctgcc-3'(seqidno:10)
rsd-p：5'-cgagggcggcaagatcgctacgccgcgagg-3'(seqidno:11)；
3)、將步驟2)獲得的定點突變重組質粒pmd20-asia1p12a-rsd中的片段替換插入真核轉錄質粒pro/cha/99中，得到prasia1-rsd-fmdv的重組質粒轉染口蹄疫病毒敏感細胞，獲得第三口蹄疫病毒疫苗株。
在某些實施方式中，所述asia1/hn/06毒株的部分l基因與p1基因和部分p2基因片段包含如seqidno:7所示的核酸序列。在某些實施方式中，所述口蹄疫病毒敏感細胞為bhk-21細胞或ibrs-2細胞。在某些實施方式中，獲得的所述第三口蹄疫病毒疫苗株的146s抗原含量為3.5μg/ml以上(146s抗原含量的測定方法如中國發(fā)明專利zl201310055748.7所述，其全文通過引用并入本申請)。在某些實施方式中，所述滅活用二乙烯亞胺進行。在某些實施方式中，在所述滅活之后對所述第三口蹄疫病毒疫苗株進行乳化。在某些實施方式中，所述乳化是與isa206佐劑以體積比1:1進行。
在某些實施方式中，所述第一口蹄疫病毒疫苗株、所述第二口蹄疫病毒疫苗株和所述第三口蹄疫病毒疫苗株適于懸浮細胞培養(yǎng)。在某些實施方式中，所述第一口蹄疫病毒疫苗株、所述第二口蹄疫病毒疫苗株和所述第三口蹄疫病毒疫苗株可以滅活后以適當?shù)谋壤旌稀？梢詫⑺龅谝豢谔阋卟《疽呙缰辍⑺龅诙谔阋卟《疽呙缰旰退龅谌谔阋卟《疽呙缰攴謩e制成具有一定病毒滴度的抗原液，再根據(jù)測得的抗原含量計算混合的比例。在某些實施方式中，所述第一口蹄疫病毒疫苗株、所述第二口蹄疫病毒疫苗株和所述第三口蹄疫病毒疫苗株按抗原含量1:1:1的比例混合。在某些實施方式中，所述滅活用二乙烯亞胺進行。在某些實施方式中，在所述滅活之后對所述疫苗組合物進行乳化。在某些實施方式中，所述乳化是與isa206佐劑以體積比1:1進行。
另一方面，本發(fā)明涉及所述口蹄疫病毒疫苗組合物在制備用于預防和/或控制動物口蹄疫疾病的藥物中的用途。在某些實施方式中，所述口蹄疫疾病為a、o、c、asial、sat1、sat2、或者sat3型口蹄疫疾病。在某些實施方式中，所述口蹄疫疾病為o型口蹄疫疾病。在某些實施方式中，所述口蹄疫疾病為a型口蹄疫疾病。在某些實施方式中，所述口蹄疫疾病為asia1型口蹄疫疾病。在某些實施方式中，所述動物為偶蹄類動物。在某些實施方式中，所述動物為豬、?；蜓?。
本發(fā)明具有如下積極效果：
本發(fā)明利用成熟的反向遺傳技術，通過對相關基因的改造，實現(xiàn)了口蹄疫疫苗株多種表型的改善和提高，構建了病變時間短、病毒滴度高、抗原匹配性高、病毒產(chǎn)量高的o型重組疫苗株，聯(lián)合已經(jīng)研制成功的a型口蹄疫重組疫苗株和asia1型口蹄疫重組疫苗株制備口蹄疫o型、a型、asia1型三價滅活疫苗，獲得生產(chǎn)性能好、抗原匹配性好，抗原譜廣，能夠同時預防o型、a型和asia1型口蹄疫，増強免疫效力，提高早期免疫應答，延長免疫持續(xù)期等為特征的三價疫苗。解決了篩選疫苗種毒的生產(chǎn)和馴化的問題，實現(xiàn)了首例利用反向遺傳技術構建的疫苗種毒研制高效三價滅活疫苗。
1)、在病毒水平上提高了口蹄疫疫苗株的生產(chǎn)性能，o型重組疫苗株、a型重組疫苗株和asia1型重組疫苗株的病變時間降低，病毒滴度提高，降低了抗原生產(chǎn)成本。
2)、提高了疫苗毒株抗原匹配性和免疫應答性，本發(fā)明構的o型重組疫苗毒株、a型重組疫苗株和asia1型重組疫苗株的結構蛋白與流行毒株一致，抗原匹配性完全匹配，提高了疫苗株與流行毒株的針對性。
3)、本發(fā)明的o型口蹄疫重組疫苗株、a型口蹄疫重組疫苗株和asia1型口蹄疫重組疫苗株均能夠在懸浮bhk-21細胞上快速、大量增殖，o型重組疫苗株病變收獲時間集中在8～14小時，抗原含量可達4.0μg/ml以上；a型重組疫苗株接種后6～10小時抗原含量可達4.0μg/ml以上；asia1型重組疫苗株接種后6～10小時抗原含量可達3.5μg/ml，抗原含量的提升有效地節(jié)約了生產(chǎn)成本。
4)、本發(fā)明的o型口蹄疫重組疫苗株、a型口蹄疫重組疫苗株和asia1型口蹄疫重組疫苗株均具有抗原譜廣的特點，o型重組疫苗株的結構蛋白是從經(jīng)過大量篩選的mya98毒株中擴增得到的，選擇的毒株抗原位點與本譜系的流行毒株匹配性好，與其他譜系，panasia和cathay的流行毒株抗原交叉重疊。通過交叉免疫攻毒試驗表明，重組疫苗株能夠有效保護mya98、panasia和cathay流行毒株；a型口蹄疫重組疫苗株也具有交叉免疫保護特性，能夠有效保護sea-97g1毒株和g2毒株，asia1型口蹄疫重組疫苗株的抗原基因來自經(jīng)過交叉攻毒試驗證明的gⅴ毒株，能夠有效保護gⅴ和gⅱ流行毒株。實現(xiàn)了疫苗的抗原廣譜性。
5)、制備的口蹄疫o型、a型、asia1型三價滅活疫苗，免疫動物，能有效刺激機體產(chǎn)生免疫應答，抗原間具有協(xié)同增強免疫應答的作用，且提高早期免疫應答，免疫持續(xù)期提升至6個月左右，大幅度增強了口蹄疫疫苗的免疫效力。
6)、本發(fā)明技術改變了疫苗毒篩選馴化技術受病毒自然屬性制約大、費時費力、成功率低的缺陷，實現(xiàn)了更為主動有效的疫苗毒株構建，更實現(xiàn)了口蹄疫滅活疫苗毒種制備工藝的革新，具有重大應用價值。
附圖說明
圖1為實施例1中fmdvo/jscz/2013株l基因、p1基因及p2基因片段的電泳圖，其中1為擴增片段，m為dnamarker。
圖2為實施例1中o型口蹄疫病毒重組質粒pro-fmdv的構建策略示意圖。
圖3為實施例2中重組病毒ro-fmdv感染bhk-21細胞后引起的細胞病變效應(cpe)，其中a表示正常bhk-21細胞；b表示出現(xiàn)cpe的bhk-21細胞。
圖4為seqidno:1的核酸序列。
圖5為seqidno:2和seqidno:3的核酸序列。
圖6為seqidno:4的核酸序列。
圖7為seqidno:5和seqidno:6的核酸序列。
圖8為seqidno:7的核酸序列。
圖9為seqidno:8和seqidno:9的核酸序列。
圖10為seqidno:10和seqidno:11的核酸序列。
具體實施方式
本發(fā)明結合國家口蹄疫參考實驗室近年來的毒株積累和對其全基因組序列的分析研究，擴增o型口蹄疫病毒o/jscz/2013株l基因與p1及p2基因，通過選擇合適的限制性內(nèi)切酶位點與已經(jīng)建立的o型口蹄疫病毒o/cha/99株的拯救系統(tǒng)中相應核苷酸序列進行替換，得到一種o型口蹄疫病毒重組質粒pro-fmdv，在bhk-21細胞或ibrs-2細胞上拯救后，得到o型口蹄疫重組病毒ro-fmdv，其與流行毒的抗原匹配性完全匹配，且與panasia和cathay譜系的流行毒株抗原交叉重疊，抗原譜廣。該重組疫苗株生產(chǎn)性能好，用懸浮bhk-21細胞生產(chǎn)，其抗原含量可達4.0μg/ml以上，制備的疫苗可有效刺激機體產(chǎn)生強的抗體應答，具有高滴度、高抗原產(chǎn)能、抗原譜廣、致病性降低、抗體應答水平較高、免疫保護率高的特點。將得到的o型重組疫苗株聯(lián)合利用反向遺傳技術構建并研制成功的a型口蹄疫重組疫苗株和asia1型口蹄疫重組疫苗株，制備口蹄疫o型、a型、asia1型三價滅活疫苗，該疫苗免疫豬和牛，能夠有效刺激機體產(chǎn)生強的免疫應答和早期免疫應答，抗體應答水平高，抗原間有協(xié)同增強免疫應答的作用，免疫保護率高，免疫持續(xù)期延長。對流行于國內(nèi)的o型mya98毒株、panasia毒株、cathay毒株和a型sea-97g1毒株和g2毒株和asia1型毒株均能夠提供良好的免疫保護效力。
下面結合具體實施實例對本發(fā)明做進一步地描述，但具體實施并不對本發(fā)明做任何限定。
下列實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)條件，如《精編分子生物學實驗指南》(f.m.奧斯伯，r.e.金斯頓，j.g.賽德曼等主編，馬學軍，舒躍龍譯，北京：科學出版社，2004)中所述的方法進行。
實施例1.o型口蹄疫重組病毒感染性克隆的構建
本發(fā)明人所用o/jscz/2013毒株由農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局指定國家口蹄疫參考實驗室保藏，公眾可通過農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局批示的委托函獲得。根據(jù)o/jscz/2013株基因組序列，設計合成一對擴增引物，op12a-f(5'-ttttccttaagggacaggaacacgccgtgtttgcctgcgt-3')和op12a-r(5'-actcacatcgatgtcaaagtgaaaccttc-3')，用rnaeasyminikit(qiagen)提取o/jscz/2013毒株的總rna，用引物olignoti(5’-ttttctagagcggccgct38-3’)反轉錄合成第一鏈cdna，用具有極強延伸能力的primescriptreversetranscriptase(takara公司)反轉錄酶，按照產(chǎn)品說明書配制20μl反應體系，于42℃反應1h備用，以反轉錄的第一鏈cdna為模板，用引物op12a-f和op12a-r與o/jscz/2013毒株的cdna核酸混合，擴增獲得o/jscz/2013毒株的基因片段。擴增用適合長片段擴增、性能優(yōu)良的la
將得到的含有o/jscz/2013毒株l基因、p1及p2基因片段以及o型口蹄疫病毒o/cha/99株拯救系統(tǒng)的質粒pro/cha/99(公開于授權專利“asia1型口蹄疫重組病毒及其制備方法和應用”zl201310175323.x和“a型口蹄疫重組疫苗株及其制備方法和應用”zl201310175324.4中，其全文通過引用并入本申請中)分別用aflii和clai雙酶切后，純化回收相應的目的片段，連接、轉化至jm109感受態(tài)細胞中，測序鑒定陽性克隆，獲得含o/jscz/2013毒株l基因、p1及p2基因的重組質粒pro-fmdv，構建方法如圖2所示。
實施例2.o型口蹄疫重組病毒的拯救
用
實施例3.rt-pcr鑒定o型口蹄疫重組病毒
將穩(wěn)定傳代的重組病毒ro-fmdv感染bhk-21細胞的上清用rnaeasyminikit(qiagen)提取總rna，反轉錄后，擴增，純化回收后送測序，結果顯示獲得的重組o型口蹄疫病毒的l基因、p1及p2基因與o/jscz/2013株的基因序列是一致的。
實施例4.a型口蹄疫重組病毒感染性克隆的構建
本發(fā)明人所用a/wh/cha/09毒株由農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局指定國家口蹄疫參考實驗室保藏，公眾可通過農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局批示的委托函獲得。用rnaeasyminikit(qiagen)提取a/wh/cha/09毒株的總rna，用引物olignoti(5’-ttttctagagcggccgct38-3’)反轉錄合成病毒第一鏈cdna，以合成的第一鏈cdna為模板，用引物ap1-f(5'-ttttccttaagggacaggaacatgctgtgtttgcctgcgt-3')和ap1-r(5'-tattttcaccggtgcaataattttctgcttgtgtctgtc-3')擴增獲得a/wh/cha/09毒株的基因片段。擴增用適合長片段擴增、性能優(yōu)良的la
將得到的含有a/wh/cha/09毒株部分l基因和p1片段和o型口蹄疫病毒o/cha/99株拯救系統(tǒng)的質粒pro/cha/99分別用aflii和sgrai雙酶切后，純化回收相應的目的片段，連接、轉化至jm109感受態(tài)細胞中，測序鑒定陽性克隆，獲得含a/wh/cha/09毒株部分前導蛋白l和結構蛋白p1的重組質粒pra-fmdv(所用質粒與方法公開于授權專利“a型口蹄疫重組疫苗株及其制備方法和應用”zl201310175324.4，其全文通過引用并入本申請中)。
實施例5.a型口蹄疫重組病毒的拯救
用
實施例6.rt-pcr鑒定a型口蹄疫重組病毒
將穩(wěn)定傳代的重組病毒ra-fmdv感染bhk-21細胞的上清用rnaeasyminikit(qiagen)提取總rna，反轉錄后，擴增，純化回收后送測序，結果顯示獲得的重組a型口蹄疫病毒的部分l與p1基因與a/wh/cha/09株的基因序列是一致的。
實施例7.asia1型口蹄疫重組病毒感染性克隆的構建
本發(fā)明人所用asia1/hn/06毒株由農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局指定國家口蹄疫參考實驗室保藏，公眾可通過農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局批示的委托函獲得。用rnaeasyminikit(qiagen)提取asia1/hn/06毒株的總rna，用引物olignoti(5’-ttttctagagcggccgct38-3’)反轉錄合成病毒第一鏈cdna，以合成的第一鏈cdna為模板，用引物asia1p12a-f(5'-ttttccttaagggacaagaacatgctgtgtttgcctgtgt-3')和asia1p12a-r(5'-actcacatcgatgtcaaagtgaaacctcc-3')擴增獲得asia1/hn/06毒株的基因序列。擴增用適合長片段擴增、性能優(yōu)良的la
以鑒定正確的重組質粒pmd20-asia1p12a為模板，用磷酸化突變引物s-p和rsd-p進行pcr擴增，上述5'磷酸化的點突變引物分別是：s-p：5'-cacgcagagtgagcaaccggctgcc-3'；rsd-p：5'-cgagggcggcaagatcgctacgccgcgagg-3'，在以上的磷酸化的點突變引物中，將asia1/hn/06毒株擴增序列中受體結合位點rgd點突變?yōu)閞sd，用該引物進行平末端擴增，純化回收pcr產(chǎn)物，經(jīng)室溫連接5min后，轉化大腸桿菌jm109，測序鑒定點突變后的陽性克隆，將得到的定點突變重組質粒命名為pmd20-asia1p12a-rsd，測序結果顯示插入的基因片段是seqidno:7所示的核苷酸序列。
將質粒pmd20-asia1p12a-rsd和o型口蹄疫病毒o/cha/99株拯救系統(tǒng)的質粒pro/cha/99分別用aflii和clai雙酶切后，純化回收相應的目的片段，連接、轉化至jm109感受態(tài)細胞中，測序鑒定陽性克隆，獲得含asia1/hn/06毒株受體結合位點突變?yōu)閞sd后的重組質粒，將重組質粒命名為prasia1-rsd-fmdv(所用質粒與方法公開于授權專利“asia1型口蹄疫重組病毒及其制備方法和應用”zl201310175323.x，其全文通過引用并入本申請中)。
實施例8.asia1型口蹄疫重組病毒的拯救
用
實施例9.rt-pcr鑒定asia1型口蹄疫重組病毒
將穩(wěn)定傳代的重組病毒rasia1-rsd-fmdv感染bhk-21細胞的上清用rnaeasyminikit(qiagen)提取總rna，反轉錄后，擴增，純化回收后送測序，結果顯示基因序列與構建的重組asia1型口蹄疫病毒的序列一致。
實施例10.口蹄疫o型、a型、asia1型重組疫苗株對bhk-21細胞的致病力試驗
10.1口蹄疫o型重組疫苗株對bhk-21細胞的致病力試驗
按照常規(guī)方法對bhk-21細胞進行消化，加入含10％胎牛血清的mem細胞培養(yǎng)基，分散于12孔板中，于37℃含有5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞單層長到90％時備用。用mem以10倍倍比稀釋病毒液，將各稀釋度(10-4.0～10-9.0)的病毒液分別加入細胞板中，每個稀釋度4孔，放入37℃含有5％co2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，觀察3天，用reed-muench氏法測定對bhk-21細胞的半數(shù)感染量(tcid50)。按照該法測定ro-fmdv的滴度，計算o型口蹄疫重組疫苗株ro-fmdv的tcid50為10-8.33/ml。
reed-muench計算方法是本領域的已有技術，現(xiàn)有文獻“reed,l.j.andmuench,h.(1938)."asimplemethodofestimatingfiftypercentendpoints".theamericanjournalofhygiene27:493–497”中對此已經(jīng)進行了詳細地描述，該文獻在此通過引用方式并入本申請用作參考。
10.2口蹄疫a型重組疫苗株對bhk-21細胞的致病力試驗
按10.1中所述的方法，測定實施例5中制備的a型口蹄疫重組疫苗株ra-fmdv對bhk-21細胞的半數(shù)感染量(tcid50)。計算a型口蹄疫重組疫苗株ra-fmdv的tcid50為10-8.33/ml。
10.3口蹄疫asia1型重組疫苗株對bhk-21細胞的致病力試驗
按10.1中所述的方法，測定實施例8中制備的asia1型口蹄疫重組疫苗株對bhk-21細胞的半數(shù)感染量(tcid50)。計算asia1型重組疫苗株的tcid50為10-8.77/ml。
實施例11.bhk-21懸浮細胞培養(yǎng)口蹄疫o型、a型、asia1型重組疫苗株
11.1bhk-21懸浮細胞對o型疫苗株的敏感性試驗
將已經(jīng)使用貼壁bhk-21細胞培養(yǎng)并收獲的o型口蹄疫重組疫苗株ro-fmdv接種5l生物反應器懸浮細胞，設定適應的溶氧、溫度、ph值與轉速等，通過定時取樣，觀察細胞形態(tài)并檢測樣品的病毒含量(表1)。結果表明該疫苗株可以很好的適應bhk-21懸浮細胞，且病變時間短，抗原含量能夠達到4.0μg/ml以上，達到制苗要求。通過連續(xù)5代的懸浮細胞傳代，經(jīng)rt-pcr擴增測序比對核苷酸突變現(xiàn)象，說明該毒株具有良好的穩(wěn)定性，可以用懸浮細胞進行重組口蹄疫o型、a型、asia1型三價滅活疫苗中o型抗原的生產(chǎn)制備。
表1ro-fmdv疫苗株懸浮適應結果
—表示未檢測
懸浮細胞bhk-21對o型口蹄疫重組疫苗株具有良好的感染、增殖敏感性，能較好地實現(xiàn)口蹄疫病毒在細胞內(nèi)的復制與增殖，出現(xiàn)細胞死亡、裂解等特征性病變，病毒含量高峰規(guī)律性集中在8～14小時，同時抗原146s得到提高，連續(xù)傳代證明疫苗株能夠穩(wěn)定增殖，完全可以使用懸浮bhk-21細胞生產(chǎn)o型口蹄疫抗原制備重組三價滅活疫苗。
11.2bhk-21懸浮細胞對a型疫苗株的敏感性試驗
將已經(jīng)使用貼壁bhk-21細胞培養(yǎng)并收獲的a型口蹄疫重組疫苗株ra-fmdv接種5l生物反應器懸浮細胞，設定適應的溶氧、溫度、ph值與轉速等，通過定時取樣，觀察細胞形態(tài)并檢測樣品的病毒含量(表2)。結果表明該疫苗株可以很好的適應bhk-21懸浮細胞，且病變時間短，抗原含量能夠達到4.0μg/ml以上，達到制苗要求。通過連續(xù)5代的懸浮細胞傳代，經(jīng)rt-pcr擴增測序比對核苷酸突變現(xiàn)象，結果說明該毒株具有良好的穩(wěn)定性，可以用懸浮細胞進行重組口蹄疫o型、a型、asia1型三價滅活疫苗中a型抗原的生產(chǎn)制備。
表2ra-fmdv疫苗株懸浮適應結果
—表示未檢測
懸浮bhk-21細胞接種a型口蹄疫重組疫苗株ra-fmdv后，平均7個小時左右溶氧接近于零，之后逐步病變、裂解，并產(chǎn)生大量具有感染性的病毒粒子，說明病毒增殖速度快，致細胞病變時間短于其他毒株。接毒后6～10小時后細胞基本死亡、崩解，活率為零，病毒粒子146s含量可達4.0μg/ml以上，最終收毒時甚至高達6.33μg/ml，說明a型口蹄疫重組疫苗株ra-fmdv在懸浮培養(yǎng)的bhk-21細胞中可大量增殖，且bhk-21細胞株對該重組疫苗株具有良好敏感性，通過連續(xù)5代懸浮培養(yǎng)，病毒毒價與146s很高，連續(xù)傳代測序證明疫苗株能夠穩(wěn)定增殖，完全可以使用懸浮bhk-21細胞生產(chǎn)a型口蹄疫抗原制備重組三價滅活疫苗。
11.3bhk-21懸浮細胞對asia1型疫苗株的敏感性試驗
將已經(jīng)使用貼壁bhk-21細胞培養(yǎng)并收獲的asia1型口蹄疫重組疫苗株接種5l生物反應器懸浮細胞，設定適應的溶氧、溫度、ph值與轉速等，通過定時取樣，觀察細胞形態(tài)并檢測樣品的病毒含量(表3)。結果表明該疫苗株可以很好的適應bhk-21懸浮細胞，且病變時間短，抗原含量能夠達到3.5μg/ml以上，達到制苗要求。通過連續(xù)4代的懸浮細胞傳代，經(jīng)rt-pcr擴增測序比對核苷酸突變現(xiàn)象，結果說明該毒株具有良好的穩(wěn)定性，可以用懸浮細胞進行重組口蹄疫o型、a型、asia1型三價滅活疫苗中asia1型抗原的生產(chǎn)制備。
表3rasia1-rsd-fmdv疫苗株懸浮適應結果
—表示未檢測
懸浮bhk-21細胞接種asia1型口蹄疫重組疫苗株rasia1-rsd-fmdv后，7個小時左右溶氧接近于零，產(chǎn)生大量具有感染性的病毒粒子，說明病毒增殖速度快，致細胞病變時間短。接毒后6～10小時后細胞基本死亡、崩解，活率為零，病毒粒子146s含量可達3.5μg/ml以上，說明懸浮bhk-21細胞株對該重組疫苗株具有良好敏感性，連續(xù)傳代測序證明疫苗株能夠穩(wěn)定增殖，完全可以使用懸浮bhk-21細胞生產(chǎn)asia1型口蹄疫抗原制備三價滅活疫苗。
實施例12.o型口蹄疫重組疫苗的制備和免疫效果評價
12.1疫苗制備
將由懸浮bhk-21細胞制備的重組病毒ro-fmdv滅活，用3mmol/l二乙烯亞胺(binaryethylenimine,bei)(sigma公司)30℃滅活30h，加入阻斷劑硫代硫酸鈉溶液，4℃過夜，保存?zhèn)溆?。滅活抗原?jīng)安檢后與isa206佐劑(法國seppic)以1：1比例混合制備疫苗。具體按照《中華人民共和國藥典》中獸用生物制品的口蹄疫滅活疫苗規(guī)程制備。安檢牛舌部皮下注射滅活病毒2ml/頭，連續(xù)逐日觀察6日，觀察期牛健康良好，蹄部和嘴鼻均無異常。實驗用牛購自非疫區(qū)，并經(jīng)國家口蹄疫參考實驗室生產(chǎn)的fmd液相阻斷elisa(lpb-elisa)檢測o型抗體均＜1：4。fmd非結構蛋白3abc-elisa抗體檢測為陰性。
12.2疫苗免疫攻毒保護試驗
將得到的安檢合格的o型口蹄疫重組病毒疫苗分別免疫10頭牛，10頭豬，同時各設2頭非免疫對照，測定其免疫效力。攻毒方法及結果判定方法均按照《manualofdiagnostictestsandvaccinesforterrestrialanimals》(2009年版，世界動物衛(wèi)生組織(oie))中所述。
免疫豬28天后，用1000倍豬半數(shù)感染劑量(sid50劑量)的流行毒進行攻毒實驗，連續(xù)觀察10天，結果表明，免疫的動物沒有臨床癥狀，100％保護，如表4所示。
表4o型口蹄疫重組疫苗免疫豬攻毒后臨床癥狀和保護情況
免疫牛28天后，用10000倍牛半數(shù)感染劑量(bid50劑量)的流行毒進行攻毒實驗，連續(xù)觀察10天，結果表明：免疫的動物沒有臨床癥狀，100％保護，如表5所示。
表5o型口蹄疫重組疫苗免疫牛攻毒后臨床癥狀和保護情況
說明用該o型口蹄疫重組病毒作為疫苗株免疫豬和牛，能有效保護當前o型口蹄疫流行毒的攻擊。
12.3疫苗免疫效力與交叉攻毒試驗
按2015年版《中國獸藥典》方法進行，口蹄疫參考實驗室生產(chǎn)的fmd液相阻斷elisa(lpb-elisa)檢測o抗體均＜1：4。fmd非結構蛋白3abc-elisa抗體檢測為陰性。本試驗所用動物均嚴格在absl-3實驗室圈養(yǎng)。按照2015年版《中國獸藥典》記載的半數(shù)保護量(pd50)測定方法來測定疫苗的半數(shù)保護量，具體方法如下。免疫組每組15頭，免疫劑量分1頭份、1/3頭份、1/9頭份，分別免疫，28d后，分別用mya-98、panasia、cathay的流行代表毒進行攻毒，攻毒劑量為1000倍sid50，每組設3頭對照，攻毒方式為肌肉注射。連續(xù)觀察15日，根據(jù)舌面、齒齦、蹄出現(xiàn)水泡等口蹄疫癥狀判定病毒液致動物發(fā)病情況，動物發(fā)病即判為不保護。計算各組免疫動物的保護比例。最后再按照reed-muench法分別計算各組的pd50。
免疫效力及交叉攻毒試驗測定結果表明，o型口蹄疫重組毒株對mya-98、panasia和cathay的pd50分別為13.59、7.05、9.0，對o型不同拓撲型口蹄疫病毒的免疫保護效力大于oie推薦的pd50(即，6)，是理想的抗o型口蹄疫重組疫苗，可用于我國及其周邊國家o型口蹄疫病毒的預防和控制，參見表6。
表6o型口蹄疫重組疫苗株免疫效力及交叉攻毒保護結果
實施例13.a型口蹄疫重組疫苗的制備和免疫效果評價
13.1疫苗制備
將由懸浮bhk-21細胞制備的重組病毒ra-fmdv滅活，用3mmol/l二乙烯亞胺(binaryethylenimine,bei)(sigma公司)30℃滅活30h，加入阻斷劑硫代硫酸鈉溶液，4℃過夜，保存?zhèn)溆?。滅活抗原?jīng)安檢后與isa206佐劑(法國seppic)以1：1比例混合制備疫苗。具體按照《中華人民共和國藥典》中獸用生物制品的口蹄疫滅活疫苗規(guī)程制備。安檢牛舌部皮下注射滅活病毒2ml/頭，連續(xù)逐日觀察6日，觀察期牛健康良好，蹄部和嘴鼻均無異常。實驗用牛購自非疫區(qū)，并經(jīng)國家口蹄疫參考實驗室生產(chǎn)的fmd液相阻斷elisa(lpb-elisa)檢測a型抗體均＜1：4。fmd非結構蛋白3abc-elisa抗體檢測為陰性。
13.2疫苗免疫效力實驗
試驗用牛購自非疫區(qū)，并經(jīng)國家口蹄疫參考實驗室生產(chǎn)的fmd液相阻斷elisa(lpb-elisa)檢測a型抗體均＜1：4。fmd非結構蛋白3abc-elisa抗體檢測為陰性。本試驗所用動物均嚴格在absl-3實驗室圈養(yǎng)。對照組是免疫過流行毒a/wh/cha/09制備的疫苗，實驗組是免疫過重組ra-fmdv制備的疫苗，攻毒用毒為10000倍bid50的流行毒a/wh/cha/09。攻毒方式為舌面皮內(nèi)分多點注射毒液。連續(xù)觀察15日，根據(jù)牛舌面、齒齦、蹄出現(xiàn)水泡、潰瘍等口蹄疫癥狀判定病毒液致牛發(fā)病情況。免疫效力測定結果表明，a型口蹄疫重組毒株的pd50在10.81～13.59，而流行毒株制備的疫苗pd50為5.57(表7)。
表7a型口蹄疫重組疫苗株與流行毒株pd50實驗比較表
實施例14.asia1型口蹄疫重組疫苗的制備和免疫效果評價
14.1疫苗制備
將由懸浮bhk-21細胞制備的重組病毒rasia1-rsd-fmdv滅活，用3mmol/l二乙烯亞胺(binaryethylenimine,bei)(sigma公司)30℃滅活30h，加入阻斷劑硫代硫酸鈉溶液，4℃過夜，保存?zhèn)溆谩缁羁乖?jīng)安檢后與isa206佐劑(法國seppic)以1：1比例混合制備疫苗。具體按照《中華人民共和國藥典》中獸用生物制品的口蹄疫滅活疫苗規(guī)程制備。安檢牛舌部皮下注射滅活病毒2ml/頭，連續(xù)逐日觀察6日，觀察期牛健康良好，蹄部和嘴鼻均無異常。實驗用牛購自非疫區(qū)，并經(jīng)國家口蹄疫參考實驗室生產(chǎn)的fmd液相阻斷elisa(lpb-elisa)檢測asia1型抗體均＜1：4。fmd非結構蛋白3abc-elisa抗體檢測為陰性。
14.2疫苗免疫效力實驗
試驗用牛購自非疫區(qū)，并經(jīng)國家口蹄疫參考實驗室生產(chǎn)的fmd液相阻斷elisa(lpb-elisa)檢測asia1型抗體均＜1：4。fmd非結構蛋白3abc-elisa抗體檢測為陰性。本試驗所用動物均嚴格在absl-3實驗室圈養(yǎng)。對照組是免疫過流行毒asia1/hn/06制備的疫苗，實驗組是免疫過重組rasia1-rsd-fmdv的疫苗，攻毒劑量為10000倍bid50。攻毒方式為舌面皮內(nèi)分多點注射毒液。連續(xù)觀察15日，根據(jù)牛舌面、齒齦、蹄出現(xiàn)水泡、潰瘍等口蹄疫癥狀判定病毒液致牛發(fā)病情況。免疫效力測定結果表明，asia1型口蹄疫重組毒株的pd50在9.0～13.59，流行毒株制備的疫苗pd50為6.34(表8)。
表8asia1型口蹄疫重組毒株與流行毒株pd50實驗比較表
實施例15.口蹄疫o型、a型、asia1型三價滅活疫苗的制備和免疫效果評價
15.1疫苗制備
將由懸浮bhk-21細胞培養(yǎng)的重組疫苗株ro-fmdv，ra-fmdv和rasia1-rsd-fmdv分別滅活，用3mmol/l二乙烯亞胺(binaryethylenimine,bei)(sigma公司)30℃滅活30h，加入阻斷劑硫代硫酸鈉溶液，4℃過夜，保存?zhèn)溆?。滅活抗原濃縮檢測146s，經(jīng)安檢合格后每種抗原按146s1.5ug/頭份，抗原溶液與isa206佐劑(法國seppic)以1：1比例混合進行乳化，制備疫苗。具體按照《中華人民共和國藥典》中獸用生物制品的口蹄疫滅活疫苗規(guī)程制備。安檢牛舌部皮下注射滅活病毒2ml/頭，連續(xù)逐日觀察6日，觀察期牛健康良好，蹄部和嘴鼻均無異常。實驗用牛購自非疫區(qū)，并經(jīng)國家口蹄疫參考實驗室生產(chǎn)的fmd液相阻斷elisa(lpb-elisa)檢測o型、a型、asia1型抗體均＜1：4。fmd非結構蛋白3abc-elisa抗體檢測為陰性。
15.2疫苗免疫攻毒保護試驗
篩選陰性動物，口蹄疫參考實驗室生產(chǎn)的fmd液相阻斷elisa(lpb-elisa)檢測o型、a型、asia1抗體均＜1：4。fmd非結構蛋白3abc-elisa抗體檢測為陰性。將得到的安檢合格的重組口蹄疫o型、a型、asia1型三價滅活疫苗免疫豬，同時各設3頭非免疫對照，測定其免疫效力。免疫每組15頭，免疫劑量分1頭份、1/3頭份、1/9頭份，o型攻毒株為2010年流行至今的mya98毒株(o/mya98/by/2010)，a型攻毒株選用2013至今優(yōu)勢流行毒株a/gdmm，asia1型攻毒株選用asia1/hn/06，攻毒方法及結果判定方法均按照《manualofdiagnostictestsandvaccinesforterrestrialanimals》(2009年版，世界動物衛(wèi)生組織(oie))中所述。
免疫豬28天后，用1000倍sid50毒劑量分別進行攻毒實驗，連續(xù)觀察15天，對照豬均至少有一蹄出現(xiàn)水泡或潰瘍，免疫豬出現(xiàn)任何口蹄疫癥狀即判為不保護。根據(jù)免疫豬的保護數(shù)，按reed-muench法計算被檢疫苗的pd50(表9)。
表9重組口蹄疫o型、a型、asia1型三價滅活疫苗免疫攻毒保護結果
通過疫苗免疫效力實驗，保護效力結果遠大于oie推薦的6pd50，說明用該口蹄疫o型、a型、asia1型三價滅活疫苗免疫動物，能有效保護o型mya98毒株、a型sea-97g2毒株及asia1型這些流行毒株的攻擊。
15.3交叉攻毒保護試驗
按上述相同的檢測方法，篩選陰性動物。將口蹄疫o型、a型、asia1型三價滅活疫苗免疫豬，免疫每組15頭，免疫劑量分1頭份、1/3頭份、1/9頭份，分別免疫，28d后，o型的交叉攻毒株選用panasia(o/0834)和cathay(0718)，a型毒株采用2009年流行的(a/wh/09)作為攻毒毒株進行攻毒。攻毒劑量1000倍sid50，每組設3頭對照，連續(xù)觀察15日，根據(jù)舌面、齒齦、蹄出現(xiàn)水泡等口蹄疫癥狀判定病毒液致動物發(fā)病情況，免疫效力及交叉攻毒試驗測定結果表明，交叉攻毒試驗測得的疫苗半數(shù)動物保護數(shù)均在6個pd50以上，說明交叉攻毒動物保護效果很好。疫苗免疫動物后能抵抗這些毒株的攻擊，可以作為國內(nèi)預防o型、a型和asia1型口蹄疫的三價疫苗。結果如表10。
表10重組口蹄疫o型、a型、asia1型三價滅活疫苗交叉攻毒保護結果
15.4免疫持續(xù)期試驗
篩選陰性動物，口蹄疫參考實驗室生產(chǎn)的fmd液相阻斷elisa(lpb-elisa)檢測o型、a型、asia1抗體均＜1：4。fmd非結構蛋白3abc-elisa抗體檢測為陰性。將得到的安檢合格的重組口蹄疫o型、a型、asia1型三價滅活疫苗免疫豬，分別在免疫后28日、180日、210日進行攻毒試驗，攻毒保護情況見11，結果說明該疫苗具有非常好的抗原保護力與免疫原性，免疫持續(xù)期提升至6個月左右(常規(guī)疫苗4個月左右)，最終確定了口蹄疫o型、a型、asia1型三價滅活疫苗的免疫持續(xù)期為6個月。
表11三價滅活疫苗免疫后28日、180日、210日攻毒保護率
免疫后28日、180日、210日后進行攻毒試驗，疫苗免疫后28日、180日免疫后各型攻毒保護百分率均不低于80％，210日免疫后各型攻毒保護百分率均達到70％。
根據(jù)7個月攻毒保護率和測定的抗體效價結果分析，口蹄疫o型、a型、asia1型三價滅活疫苗的免疫保護力良好，且免疫持續(xù)期提升至6個月，大幅度提升了口蹄疫o型、a型和asia1型疫苗的免疫效力。
以上所述的實施例僅表述了本發(fā)明的實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可做出其它改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
seqidno:1
cttaagggacaggaacacgccgtgtttgcctgcgtcacctccaacgggtggtacgcgatcgacgacgaagaattctacccctggacgccagatccgtccgacgtgctggtctttgtcccgtacgatcaagaaccacttaatggagaatggaaagcaagggttcagagacggctcaagggagccggacaatccagtccggctactgggtcacagaaccaatcaggcaacaccgggagtatcatcaacaattactacatgcagcaataccagaactccatggacacccaacttggtgacaatgctatcagcggaggctccaacgagggatccacagacacaacctccacccacacaaccaacactcagaacaatgactggttttcaaagttggccagctctgccttcagcggtcttttcggcgccctcctcgccgataagaaaaccgaggagaccactcttctcgaggaccgcatcctcaccacccgaaacggacacaccacctcgacaacccagtcgagtgttggcataacgcacgggtacgcaacagctgaggattttgtgaacgggccaaacacctctggtcttgagaccagagttgtccaggcggaacggttctttaaaacccacctgttcgactgggtcaccagtgatccgttcggacggtactacttgttggagctcccgactgaccacaaaggtgtctacggcagcctgaccgactcatacgcctacatgagaaacggttgggatgttgaggtcaccgctgtggggaatcagttcaacggaggctgcctactggtggccatggtacctgaactttgttccatcgagcggagagagctgttccagcttacgctcttcccccaccagttcatcaacccccggacgaacatgacagcccacatcaaggtgccctttgttggcgtcaaccgttacgatcagtacaaggtacacaagccgtggacccttgtggttatggtcgtagccccactgactgtcaacaccgaaggcgctccgcagatcaaggtgtatgccaacatcgcacccaccaacgtgcacgtcgcgggtgagttcccttccaaagaggggattttccctgtggcctgtagcgacggttatggcggcttggtgacaactgacccaaagacggctgaccccgtttacggcaaagtgttcaaccccccccgcaacatgttgccggggcggttcaccaacctcctgggcgtggctgaggcttgccccacgtttctgcacttcgatggtgacgtaccgtatgtgaccactaagacggattcggacagggtgctcgcacaatttgacttgtctttggcagcaaaacacatgtcaaacaccttccttgcaggtcttgcccagtactacacgcagtacagcggcaccgttaacctgcacttcatgttcacaggtcccactgacgcgaaagcgcgttacatgattgcgtatgcccctccgggcatggagccgcccaaaacacctgaggctgctgctcactgcattcacgcagagtgggacacgggtctgaactcaaagtttaccttttccatcccctacctctcggcggctgattacgcgtacaccgcgtctgacgctgctgagaccacaaatgttcagggatgggtctgcttatttcaaataacacacgggaaagctgagggtgacgctcttgtcgtgctggccagtgctggcaaagactttgagctgcgcctgcctgtggacgctcggcaacagaccacttcgacgggcgagtcggctgaccccgtgactgccaccgttgagaattacggtggcgagacacaggtccagaggcgccaccacacagacgtctcattcatattggacagatttgtgaaagtcacaccaaaagactcaataaatgtattggacctgatgcagaccccctcccacaccctagtaggggcgctcctccgcactgccacttactatttcgctgatctagaggtggcagtgaaacacaagggggaccttacctgggtgccaaatggagcacctgaagcagccttggacaacaccaccaacccaacggcgtactataaggcgccgcttacccggcttgcattgccctacacggcaccacaccgtgttttggccaccgtttacaacgggaaatgcaaatacgccgggggctcactgcccaacgtgagaggcgatctccaagagctggctcagaaggcagcgaggccgctgcctacttctttcaactacggtgccatcaaagccactcgggtgacagaactgctgtaccgcatgaagagggccgagacgtactgtcctcggccccttttggctgttcacccgagtgcggccagacacaaacagaaaatagtggcgcctgtaaagcagtccttgaactttgatctgctcaagttggcaggggacgtggagtccaaccctgggcccttcttcttctctgacgtcaggtcaaacttcaccaaactggtggaaaccatcaaccagatgcaagaggacatgtcaacaaaacacggacccgactttaaccggttggtatcagcgtttgaggaattggccgctggggtgaaagccatcaggaccggcctcgacgaggccaaaccctggtacaagctcatcaagctcctgagccgcttgtcatgcatggccgctgtagcagcacggtccaaggacccagtccttgtggctatcatgctggctgacaccggtcttgagattctggacagcacatttgtcgtgcagaaaatctccgactccctctccagtctctttcacgtgccggcccccgtcttcagtttcggagctccgattctgctagccgggttggtcaaggtcgcctcgagcttcttccggtccacacccgaggatctcgagagagcagagaaacagctcaaagcacgtgacatcaatgacatcttcgccattctcaagaacggcgagtggctggtcaagttgatcctagccatccgcgactggattaaagcatggatcgcctcagaagagaagtttgtcaccatgacagacttggtgcctggcatccttgaaaagcagcgggacctcaacgacccggccaagtacaaggaagccaaggaatggctcgacaacgcgcgccaaacgtgtttgaagagcgggaacgtccacattgccaacctgtgcaaagtggtcgccccagcaccgagcaagtcgagacctgaacccgtggtcgtgtgcctccgcggcaaatccggtcagggtaagagtttccttgcgaacgtgctggcacaagccatctctacccactttaccggcaggactgactcagtttggtactgtccgccagaccctgaccacttcgacggttacaaccagcagaccgttgttgtgatggatgatttgggccagaatcccgacggcaaggacttcaagtacttcgcccagatggtctcgaccacggggttcatcccgcccatggcttcacttgaggacaaaggcaagcctttcaacagcaaagtcatcattgccaccaccaacctgtactcgggcttcaccccgagaaccatggtgtgccccgatgcgctgaaccgaaggtttcactttgacatcgat
seqidno:2
ttttccttaagggacaggaacacgccgtgtttgcctgcgt
seqidno:3
actcacatcgatgtcaaagtgaaaccttc
seqidno:4
cttaagggacaggaacacgcagtgtttgcctgtgttacctccaacgggtggtacgcgattgacgacgaggacttttacccctggacaccagacccgtctgatgtcctggtgtttgtcccgtatgatcaagaaccactcaacggagaatggaaaacaaaggttcagaggcgacttaaaggggcagggcaatctagccccgccaccgggtcgcagaaccagtcaggcaataccggcagcatcattaacaactactacatgcagcagtaccagaactccatggacacacaacttggtgacaacgccatcagcggaggatccaacgaggggtccacggacacaacctctacccacacaaccaacacccaaaacaatgactggttctcaaaactggcaagttctgcattcaccggtcttttcggcgcactgctcgccgacaagaagaccgaagagacaactcttctggaggaccgtatcctcaccactcgtaatggacacaccacctctacaactcagtcgagtgtgggggtcacctacgggtattcaactggtgaggaccacgtttctggacctaacacatcaggtttggagacgcgggtggtacaagctgaaaggttcttcaagaagcacttgtttgattggacaacggacaaaccctttggtcacattgaaaagctggaacttcccactgatcacaaaggtgtctacggacagctggtggactcctttgcatacatgagaaatggctgggacgtggaggtgtctgctgttggcaaccagttcaacggcgggtgccttctcgtggccatggtacctgagtttaaggagttcaccacacgtgaaaagtaccagctcaccctgttcccccaccagttcattagccccagaaccaacatgaccgcgcacatcacggtcccgtaccttggtgtgaacaggtatgaccagtacaacaaacacaaaccctggacgttggtggtgatggtggtttcgccacttaccactagctccattggtgcatcacagattaaggtctacaccaacatcgccccgacccacgttcacgtggctggcgagctcccgtcgaaagaggggatcgtgccagtcgcctgctcggacgggtacggtggcctggtgacaacagaccctaaaacagctgaccctgcttacggtatggtgtacaacccacctaggaccaactaccccgggcggtttacaaacttgttggacgtggcagaggcgtgccccaccttcctctgtttcgacgacgggaaaccgtacgttgtgacaagaacggacgagcagcgcctcttggccaagtttgacctttcccttgctgcaaagcacatgtcaaacacctacctttcagggatagcacagtactacgcacagtactctggcaccatcaatttgcacttcatgtttactggttccactgactcaaaggcccgttacatggtggcttacgtcccgcccggcgtgacaacgccaccggacacgcctgagagagctgcgcactgcatccacgcagaatgggacacggggctaaactccaaattcactttttcaatcccatacgtatctgctgcagattacgcgtacacagcgtccgatgtggcagacacaacaaacgtacagggatgggtttgcatctaccaaatcacccatgggaaggccgaacaagacactctggttgtgtcggtcagcgccggcaaagactttgagctgcgcctccccattgacccccgtgcgcaaaccaccgccaccggggaatcagcagaccccgtcacaaccaccgtcgagaactacggtggtgagacacaagtgcagcgacgccaccacaccgacgtcagcttcataatggacaggtttgtgcaaatcaagcctgtgagccccacacatgtcattgacctcatgcaaacacaccaacacgggctggtgggcgctatgttgcgcgcggccacctactacttttctgatcttgagattgtggtgaaccacacgggtcgcctaacgtgggtacccaatggagcacctgaggcagcactggacaacacgagcaaccccactgcttaccacaaagcaccgttcacacggcttgcactcccttacaccgcgccacaccgcgtgttggcaactgtgtacaacgggaatagcaagtactctgcgcctgcaacacggcgaggtgacttggggtctctcgcggcgaggctcgccgcacagcttcctgcctccttcaactacggcgcgattcgagccacggagatccaagaactcctcgtgcgcatgaagcgtgccgagctctactgccccaggccactgctggcggtggaggtgacgtcacaagacagacacaagcagaaaattattgcaccggtg
seqidno:5
ttttccttaagggacaggaacatgctgtgtttgcctgcgt
seqidno:6
tattttcaccggtgcaataattttctgcttgtgtctgtc
seqidno:7
cttaagggacaagaacatgctgtgtttgcctgtgtcacctccaacgggtggtacgcgattgatgacgaggacttttacccctggacaccggacccgtccgacgtcttggtgtttgttccgtacgaccaagaaccgctcaacggcgagtggaaagcaaaggttcagaagcggctcaagggagccgggcaatccagcccggcgaccgggtcgcagaaccagtcaggcaacactggaagcatcattaacaactactacatgcagcagtaccagaactccatggacacgcaacttggagataacgctatcagcggaggctccaacgagggttccacggacaccacatccgcacacacaaacaacacccaaaacaatgattggttctcacgcttggccaactcggcctttagcggactgtttggtgctcttttggctgacaagaaaacggaggagacaactctgcttgaagaccgcattctcaccaccagaaatggccacacgacgtcgacgacacagtcgagtgttggcgtaacatatggttacgctgtggctgaagacgcggtatctgggcctaacacctcaggcctggagacccgcgtaacacaggctgaacggttcttcaagaaacacctgtttgactggacgccggatttgtcatttggacactgtcactacttggaactcccctctgaacacaagggcgtgtttggcagcctcatgagctcttatgcttacatgaggaacgggtgggacgttgaggtgaccgctgttggaaatcagttcaatggtggttgtctcctcgtcgcactcgtgccggagctgaaagagctcgacacgcggcagaagtatcagttaaccctcttcccacaccagttcattaacccgcgcactaacatgacggctcacattaacgtgccgtacgtgggtgtcaacaggtacgaccagtacgagctccacaaaccgtggacgcttgtggtgatggtggtggccccgcttaccgtcaaaactggtggttctgaacagatcaaggtctacatgaatgcagcgccgacctacgtgcacgtggcaggagaactgccctcgaaagaggggatagttcctgtggcgtgtgtggacggttacggcaacatggtaaccacggacccgaagacggctgaccccgtctacgggaaagtgtctaacccccccagaacaagcttccctgggcgtttcacaaacttccttgatgtagcggaggcgtgtccgaccttcctccgcttcggagaagtaccatttgtgaagacggtgaactctggtgaccgcttgcttgccaagtttgacgtgtccctcgctgcggggcacatgtccaacacctacttggcaggtttggcacagtactacacacagtacagcggcactatgaatatccacttcatgttcaccggacccacggatgccaaagcccgctacatggtggcttacatacctcctggtatgacaccgccagcggacccggagcgggctgcacactgcattcattctgagtgggacactggactcaattctaaatttaccttttctatcccttacctttctgctgcagactatgcttacactgcttctgacgtggctgagaccacgagtgtgcagggatgggtgtgtatttaccagatcacccacggtaaagctgaaggtgacgcgctggtcgtgtccgtcagcgctggcaaggactttgagtttcgactaccggtggatgcccgccaacagactaccaccactggcgagtccgcggacccagtcaccaccacggttgagaactacggaggagaaacccagacggcccgacggcttcacactgatgtcgccttcgttctcgacaggttcgtaaaactcacccagcccaagagcacccaaacccttgatctcatgcagatcccctcacacacactggtcggggcgcttctccggtctgcgacgtactacttctcagatctggaggttgcgctcgtccacacaggaccggtcacgtgggtgcccaatggtgcgcctaagaccgccttgaacaaccacaccaacccgactgcctaccagaagcagcctatcacccgcttggcactcccctacaccgctccccaccgtgtgctgtcaacagtgtacaacgggaagacaacgtacggagaagaatcctcgcggcgtagcgatcttgccgccctcgcacgcagagtgagcaaccggctgcccacttccttcaactacggcgctgtgaaggccgacaccatcacggagctgttgatccgcatgaagcgtgcggaaacatactgccccaggcccttgctggctcttgacaccacacaagaccgccgtaaacaggagatcattgcacctgagaaacagactttgaactttgacctactcaagttggcaggagacgtggagcccaaccctgggcccttcttcttctctgatgtcaggtcgaacttcaccaagctggtggacaccattaaccagatgcaagaggacatgtcaacaaaacacggacccgactttaaccggttggtgtccgcatttgaggaactggccactggagtgaaggctatcaggactggtcttgacgaggccaaaccctggtacaaactcatcaaactcctgagccgcttgtcatgcatggccgctgtagcagcacggtcaaaggacccagtccttgtggccatcatgctggctgacaccggccttgagattctggacagcacattcgtcgtgaagaagatctccgactcactctccagtctctttcacgtgccggcccccgtcttcagtttcggagccccggttctgttggccgggttggtcaaagtcgcctcgagtttcttccggtccacgcccgaagaccttgagagagcagagaaacagctcaaagcacgtgacatcaacgacatcttcgccattctcaagaacggcgagtggttggtcaaattgattcttgccatccgcgactggattaaggcatggatcgcctcagaagaaaagtttgtcaccatgacagacttggtgcctggcatcctcgaaaagcaacgggacctcaacgacccgagcaagtacgaggaagccaaggagtggctcgacaacgcgcgtcaagcgtgtctgaagagcgggaacgtccacattgccaacctgtgcaaggtgatcgccccggcacccagcaagtcgagacccgaacccgtggtcgtttgcctccgaggcaaatccggccagggaaagagtttccttgcgaacgtgctcgcacaagcaatctccacacactacactggcagaactgattcagtttggtactgcccgcctgaccctgaccacttcgacggttacaaccaacagaccgttgttgtgatggatgatttgggccagaaccccgacggcaaggactttaagtacttcgcccagatggtttcaaccacggggttcatcccgcccatggcctcgctcgaagacaaaggcaaacctttcaacagcaaggtcatcatcgccaccaccaacctgtactcgggcttcaccccgaggaccatggtgtgccctgatgcactgaaccggaggtttcactttgacatcgat
seqidno:8
ttttccttaagggacaagaacatgctgtgtttgcctgtgt
seqidno:9
actcacatcgatgtcaaagtgaaacctcc
seqidno:10
cacgcagagtgagcaaccggctgcc
seqidno:11
cgagggcggcaagatcgctacgccgcgagg
- 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊！