本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種由枸杞子和大棗制成的保健品及其制法與檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

枸杞子，系茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium L.)落葉灌木，是起源較古老的植物之一，日本學(xué)者Fukuda研究枸杞屬植物葉綠體的DNA分子系統(tǒng)進(jìn)化，認(rèn)為枸杞屬物種起源年代應(yīng)該在29.4±9.7萬年。枸杞還是一個(gè)世界性分布的物種，該屬植物在全球呈離散性分布，約有80種，其中歐亞大陸約有10種，中亞種類較多，非洲南部20余種，北美洲南部20余種，南美洲南部分布多達(dá)30余種。中國(guó)自然分布枸杞屬植物共有7個(gè)種、3個(gè)變種?，F(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)枸杞中化學(xué)成分類型多樣，主要涉及生物堿類，黃酮類，萜類等化合物，此外，多糖及類胡蘿卜素衍生物也是枸杞中常見的成分。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)枸杞子具有多種活性，包括抗氧化、抗腫瘤、抗炎、肝保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、抗微生物及輻射保護(hù)活性等。枸杞子的藥用價(jià)值目前還未得到充分應(yīng)用。不論是藥用枸杞子品種的確定，還是枸杞子主要成分的分析，均需要更深入的研究。同時(shí)，目前枸杞子的加工產(chǎn)業(yè)僅停留在初級(jí)階段，出口產(chǎn)品主要是枸杞子干果、鮮汁和枸杞粉等，但枸杞子深加工產(chǎn)品種類較少。

大棗，系鼠李科棗屬植物棗Ziziphus jujuba Mill.var.inermis(Bunge)Rehd.的果實(shí)，最早記載于《五十二病方》，在《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，歷代諸多本草皆有闡述，其味甘平，性溫，歸心、脾、胃經(jīng)，具補(bǔ)中益氣，養(yǎng)血安神之功，因其助十二經(jīng)而和百藥，故在中醫(yī)臨床遣方用藥中屬中高頻使用的常用中藥。我國(guó)是大棗資源最豐富的國(guó)家，現(xiàn)有大棗品種704個(gè)，化學(xué)成分復(fù)雜，含有90余種成分。且藥理活性廣泛，具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗氧化、修復(fù)肝損傷、抗疲勞等作用，對(duì)造血功能以及腸道運(yùn)動(dòng)等也有改善作用。近年來得以廣泛的研究和利用，現(xiàn)有開發(fā)藥品、保健品、食品等120余種。

枸杞子和大棗配伍使用，目前也有很多研究，并形成了不少的產(chǎn)品，曲永鑫將山楂、大棗、枸杞、菊花制成復(fù)合保健飲料；陳萬更等將茶葉、枸杞、大棗、進(jìn)行發(fā)酵，制成酒茶；梁治軍等將懷山藥、大棗、山楂、枸杞制成復(fù)合保健飲料；劉慶君等將大棗、枸杞、大豆制成復(fù)合飲料；路紅波等將枸杞、大棗等制成營(yíng)養(yǎng)保健魚餅；王君高等將大棗、枸杞制成保健米酒；杜朝等將銀耳、大棗汁、枸杞果粒制成復(fù)合懸浮養(yǎng)生飲料；王立江等將將紅豆、大棗、枸杞制成復(fù)合酸乳飲料；魏鵬等將大棗、枸杞制成保健果酒；顧雨香等將大棗、枸杞、蜂蜜制成果凍；王曉華等采用響應(yīng)面法將大棗、枸杞制成復(fù)合飲料的生產(chǎn)工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究。

從現(xiàn)有的研究和產(chǎn)品可見，枸杞子和大棗配伍使用，并不少見，并形成了一定的產(chǎn)品，但這些產(chǎn)品僅僅停留在非常粗放式的飲料、果酒、保健茶等產(chǎn)品，對(duì)于將枸杞子、大棗進(jìn)行精細(xì)加工，產(chǎn)生高附加值的產(chǎn)品，還非常少見，與此同時(shí)，枸杞子、大棗配伍的使用的藥用價(jià)值也遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有開發(fā)出來。

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)作為甘肅省、乃至國(guó)家對(duì)枸杞子的重點(diǎn)研究單位，其科研人員對(duì)枸杞子進(jìn)行了很多年的研究工作，本申請(qǐng)的發(fā)明人同時(shí)還是甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目——甘肅產(chǎn)枸杞子的質(zhì)量評(píng)價(jià)(編號(hào)：148RJZA059)的項(xiàng)目組成員，對(duì)枸杞子，以及枸杞子、大棗的配伍進(jìn)行了深入的研究工作。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的提供一種有效的輔助治療股骨頭壞死的保健品。

本發(fā)明的另一目的是提供該輔助治療股骨頭壞死的保健品的制備方法。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供該輔助治療股骨頭壞死的保健品的檢測(cè)方法。

本發(fā)明的目的是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的：

一種輔助治療股骨頭壞死的保健品，該保健品由以下重量份的藥味原料制成：枸杞子1～5重量份、大棗1～5重量份。

所述的輔助治療股骨頭壞死的保健品，作為優(yōu)選，該保健品由以下重量份的藥味原料制成：枸杞子3重量份、大棗2重量份。

所述的輔助治療股骨頭壞死的保健品，其特征在于該保健品與藥學(xué)可接受的輔料制成注射劑。

所述的輔助治療股骨頭壞死的保健品，該保健品的制備方法為：

(1)取1/3處方量的枸杞子、取1/3處方量的大棗，加5～15倍量的蒸餾水煎煮3次，第1次2～4h，第2次1～3h，第3次0.5～1.5h，三次煎煮液合并，濾過，濾液濃縮至稠膏狀，冷卻后加無水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次達(dá)到60％、75％、95％，三次醇沉液合并，濾過，濾液用NaOH溶液調(diào)pH值至8～10，冷藏，靜置12～36h，濾過，濾液揮去乙醇，加入1～3倍量的乙醚，冷藏，靜置12～36h，濾過，濾液揮去乙醚，溶于水，水溶液抽濾至清，得提取液I；

(2)取1/3處方量的枸杞子、取1/3處方量的大棗，置藥材于滲漉缸中，以4～12倍量50％乙醇浸漬36～60h，收集初漉液，再用4～12倍量65％乙醇滲漉藥材至無藥味，合并兩次滲漉液，濃縮至稠粘狀，用無水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次達(dá)到80％、90％，兩次醇沉液合并，濾過，濾液用稀鹽酸調(diào)其pH值為3～5，冷藏，靜置12～36h，濾過，濾液濃縮，加無水乙醇進(jìn)行第三次醇沉，使含醇量達(dá)到95％，濾過，揮盡濾液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀鹽酸調(diào)pH值為3～5，煮沸，抽濾，濾液再用NaOH溶液調(diào)pH值為6～8，得提取液Ⅱ；

(3)取1/3處方量的枸杞子、取1/3處方量的大棗，加入5～10倍量的水，煎煮提取3次，每次0.5～2h，合并提取液，提取液濃縮成浸膏；將上述浸膏經(jīng)D101B型大孔吸附樹脂處理，先用柱體積2～10倍量的pH 1～5的水溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，再用柱體積2～10倍量的70％的乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，兩次洗脫液合并，濃縮，得到濃縮液，然后將濃縮液用堿液調(diào)節(jié)pH至10～11，在60～80℃下加熱1～2h，然后將其經(jīng)聚酰胺樹脂柱處理，用5～10倍的乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，然后在70～80℃下蒸餾，除去乙酸乙酯，得提取液Ⅲ；

(4)將以上提取液I、提取液Ⅱ、提取液Ⅲ合并，加注射用水，再加苯甲醇、氯化鈉、吐溫-80溶解于其中，并用NaOH溶液調(diào)pH值為6～8，加1％針用活性炭于溶液中煮沸5～15min，抽濾，濾液經(jīng)檢驗(yàn)合格后無菌分裝，分裝好的口服液用流通蒸汽滅菌0.5～1h，稍冷后燈檢，即得。

所述的輔助治療股骨頭壞死的保健品，作為優(yōu)選，該保健品的制備方法為：

(1)取1/3處方量的枸杞子、取1/3處方量的大棗，加10倍量的蒸餾水煎煮3次，第1次3h，第2次2h，第3次1h，三次煎煮液合并，濾過，濾液濃縮至稠膏狀，冷卻后加無水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次達(dá)到60％、75％、95％，三次醇沉液合并，濾過，濾液用NaOH溶液調(diào)pH值至9，冷藏，靜置24h，濾過，濾液揮去乙醇，加入2倍量的乙醚，冷藏，靜置24h，濾過，濾液揮去乙醚，轉(zhuǎn)溶于水，水溶液抽濾至清，得提取液I；

(2)取1/3處方量的枸杞子、取1/3處方量的大棗，置藥材于滲漉缸中，以8倍量50％乙醇浸漬48h，收集初漉液，再用8倍量65％乙醇滲漉藥材至無藥味，合并兩次滲漉液，濃縮至稠粘狀，用無水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次達(dá)到80％、90％，兩次醇沉液合并，濾過，濾液用稀鹽酸調(diào)其pH值為4，冷藏，靜置24h，濾過，濾液濃縮，加無水乙醇進(jìn)行第三次醇沉，使含醇量達(dá)到95％，濾過，揮盡濾液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀鹽酸調(diào)pH值為4，煮沸，抽濾，濾液再用NaOH溶液調(diào)pH值為7，得提取液Ⅱ；

(3)取1/3處方量的枸杞子、取1/3處方量的大棗，加入7倍量的水，煎煮提取3次，每次1h，合并提取液，提取液濃縮成浸膏；將上述浸膏經(jīng)D101B型大孔吸附樹脂處理，先用柱體積8倍量的pH 4的水溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，再用柱體積8倍量的70％的乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，兩次洗脫液合并，濃縮，得到濃縮液，然后將濃縮液用堿液調(diào)節(jié)pH至11，在70℃下加熱1.5h，然后將其經(jīng)聚酰胺樹脂柱處理，用8倍的乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，然后在75℃下蒸餾，除去乙酸乙酯，得提取液Ⅲ；

(4)將以上提取液I、提取液Ⅱ、提取液Ⅲ合并，加注射用水，再加苯甲醇、氯化鈉、吐溫-80溶解于其中，并用NaOH溶液調(diào)pH值為7，加1％針用活性炭于溶液中煮沸10min，抽濾，濾液經(jīng)檢驗(yàn)合格后無菌分裝，分裝好的口服液用流通蒸汽滅菌0.5h，稍冷后燈檢，即得。

一種輔助治療股骨頭壞死的保健品的制備方法，該保健品由以下重量份的藥味原料制成：枸杞子1～5重量份、大棗1～5重量份，其特征在于，該保健品的制備方法為：

(1)取1/3處方量的枸杞子、取1/3處方量的大棗，加5～15倍量的蒸餾水煎煮3次，第1次2～4h，第2次1～3h，第3次0.5～1.5h，三次煎煮液合并，濾過，濾液濃縮至稠膏狀，冷卻后加無水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次達(dá)到60％、75％、95％，三次醇沉液合并，濾過，濾液用NaOH溶液調(diào)pH值至8～10，冷藏，靜置12～36h，濾過，濾液揮去乙醇，加入1～3倍量的乙醚，冷藏，靜置12～36h，濾過，濾液揮去乙醚，溶于水，水溶液抽濾至清，得提取液I；

(2)取1/3處方量的枸杞子、取1/3處方量的大棗，置藥材于滲漉缸中，以4～12倍量50％乙醇浸漬36～60h，收集初漉液，再用4～12倍量65％乙醇滲漉藥材至無藥味，合并兩次滲漉液，濃縮至稠粘狀，用無水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次達(dá)到80％、90％，兩次醇沉液合并，濾過，濾液用稀鹽酸調(diào)其pH值為3～5，冷藏，靜置12～36h，濾過，濾液濃縮，加無水乙醇進(jìn)行第三次醇沉，使含醇量達(dá)到95％，濾過，揮盡濾液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀鹽酸調(diào)pH值為3～5，煮沸，抽濾，濾液再用NaOH溶液調(diào)pH值為6～8，得提取液Ⅱ；

(3)取1/3處方量的枸杞子、取1/3處方量的大棗，加入5～10倍量的水，煎煮提取3次，每次0.5～2h，合并提取液，提取液濃縮成浸膏；將上述浸膏經(jīng)D101B型大孔吸附樹脂處理，先用柱體積2～10倍量的pH 1～5的水溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，再用柱體積2～10倍量的70％的乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，兩次洗脫液合并，濃縮，得到濃縮液，然后將濃縮液用堿液調(diào)節(jié)pH至10～11，在60～80℃下加熱1～2h，然后將其經(jīng)聚酰胺樹脂柱處理，用5～10倍的乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，然后在70～80℃下蒸餾，除去乙酸乙酯，得提取液Ⅲ；

(4)將以上提取液I、提取液Ⅱ、提取液Ⅲ合并，加注射用水，再加苯甲醇、氯化鈉、吐溫-80溶解于其中，并用NaOH溶液調(diào)pH值為6～8，加1％針用活性炭于溶液中煮沸5～15min，抽濾，濾液經(jīng)檢驗(yàn)合格后無菌分裝，分裝好的口服液用流通蒸汽滅菌0.5～1h，稍冷后燈檢，即得。

所述的輔助治療股骨頭壞死的保健品的制備方法，作為優(yōu)選，該保健品由以下重量份的藥味原料制成：枸杞子3重量份、大棗2重量份，該保健品的制備方法為：

(1)取1/3處方量的枸杞子、取1/3處方量的大棗，加10倍量的蒸餾水煎煮3次，第1次3h，第2次2h，第3次1h，三次煎煮液合并，濾過，濾液濃縮至稠膏狀，冷卻后加無水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次達(dá)到60％、75％、95％，三次醇沉液合并，濾過，濾液用NaOH溶液調(diào)pH值至9，冷藏，靜置24h，濾過，濾液揮去乙醇，加入2倍量的乙醚，冷藏，靜置24h，濾過，濾液揮去乙醚，轉(zhuǎn)溶于水，水溶液抽濾至清，得提取液I；

(2)取1/3處方量的枸杞子、取1/3處方量的大棗，置藥材于滲漉缸中，以8倍量50％乙醇浸漬48h，收集初漉液，再用8倍量65％乙醇滲漉藥材至無藥味，合并兩次滲漉液，濃縮至稠粘狀，用無水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次達(dá)到80％、90％，兩次醇沉液合并，濾過，濾液用稀鹽酸調(diào)其pH值為4，冷藏，靜置24h，濾過，濾液濃縮，加無水乙醇進(jìn)行第三次醇沉，使含醇量達(dá)到95％，濾過，揮盡濾液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀鹽酸調(diào)pH值為4，煮沸，抽濾，濾液再用NaOH溶液調(diào)pH值為7，得提取液Ⅱ；

(3)取1/3處方量的枸杞子、取1/3處方量的大棗，加入7倍量的水，煎煮提取3次，每次1h，合并提取液，提取液濃縮成浸膏；將上述浸膏經(jīng)D101B型大孔吸附樹脂處理，先用柱體積8倍量的pH 4的水溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，再用柱體積8倍量的70％的乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，兩次洗脫液合并，濃縮，得到濃縮液，然后將濃縮液用堿液調(diào)節(jié)pH至11，在70℃下加熱1.5h，然后將其經(jīng)聚酰胺樹脂柱處理，用8倍的乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，然后在75℃下蒸餾，除去乙酸乙酯，得提取液Ⅲ；

(4)將以上提取液I、提取液Ⅱ、提取液Ⅲ合并，加注射用水，再加苯甲醇、氯化鈉、吐溫-80溶解于其中，并用NaOH溶液調(diào)pH值為7，加1％針用活性炭于溶液中煮沸10min，抽濾，濾液經(jīng)檢驗(yàn)合格后無菌分裝，分裝好的口服液用流通蒸汽滅菌0.5h，稍冷后燈檢，即得。

一種輔助治療股骨頭壞死的保健品的檢測(cè)方法，該保健品由以下重量份的藥味原料制成：枸杞子1～5重量份、大棗1～5重量份，該保健品的制備方法為：

(1)取1/3處方量的枸杞子、取1/3處方量的大棗，加5～15倍量的蒸餾水煎煮3次，第1次2～4h，第2次1～3h，第3次0.5～1.5h，三次煎煮液合并，濾過，濾液濃縮至稠膏狀，冷卻后加無水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次達(dá)到60％、75％、95％，三次醇沉液合并，濾過，濾液用NaOH溶液調(diào)pH值至8～10，冷藏，靜置12～36h，濾過，濾液揮去乙醇，加入1～3倍量的乙醚，冷藏，靜置12～36h，濾過，濾液揮去乙醚，溶于水，水溶液抽濾至清，得提取液I；

(2)取1/3處方量的枸杞子、取1/3處方量的大棗，置藥材于滲漉缸中，以4～12倍量50％乙醇浸漬36～60h，收集初漉液，再用4～12倍量65％乙醇滲漉藥材至無藥味，合并兩次滲漉液，濃縮至稠粘狀，用無水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次達(dá)到80％、90％，兩次醇沉液合并，濾過，濾液用稀鹽酸調(diào)其pH值為3～5，冷藏，靜置12～36h，濾過，濾液濃縮，加無水乙醇進(jìn)行第三次醇沉，使含醇量達(dá)到95％，濾過，揮盡濾液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀鹽酸調(diào)pH值為3～5，煮沸，抽濾，濾液再用NaOH溶液調(diào)pH值為6～8，得提取液Ⅱ；

(3)取1/3處方量的枸杞子、取1/3處方量的大棗，加入5～10倍量的水，煎煮提取3次，每次0.5～2h，合并提取液，提取液濃縮成浸膏；將上述浸膏經(jīng)D101B型大孔吸附樹脂處理，先用柱體積2～10倍量的pH 1～5的水溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，再用柱體積2～10倍量的70％的乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，兩次洗脫液合并，濃縮，得到濃縮液，然后將濃縮液用堿液調(diào)節(jié)pH至10～11，在60～80℃下加熱1～2h，然后將其經(jīng)聚酰胺樹脂柱處理，用5～10倍的乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，然后在70～80℃下蒸餾，除去乙酸乙酯，得提取液Ⅲ；

(4)將以上提取液I、提取液Ⅱ、提取液Ⅲ合并，加注射用水，再加苯甲醇、氯化鈉、吐溫-80溶解于其中，并用NaOH溶液調(diào)pH值為6～8，加1％針用活性炭于溶液中煮沸5～15min，抽濾，濾液經(jīng)檢驗(yàn)合格后無菌分裝，分裝好的口服液用流通蒸汽滅菌0.5～1h，稍冷后燈檢，即得；

采用HPLC法同時(shí)測(cè)定錦葵花素、大棗苷兩種成分的含量：

(1)色譜條件：色譜柱：C₁₈柱，流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.25％磷酸溶液，梯度洗脫：從0min到15min，甲醇從5.0％線性上升到20.0％，乙腈從5.0％線性上升到20.0％，0.25％磷酸溶液從90.0％線性下降至60.0％；從16min到30min，甲醇從20.0％線性上升到50.0％，乙腈從20.0％線性增上升到35.0％，0.25％磷酸溶液從60.0％線性下降至15.0％；從31min到40min，甲醇從50.0％線性下降到30.0％，乙腈從35.0％線性下降到25.0％，0.25％磷酸溶液從15.0％線性上升至45.0％；流速：0.5～2.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：0至15min，檢測(cè)波長(zhǎng)為250～270nm，16至40min，檢測(cè)波長(zhǎng)為390～410nm；柱溫：20～40℃；進(jìn)樣量：2～20μL；

(2)混合對(duì)照品溶液的制備：精密稱取錦葵花素和大棗苷對(duì)照品，分別加25％甲醇溶解并稀釋制成錦葵花素和大棗苷的單一成分對(duì)照品貯備液；精密量取兩種對(duì)照品貯備液，用25％甲醇稀釋制成混合對(duì)照品溶液；

(3)供試品溶液的制備：精密量取本口服液樣品，加25％甲醇溶解并稀釋用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；

(4)測(cè)定：精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各2～10μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。

所述的輔助治療股骨頭壞死的保健品的檢測(cè)方法，作為優(yōu)選，該保健品由以下重量份的藥味原料制成：枸杞子3重量份、大棗2重量份，該保健品的制備方法為：

(1)取1/3處方量的枸杞子、取1/3處方量的大棗，加10倍量的蒸餾水煎煮3次，第1次3h，第2次2h，第3次1h，三次煎煮液合并，濾過，濾液濃縮至稠膏狀，冷卻后加無水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次達(dá)到60％、75％、95％，三次醇沉液合并，濾過，濾液用NaOH溶液調(diào)pH值至9，冷藏，靜置24h，濾過，濾液揮去乙醇，加入2倍量的乙醚，冷藏，靜置24h，濾過，濾液揮去乙醚，轉(zhuǎn)溶于水，水溶液抽濾至清，得提取液I；

(2)取1/3處方量的枸杞子、取1/3處方量的大棗，置藥材于滲漉缸中，以8倍量50％乙醇浸漬48h，收集初漉液，再用8倍量65％乙醇滲漉藥材至無藥味，合并兩次滲漉液，濃縮至稠粘狀，用無水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次達(dá)到80％、90％，兩次醇沉液合并，濾過，濾液用稀鹽酸調(diào)其pH值為4，冷藏，靜置24h，濾過，濾液濃縮，加無水乙醇進(jìn)行第三次醇沉，使含醇量達(dá)到95％，濾過，揮盡濾液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀鹽酸調(diào)pH值為4，煮沸，抽濾，濾液再用NaOH溶液調(diào)pH值為7，得提取液Ⅱ；

(3)取1/3處方量的枸杞子、取1/3處方量的大棗，加入7倍量的水，煎煮提取3次，每次1h，合并提取液，提取液濃縮成浸膏；將上述浸膏經(jīng)D101B型大孔吸附樹脂處理，先用柱體積8倍量的pH 4的水溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，再用柱體積8倍量的70％的乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，兩次洗脫液合并，濃縮，得到濃縮液，然后將濃縮液用堿液調(diào)節(jié)pH至11，在70℃下加熱1.5h，然后將其經(jīng)聚酰胺樹脂柱處理，用8倍的乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，然后在75℃下蒸餾，除去乙酸乙酯，得提取液Ⅲ；

(4)將以上提取液I、提取液Ⅱ、提取液Ⅲ合并，加注射用水，再加苯甲醇、氯化鈉、吐溫-80溶解于其中，并用NaOH溶液調(diào)pH值為7，加1％針用活性炭于溶液中煮沸10min，抽濾，濾液經(jīng)檢驗(yàn)合格后無菌分裝，分裝好的口服液用流通蒸汽滅菌0.5h，稍冷后燈檢，即得；

采用HPLC法同時(shí)測(cè)定錦葵花素、大棗苷兩種成分的含量：

(1)色譜條件：色譜柱：C₁₈柱，流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.25％磷酸溶液，梯度洗脫：從0min到15min，甲醇從5.0％線性上升到20.0％，乙腈從5.0％線性上升到20.0％，0.25％磷酸溶液從90.0％線性下降至60.0％；從16min到30min，甲醇從20.0％線性上升到50.0％，乙腈從20.0％線性增上升到35.0％，0.25％磷酸溶液從60.0％線性下降至15.0％；從31min到40min，甲醇從50.0％線性下降到30.0％，乙腈從35.0％線性下降到25.0％，0.25％磷酸溶液從15.0％線性上升至45.0％；流速：1.2mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：0至15min，檢測(cè)波長(zhǎng)為258nm，16至40min，檢測(cè)波長(zhǎng)為405nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL；

(2)混合對(duì)照品溶液的制備：精密稱取錦葵花素和大棗苷對(duì)照品，分別加25％甲醇溶解并稀釋制成錦葵花素和大棗苷的質(zhì)量濃度均為1.0000mg/mL的單一成分對(duì)照品貯備液；精密量取兩種對(duì)照品貯備液，用25％甲醇稀釋制成錦葵花素與大棗苷質(zhì)量濃度均為0.4000mg/mL的溶液，即得混合對(duì)照品溶液；

(3)供試品溶液的制備：精密量取本口服液樣品1mL，置于10mL量瓶中，加25％甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；

(4)測(cè)定：精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。

一種保健品在制備輔助治療股骨頭壞死保健品中的應(yīng)用，該保健品由以下重量份的藥味原料制成：枸杞子3重量份、大棗2重量份，該保健品的制備方法為：

(1)取1/3處方量的枸杞子、取1/3處方量的大棗，加10倍量的蒸餾水煎煮3次，第1次3h，第2次2h，第3次1h，三次煎煮液合并，濾過，濾液濃縮至稠膏狀，冷卻后加無水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次達(dá)到60％、75％、95％，三次醇沉液合并，濾過，濾液用NaOH溶液調(diào)pH值至9，冷藏，靜置24h，濾過，濾液揮去乙醇，加入2倍量的乙醚，冷藏，靜置24h，濾過，濾液揮去乙醚，轉(zhuǎn)溶于水，水溶液抽濾至清，得提取液I；

(2)取1/3處方量的枸杞子、取1/3處方量的大棗，置藥材于滲漉缸中，以8倍量50％乙醇浸漬48h，收集初漉液，再用8倍量65％乙醇滲漉藥材至無藥味，合并兩次滲漉液，濃縮至稠粘狀，用無水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次達(dá)到80％、90％，兩次醇沉液合并，濾過，濾液用稀鹽酸調(diào)其pH值為4，冷藏，靜置24h，濾過，濾液濃縮，加無水乙醇進(jìn)行第三次醇沉，使含醇量達(dá)到95％，濾過，揮盡濾液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀鹽酸調(diào)pH值為4，煮沸，抽濾，濾液再用NaOH溶液調(diào)pH值為7，得提取液Ⅱ；

(3)取1/3處方量的枸杞子、取1/3處方量的大棗，加入7倍量的水，煎煮提取3次，每次1h，合并提取液，提取液濃縮成浸膏；將上述浸膏經(jīng)D101B型大孔吸附樹脂處理，先用柱體積8倍量的pH 4的水溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，再用柱體積8倍量的70％的乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，兩次洗脫液合并，濃縮，得到濃縮液，然后將濃縮液用堿液調(diào)節(jié)pH至11，在70℃下加熱1.5h，然后將其經(jīng)聚酰胺樹脂柱處理，用8倍的乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，然后在75℃下蒸餾，除去乙酸乙酯，得提取液Ⅲ；

(4)將以上提取液I、提取液Ⅱ、提取液Ⅲ合并，加注射用水，再加苯甲醇、氯化鈉、吐溫-80溶解于其中，并用NaOH溶液調(diào)pH值為7，加1％針用活性炭于溶液中煮沸10min，抽濾，濾液經(jīng)檢驗(yàn)合格后無菌分裝，分裝好的口服液用流通蒸汽滅菌0.5h，稍冷后燈檢，即得；

采用HPLC法同時(shí)測(cè)定錦葵花素、大棗苷兩種成分的含量：

(1)色譜條件：色譜柱：C₁₈柱，流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.25％磷酸溶液，梯度洗脫：從0min到15min，甲醇從5.0％線性上升到20.0％，乙腈從5.0％線性上升到20.0％，0.25％磷酸溶液從90.0％線性下降至60.0％；從16min到30min，甲醇從20.0％線性上升到50.0％，乙腈從20.0％線性增上升到35.0％，0.25％磷酸溶液從60.0％線性下降至15.0％；從31min到40min，甲醇從50.0％線性下降到30.0％，乙腈從35.0％線性下降到25.0％，0.25％磷酸溶液從15.0％線性上升至45.0％；流速：1.2mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：0至15min，檢測(cè)波長(zhǎng)為258nm，16至40min，檢測(cè)波長(zhǎng)為405nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL；

(2)混合對(duì)照品溶液的制備：精密稱取錦葵花素和大棗苷對(duì)照品，分別加25％甲醇溶解并稀釋制成錦葵花素和大棗苷的質(zhì)量濃度均為1.0000mg/mL的單一成分對(duì)照品貯備液；精密量取兩種對(duì)照品貯備液，用25％甲醇稀釋制成錦葵花素與大棗苷質(zhì)量濃度均為0.4000mg/mL的溶液，即得混合對(duì)照品溶液；

(3)供試品溶液的制備：精密量取本口服液樣品1mL，置于10mL量瓶中，加25％甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；

(4)測(cè)定：精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。

本發(fā)明提供以下實(shí)驗(yàn)研究資料，用以充分公開本發(fā)明的技術(shù)方案以及本發(fā)明的技術(shù)效果。

實(shí)驗(yàn)一：對(duì)輔助治療實(shí)驗(yàn)性股骨頭壞死的處方與活性部位的藥效學(xué)篩選研究

1材料與方法

1.1材料：

1.1.1動(dòng)物：Wistar大鼠乳鼠，60只，日齡10d，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(甘)2011-0001-0001011；實(shí)驗(yàn)設(shè)施合格證號(hào)：SYXK(甘)2011-0001-0000314；飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)條件下，12h明暗交替，(22±2)℃，自由攝食飲水。動(dòng)物在上述環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2試劑：醋酸潑尼松龍注射液，由華中藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。

1.1.3儀器：雙能X線骨密度儀，由上海愛申科技發(fā)展股份有限公司生產(chǎn)；微循環(huán)顯微觀察系統(tǒng)，由鄭州天益健生物科技有限公司生產(chǎn)；MTS生物材料試驗(yàn)機(jī)，由濟(jì)南美特斯測(cè)試技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.1.4受試品：

1.1.4.1血塞通注射液：由西安漢豐藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，規(guī)格：2ml:100mg，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z61021575。

1.1.4.2甲保健品口服液：

處方：枸杞子300.0g、大棗200.0g。

制備方法：(1)取100.0g枸杞子、取66.6g大棗，加10倍量的蒸餾水煎煮3次，第1次3h，第2次2h，第3次1h，三次煎煮液合并，濾過，濾液濃縮至稠膏狀，冷卻后加無水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次達(dá)到60％、75％、95％，三次醇沉液合并，濾過，濾液用NaOH溶液調(diào)pH值至9，冷藏，靜置24h，濾過，濾液揮去乙醇，加入2倍量的乙醚，冷藏，靜置24h，濾過，濾液揮去乙醚，轉(zhuǎn)溶于水，水溶液抽濾至清，得提取液I；

(2)取100.0g枸杞子、取66.6g大棗，置藥材于滲漉缸中，以8倍量50％乙醇浸漬48h，收集初漉液，再用8倍量65％乙醇滲漉藥材至無藥味，合并兩次滲漉液，濃縮至稠粘狀，用無水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次達(dá)到80％、90％，兩次醇沉液合并，濾過，濾液用稀鹽酸調(diào)其pH值為4，冷藏，靜置24h，濾過，濾液濃縮，加無水乙醇進(jìn)行第三次醇沉，使含醇量達(dá)到95％，濾過，揮盡濾液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀鹽酸調(diào)pH值為4，煮沸，抽濾，濾液再用NaOH溶液調(diào)pH值為7，得提取液Ⅱ；

(3)取100.0g枸杞子、取66.6g大棗，加入7倍量的水，煎煮提取3次，每次1h，合并提取液，提取液濃縮成浸膏；將上述浸膏經(jīng)D101B型大孔吸附樹脂處理，先用柱體積8倍量的pH 4的水溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，再用柱體積8倍量的70％的乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，兩次洗脫液合并，濃縮，得到濃縮液，然后將濃縮液用堿液調(diào)節(jié)pH至11，在70℃下加熱1.5h，然后將其經(jīng)聚酰胺樹脂柱處理，用8倍的乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，然后在75℃下蒸餾，除去乙酸乙酯，得提取液Ⅲ；

(4)將以上提取液I、提取液Ⅱ、提取液Ⅲ合并，加注射用水至1000mL，再加苯甲醇、氯化鈉、吐溫-80溶解于其中，并用NaOH溶液調(diào)pH值為7，加1％針用活性炭于溶液中煮沸10min，抽濾，濾液經(jīng)檢驗(yàn)合格后無菌分裝，分裝好的口服液用流通蒸汽滅菌0.5h，稍冷后燈檢，即得。

1.1.4.3乙保健品口服液：

處方：枸杞子300.0g、大棗200.0g。

制備方法：取干燥的枸杞子300.0g、大棗200.0g，混合，粉碎成粗粉，加入8倍重量比的70％乙醇浸漬50h，再用70％乙醇作溶劑緩慢滲濾至濾液呈微黃色，濾液在70℃下減壓濃縮得相對(duì)密度為1.25的稠膏；再加12倍水充分?jǐn)嚢璨㈧o置24h使油水分離，去除沉淀物和油脂，收集水層藥液，加入藥用活性炭靜置2h吸附藥液至無色，上聚酰胺色譜柱，用水飽和正丁醇洗脫，洗脫液在70℃下減壓濃縮后加入10倍重量的95％乙醇進(jìn)行二次乙醇提取，乙醇提液在6℃冷藏24h后過濾，濾液經(jīng)減壓濃縮后，再加入10倍重量份的水進(jìn)行水提，經(jīng)冷藏后24h，4℃離心過濾得水提液，水提液用0.3％重量比的活性炭脫色，邊加邊攪拌，并加熱至40℃后靜止1h；經(jīng)膜過濾器過濾，超濾后在40℃下減壓濃縮，得提取物稠膏；將提取物稠膏、藥用聚乙二醇、甘露醇和醫(yī)用氯化鈉混合，用注射用水稀釋，濾過，灌封、滅菌、燈檢、包裝，即得乙保健品口服液。

1.1.4.4丙保健品口服液：

處方：枸杞子300.0g、大棗200.0g。

制備方法：取干燥的枸杞子300.0g、大棗200.0g，混合，粉碎成粗粉，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取得到水蒸氣蒸餾提取物，備用；取水蒸氣蒸餾提取后的藥渣，加入8倍重量比的70％乙醇浸漬50h，再用70％乙醇作溶劑緩慢滲濾至濾液呈微黃色，濾液在70℃下減壓濃縮得相對(duì)密度為1.25的提取物稠膏；將提取物稠膏、水蒸氣蒸餾提取物、藥用聚乙二醇、甘露醇和醫(yī)用氯化鈉混合，用注射用水稀釋，濾過，灌封、滅菌、燈檢、包裝，即得丙保健品口服液。

1.1.4.5丁保健品口服液：

處方：枸杞子300.0g、大棗200.0g。

制備方法：取干燥的枸杞子300.0g、大棗200.0g，混合，粉碎成粗粉，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取得到水蒸氣蒸餾提取物，備用；取水蒸氣蒸餾提取后的藥渣，加入8倍重量比的70％乙醇浸漬50h，再用70％乙醇作溶劑緩慢滲濾至濾液呈微黃色，濾液在70℃下減壓濃縮得相對(duì)密度為1.25的稠膏；再加12倍水充分?jǐn)嚢璨㈧o置24h使油水分離，去除沉淀物和油脂，收集水層藥液，加入藥用活性炭靜置2h吸附藥液至無色，藥液經(jīng)膜過濾器過濾，超濾后在40℃下減壓濃縮，得提取物稠膏；將提取物稠膏、水蒸氣蒸餾提取物、藥用聚乙二醇、甘露醇和醫(yī)用氯化鈉混合，用注射用水稀釋，濾過，灌封、滅菌、燈檢、包裝，即得丁保健品口服液。

1.2方法：

(1)分組與給藥：動(dòng)物分成：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、血塞通注射液組、甲保健品口服液組、乙保健品口服液組、丙保健品口服液組、丁保健品口服液組，共7個(gè)組，每組10只動(dòng)物。正常對(duì)照組乳鼠不作任何處理。模型對(duì)照組乳鼠出生10d乳鼠肘關(guān)節(jié)以上剪除左前肢。自尾根部剪除尾部，燒灼止血后放回籠中，繼續(xù)由母鼠喂養(yǎng)。1個(gè)月后，開始灌服醋酸潑尼松，20mg/kg體重，隔日1次，共30d。甲保健品口服液組、乙保健品口服液組、丙保健品口服液組、丁保健品口服液組、血塞口服液給藥組：在大鼠灌服醋酸潑尼松同時(shí)每天口服灌胃給藥一次，共30d。

(2)檢測(cè)指標(biāo)：股骨骨密度，股骨強(qiáng)度、鋼性，股骨濕重、干重、灰重，股骨頭毛細(xì)血管分布觀察，股骨頭骨組織內(nèi)脂肪沉積觀察。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：

各組結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。選擇Student檢驗(yàn)進(jìn)行各組間算術(shù)平均數(shù)的差異顯著性檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1甲保健品口服液組的股骨BMD、BMC、骨強(qiáng)度、骨鋼性、AREA含量明顯高于模型對(duì)照組，也高于乙保健品口服液組、丙保健品口服液組、丁保健品口服液組(P<0.01，表1)。

2.2甲保健品口服液組的股骨濕重明顯高于模型對(duì)照組，也高于乙保健品口服液組、丙保健品口服液組、丁保健品口服液組，甲保健品口服液還可以明顯降低軟骨和骨細(xì)胞脂肪著色率，明顯高于模型對(duì)照，也高于乙保健品口服液、丙保健品口服液、丁保健品口服液(P<0.05，表2)。

2.3模型動(dòng)物的股骨頭內(nèi)毛細(xì)血管明顯稀疏，排列紊亂，單位面積內(nèi)毛細(xì)血管所占比例明顯下降。甲保健品口服液輔助治療組股骨頭內(nèi)毛細(xì)血管接近恢復(fù)正常水平股骨頭內(nèi)密布毛細(xì)血管，排列也較規(guī)律。

表1對(duì)大鼠股骨骨密度、骨礦、骨面積、骨強(qiáng)度和骨鋼性的影響(n＝10)

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，#P<0.01；與正常對(duì)照組比較，△P<0.01；與血塞通組比較，☆P<0.05，▲P<0.01

表2對(duì)大鼠股骨重量、軟骨和骨細(xì)胞脂肪著色率的影響(n＝10)

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，#P<0.01；與正常對(duì)照組比較，△P<0.01；與血塞通注射液組比較，☆P<0.05，▲P<0.01

3討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，甲保健品口服液活血化瘀用于輔助治療股骨頭壞死有較好的輔助治療作用，能增加股骨骨密度，骨礦度，骨重量，骨強(qiáng)度，骨鋼性，改善股骨上毛細(xì)血管紊亂，降低股骨骨細(xì)胞內(nèi)脂肪著色率。同時(shí)，甲保健品口服液輔助治療股骨頭壞死作用優(yōu)于乙保健品口服液、丙保健品口服液、丁保健品口服液，提示甲保健品口服液的組方及制備工藝具有明顯優(yōu)勢(shì)，在特定的組方和特定的制備方法下，具有特別突出的、預(yù)想不到的、有益的技術(shù)效果。

實(shí)驗(yàn)二：采用高效液相色譜法對(duì)本發(fā)明口服液中錦葵花素、大棗苷的含量測(cè)定方法研究

1材料

1.1儀器

1200系列HPLC儀，含1200LC型色譜工作站、G1322A型溶劑脫氣機(jī)、G1311A型四元泵、G1329A(ALS)型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1314BVWD型紫外檢測(cè)器(由美國(guó)Agilent公司生產(chǎn))；CP225D型電子天平(由深圳市新朗普電子科技有限公司生產(chǎn))；HT-230A型柱溫箱(由北京綠百草科技發(fā)展有限公司生產(chǎn))。

1.2藥品與試劑

本發(fā)明口服液：

處方：枸杞子300.0g、大棗200.0g。

制備方法：(1)取100.0g枸杞子、取66.6g大棗，加10倍量的蒸餾水煎煮3次，第1次3h，第2次2h，第3次1h，三次煎煮液合并，濾過，濾液濃縮至稠膏狀，冷卻后加無水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次達(dá)到60％、75％、95％，三次醇沉液合并，濾過，濾液用NaOH溶液調(diào)pH值至9，冷藏，靜置24h，濾過，濾液揮去乙醇，加入2倍量的乙醚，冷藏，靜置24h，濾過，濾液揮去乙醚，轉(zhuǎn)溶于水，水溶液抽濾至清，得提取液I；

(2)取100.0g枸杞子、取66.6g大棗，置藥材于滲漉缸中，以8倍量50％乙醇浸漬48h，收集初漉液，再用8倍量65％乙醇滲漉藥材至無藥味，合并兩次滲漉液，濃縮至稠粘狀，用無水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次達(dá)到80％、90％，兩次醇沉液合并，濾過，濾液用稀鹽酸調(diào)其pH值為4，冷藏，靜置24h，濾過，濾液濃縮，加無水乙醇進(jìn)行第三次醇沉，使含醇量達(dá)到95％，濾過，揮盡濾液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀鹽酸調(diào)pH值為4，煮沸，抽濾，濾液再用NaOH溶液調(diào)pH值為7，得提取液Ⅱ；

(3)取100.0g枸杞子、取66.6g大棗，加入7倍量的水，煎煮提取3次，每次1h，合并提取液，提取液濃縮成浸膏；將上述浸膏經(jīng)D101B型大孔吸附樹脂處理，先用柱體積8倍量的pH 4的水溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，再用柱體積8倍量的70％的乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，兩次洗脫液合并，濃縮，得到濃縮液，然后將濃縮液用堿液調(diào)節(jié)pH至11，在70℃下加熱1.5h，然后將其經(jīng)聚酰胺樹脂柱處理，用8倍的乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，然后在75℃下蒸餾，除去乙酸乙酯，得提取液Ⅲ；

(4)將以上提取液I、提取液Ⅱ、提取液Ⅲ合并，加注射用水至1000mL，再加苯甲醇、氯化鈉、吐溫-80溶解于其中，并用NaOH溶液調(diào)pH值為7，加1％針用活性炭于溶液中煮沸10min，抽濾，濾液經(jīng)檢驗(yàn)合格后無菌分裝，分裝好的口服液用流通蒸汽滅菌0.5h，稍冷后燈檢，即得。

錦葵花素、大棗苷對(duì)照品(由上海純優(yōu)生物科技有限公司生產(chǎn))；

流動(dòng)相用甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：C₁₈柱，規(guī)格：250mm×4.6mm，5μm；流動(dòng)相：甲醇(A)-乙腈(B)-0.25％磷酸溶液(C)，梯度洗脫(洗脫程序見表7)；流速：1.2mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：0至15min，檢測(cè)波長(zhǎng)為258nm，16至40min，檢測(cè)波長(zhǎng)為405nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

表3流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取錦葵花素和大棗苷對(duì)照品各適量，分別加25％甲醇溶解并稀釋制成錦葵花素和大棗苷的質(zhì)量濃度均為1.0000mg/mL的單一成分對(duì)照品貯備液；精密量取兩種對(duì)照品貯備液，用25％甲醇稀釋制成錦葵花素與大棗苷質(zhì)量濃度均為0.4000mg/mL的溶液，即得混合對(duì)照品溶液。

2.3供試品溶液的制備

精密量取本品1mL，置于10mL量瓶中，加25％甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4線性關(guān)系考察

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，加25％甲醇按倍比稀釋法制成系列質(zhì)量濃度的溶液。按上述色譜條件各進(jìn)樣10μL測(cè)定，記錄峰面積。以對(duì)照品質(zhì)量濃度(c)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得錦葵花素、大棗苷的回歸方程分別為：

A＝35.652C+13.268(r＝0.9998)

A＝33.265C+20.361(r＝0.9997)

結(jié)果表明，錦葵花素和大棗苷的質(zhì)量濃度分別在1.195～68.235、2.235～75.625μg/mL范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.5系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各適量，按上述色譜條件注入HPLC儀，記錄色譜圖，見附圖1和附圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在該色譜條件下，錦葵花素和大棗苷與相鄰組分峰的分離度均＞1.5，理論板數(shù)按錦葵花素峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。

2.6精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液10μL，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，重復(fù)6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，錦葵花素和大棗苷的RSD分別為0.06％、0.04％(n均為6)，表明儀器精密度良好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取同一批樣品(批號(hào)：1500305)1mL，共6份，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定10μL，記錄峰面積。結(jié)果顯示，錦葵花素和大棗苷的RSD分別為0.18％、0.13％(n均為6)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液(批號(hào)：150326)適量，分別于0、1、2、4、6、8、10、12h時(shí)按上述色譜條件進(jìn)樣10μL測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，錦葵花素和大棗苷的RSD分別為0.38％、0.32％(n均為6)，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已測(cè)定錦葵花素和大棗苷含量的紅花口服液(批號(hào)：150411)6份，各0.5mL，每2份為一組，分別按低、中、高質(zhì)量濃度精密加入錦葵花素和大棗苷對(duì)照品貯備液各適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按擬定方法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表4。

表4加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n＝9)

2.10樣品含量測(cè)定

取不同批號(hào)的紅花口服液各適量，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進(jìn)樣分析，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品中錦葵花素和大棗苷的含量，結(jié)果見表5。

表5樣品含量測(cè)定結(jié)果(mg/mL，n＝6)

3討論

3.1流動(dòng)相的選擇

發(fā)明人曾用單一流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，并比較了甲醇-水(20：80，V/V)、磷酸鹽緩沖液(pH6.5)-甲醇(70：30，V/V)、乙腈-0.2％磷酸溶液-四氫呋喃(30：60：10，V/V/V)、乙腈-0.5％磷酸溶液(10：90，V/V)等不同流動(dòng)相的試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)分離效果均不理想或只能測(cè)定單一成分。后選擇文中所用流動(dòng)相，待測(cè)的兩種成分分離較好且峰形較佳。

3.2最大吸收波長(zhǎng)的選擇

分別精密稱取錦葵花素、大棗苷對(duì)照品各適量，加適量25％甲醇溶解并稀釋制成對(duì)照品溶液，在190～600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見分光光度法掃描，發(fā)現(xiàn)錦葵花素在215、258nm波長(zhǎng)處有最大吸收，大棗苷在225、405nm波長(zhǎng)處有最大吸收，當(dāng)選擇單一波長(zhǎng)測(cè)定時(shí)，則必有其中一種成分的響應(yīng)值很小，故選用文中所用的雙波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)，同時(shí)測(cè)定兩種成分，所得結(jié)果較佳。

4結(jié)論

本試驗(yàn)所建立的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好，可用于本保健品的質(zhì)量控制。

實(shí)驗(yàn)三：不同保健品中錦葵花素、大棗苷的含量測(cè)定

1待測(cè)樣品

1.1甲保健品口服液：

處方：枸杞子300.0g、大棗200.0g。

制備方法：(1)取100.0g枸杞子、取66.6g大棗，加10倍量的蒸餾水煎煮3次，第1次3h，第2次2h，第3次1h，三次煎煮液合并，濾過，濾液濃縮至稠膏狀，冷卻后加無水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次達(dá)到60％、75％、95％，三次醇沉液合并，濾過，濾液用NaOH溶液調(diào)pH值至9，冷藏，靜置24h，濾過，濾液揮去乙醇，加入2倍量的乙醚，冷藏，靜置24h，濾過，濾液揮去乙醚，轉(zhuǎn)溶于水，水溶液抽濾至清，得提取液I；

(2)取100.0g枸杞子、取66.6g大棗，置藥材于滲漉缸中，以8倍量50％乙醇浸漬48h，收集初漉液，再用8倍量65％乙醇滲漉藥材至無藥味，合并兩次滲漉液，濃縮至稠粘狀，用無水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次達(dá)到80％、90％，兩次醇沉液合并，濾過，濾液用稀鹽酸調(diào)其pH值為4，冷藏，靜置24h，濾過，濾液濃縮，加無水乙醇進(jìn)行第三次醇沉，使含醇量達(dá)到95％，濾過，揮盡濾液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀鹽酸調(diào)pH值為4，煮沸，抽濾，濾液再用NaOH溶液調(diào)pH值為7，得提取液Ⅱ；

(3)取100.0g枸杞子、取66.6g大棗，加入7倍量的水，煎煮提取3次，每次1h，合并提取液，提取液濃縮成浸膏；將上述浸膏經(jīng)D101B型大孔吸附樹脂處理，先用柱體積8倍量的pH 4的水溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，再用柱體積8倍量的70％的乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，兩次洗脫液合并，濃縮，得到濃縮液，然后將濃縮液用堿液調(diào)節(jié)pH至11，在70℃下加熱1.5h，然后將其經(jīng)聚酰胺樹脂柱處理，用8倍的乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，然后在75℃下蒸餾，除去乙酸乙酯，得提取液Ⅲ；

(4)將以上提取液I、提取液Ⅱ、提取液Ⅲ合并，加注射用水至1000mL，再加苯甲醇、氯化鈉、吐溫-80溶解于其中，并用NaOH溶液調(diào)pH值為7，加1％針用活性炭于溶液中煮沸10min，抽濾，濾液經(jīng)檢驗(yàn)合格后無菌分裝，分裝好的口服液用流通蒸汽滅菌0.5h，稍冷后燈檢，即得。

1.2乙保健品口服液：

處方：枸杞子300.0g、大棗200.0g。

制備方法：取干燥的枸杞子300.0g、大棗200.0g，混合，粉碎成粗粉，加入8倍重量比的70％乙醇浸漬50h，再用70％乙醇作溶劑緩慢滲濾至濾液呈微黃色，濾液在70℃下減壓濃縮得相對(duì)密度為1.25的稠膏；再加12倍水充分?jǐn)嚢璨㈧o置24h使油水分離，去除沉淀物和油脂，收集水層藥液，加入藥用活性炭靜置2h吸附藥液至無色，上聚酰胺色譜柱，用水飽和正丁醇洗脫，洗脫液在70℃下減壓濃縮后加入10倍重量的95％乙醇進(jìn)行二次乙醇提取，乙醇提液在6℃冷藏24h后過濾，濾液經(jīng)減壓濃縮后，再加入10倍重量份的水進(jìn)行水提，經(jīng)冷藏后24h，4℃離心過濾得水提液，水提液用0.3％重量比的活性炭脫色，邊加邊攪拌，并加熱至40℃后靜止1h；經(jīng)膜過濾器過濾，超濾后在40℃下減壓濃縮，得提取物稠膏；將提取物稠膏、藥用聚乙二醇、甘露醇和醫(yī)用氯化鈉混合，用注射用水至1000mL，濾過，灌封、滅菌、燈檢、包裝，即得乙保健品口服液。

1.3丙保健品口服液：

處方：枸杞子300.0g、大棗200.0g。

制備方法：取干燥的枸杞子300.0g、大棗200.0g，混合，粉碎成粗粉，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取得到水蒸氣蒸餾提取物，備用；取水蒸氣蒸餾提取后的藥渣，加入8倍重量比的70％乙醇浸漬50h，再用70％乙醇作溶劑緩慢滲濾至濾液呈微黃色，濾液在70℃下減壓濃縮得相對(duì)密度為1.25的提取物稠膏；將提取物稠膏、水蒸氣蒸餾提取物、藥用聚乙二醇、甘露醇和醫(yī)用氯化鈉混合，用注射用水至1000mL，濾過，灌封、滅菌、燈檢、包裝，即得丙保健品口服液。

1.4丁保健品口服液：

處方：枸杞子300.0g、大棗200.0g。

制備方法：取干燥的枸杞子300.0g、大棗200.0g，混合，粉碎成粗粉，將其進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，從中提取得到水蒸氣蒸餾提取物，備用；取水蒸氣蒸餾提取后的藥渣，加入8倍重量比的70％乙醇浸漬50h，再用70％乙醇作溶劑緩慢滲濾至濾液呈微黃色，濾液在70℃下減壓濃縮得相對(duì)密度為1.25的稠膏；再加12倍水充分?jǐn)嚢璨㈧o置24h使油水分離，去除沉淀物和油脂，收集水層藥液，加入藥用活性炭靜置2h吸附藥液至無色，藥液經(jīng)膜過濾器過濾，超濾后在40℃下減壓濃縮，得提取物稠膏；將提取物稠膏、水蒸氣蒸餾提取物、藥用聚乙二醇、甘露醇和醫(yī)用氯化鈉混合，用注射用水至1000mL，濾過，灌封、滅菌、燈檢、包裝，即得丁保健品口服液。

2測(cè)定方法

采用本發(fā)明實(shí)驗(yàn)三提供的檢測(cè)方法對(duì)各個(gè)保健品中的活性成分進(jìn)行含量測(cè)定。

3測(cè)定結(jié)果

測(cè)定結(jié)果見表6。

表6樣品含量測(cè)定結(jié)果(mg/mL，n＝3)

4結(jié)論

從上表中可以看出，甲保健品口服液中的錦葵花素、大棗苷的含量明顯高于其他保健品，這可能也是甲保健品口服液在輔助治療股骨頭壞死方面的效果優(yōu)于其他保健品的原因，也說明本發(fā)明提供的特定的制備方法具備顯著的、預(yù)料不到的技術(shù)效果。

附圖說明：

圖1：混合對(duì)照品高效液相色譜圖；圖中：1號(hào)峰為錦葵花素；2號(hào)峰為大棗苷

圖2：供試品高效液相色譜圖；圖中：1號(hào)峰為錦葵花素；2號(hào)峰為大棗苷

具體實(shí)施方式

以下通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步闡述：

實(shí)施例1：

處方：枸杞子300.0g、大棗200.0g。

制備方法：(1)取100.0g枸杞子、取66.6g大棗，加10倍量的蒸餾水煎煮3次，第1次3h，第2次2h，第3次1h，三次煎煮液合并，濾過，濾液濃縮至稠膏狀，冷卻后加無水乙醇沉淀3次，每次含醇量依次達(dá)到60％、75％、95％，三次醇沉液合并，濾過，濾液用NaOH溶液調(diào)pH值至9，冷藏，靜置24h，濾過，濾液揮去乙醇，加入2倍量的乙醚，冷藏，靜置24h，濾過，濾液揮去乙醚，轉(zhuǎn)溶于水，水溶液抽濾至清，得提取液I；

(2)取100.0g枸杞子、取66.6g大棗，置藥材于滲漉缸中，以8倍量50％乙醇浸漬48h，收集初漉液，再用8倍量65％乙醇滲漉藥材至無藥味，合并兩次滲漉液，濃縮至稠粘狀，用無水乙醇沉淀2次，每次含醇量依次達(dá)到80％、90％，兩次醇沉液合并，濾過，濾液用稀鹽酸調(diào)其pH值為4，冷藏，靜置24h，濾過，濾液濃縮，加無水乙醇進(jìn)行第三次醇沉，使含醇量達(dá)到95％，濾過，揮盡濾液中的乙醇，加注射用水溶解，水溶液用稀鹽酸調(diào)pH值為4，煮沸，抽濾，濾液再用NaOH溶液調(diào)pH值為7，得提取液Ⅱ；

(3)取100.0g枸杞子、取66.6g大棗，加入7倍量的水，煎煮提取3次，每次1h，合并提取液，提取液濃縮成浸膏；將上述浸膏經(jīng)D101B型大孔吸附樹脂處理，先用柱體積8倍量的pH 4的水溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，再用柱體積8倍量的70％的乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，兩次洗脫液合并，濃縮，得到濃縮液，然后將濃縮液用堿液調(diào)節(jié)pH至11，在70℃下加熱1.5h，然后將其經(jīng)聚酰胺樹脂柱處理，用8倍的乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，然后在75℃下蒸餾，除去乙酸乙酯，得提取液Ⅲ；

(4)將以上提取液I、提取液Ⅱ、提取液Ⅲ合并，加注射用水至1000mL，再加苯甲醇、氯化鈉、吐溫-80溶解于其中，并用NaOH溶液調(diào)pH值為7，加1％針用活性炭于溶液中煮沸10min，抽濾，濾液經(jīng)檢驗(yàn)合格后無菌分裝，分裝好的口服液用流通蒸汽滅菌0.5h，稍冷后燈檢，即得。

采用高效液相色譜法對(duì)本發(fā)明口服液中錦葵花素、大棗苷的含量進(jìn)行測(cè)定

(1)色譜條件：色譜柱：C₁₈柱，流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.25％磷酸溶液，梯度洗脫：從0min到15min，甲醇從5.0％線性上升到20.0％，乙腈從5.0％線性上升到20.0％，0.25％磷酸溶液從90.0％線性下降至60.0％；從16min到30min，甲醇從20.0％線性上升到50.0％，乙腈從20.0％線性增上升到35.0％，0.25％磷酸溶液從60.0％線性下降至15.0％；從31min到40min，甲醇從50.0％線性下降到30.0％，乙腈從35.0％線性下降到25.0％，0.25％磷酸溶液從15.0％線性上升至45.0％；流速：1.2mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：0至15min，檢測(cè)波長(zhǎng)為258nm，16至40min，檢測(cè)波長(zhǎng)為405nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL；

(2)混合對(duì)照品溶液的制備：精密稱取錦葵花素和大棗苷對(duì)照品，分別加25％甲醇溶解并稀釋制成錦葵花素和大棗苷的質(zhì)量濃度均為1.0000mg/mL的單一成分對(duì)照品貯備液；精密量取兩種對(duì)照品貯備液，用25％甲醇稀釋制成錦葵花素與大棗苷質(zhì)量濃度均為0.4000mg/mL的溶液，即得混合對(duì)照品溶液；

(3)供試品溶液的制備：精密量取本口服液樣品1mL，置于10mL量瓶中，加25％甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；

(4)測(cè)定：精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定；

(5)測(cè)定結(jié)果：本口服液樣品種錦葵花素、大棗苷的含量分別為0.207mg/mL、0.452mg/mL。