本發(fā)明屬于中藥二次開發(fā)的制劑領(lǐng)域，具體涉及一種基于處方有效成分物化性質(zhì)，采用現(xiàn)代制藥技術(shù)改進(jìn)制備方法，尤其涉及一種新生化顆粒的制備方法。

背景技術(shù)：

新生化顆粒來源于清代傅青山的婦科名著《傅青主女科》的“生化湯”，由當(dāng)歸、川芎、桃仁、益母草、紅花、炙甘草和干姜炭7味中藥組成，具有活血、祛瘀、止痛的功效，歷來被稱為“產(chǎn)后第一方”。處方中藥材粗粉投料，提取揮發(fā)油后，粉碎成粗粉提取揮發(fā)油。蒸鎦后的水溶液另器收集。藥渣再加水煎煮二次，第一次2小時(shí)，第二次1.5小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液與上述溶液合并，濃縮成稠膏，加入紅糖適量，混勻，制成顆粒；于60℃烘干，粉碎，用乙醇制成顆粒，噴入揮發(fā)油，即得。采用傳統(tǒng)工藝制備的新生化顆粒存在服藥量大，生產(chǎn)工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有待于提升。

處方中含有當(dāng)歸、川芎等富有揮發(fā)性藥效成分的藥材，其成分沸點(diǎn)高，揮發(fā)油提取困難，且水蒸汽蒸餾時(shí)不易油水分層，一般方法得不到揮發(fā)油。處方中的紅花、當(dāng)歸、川芎富含黃酮、酚酸類成分，結(jié)構(gòu)中含有酚羥基、雙鍵等，具有熱不穩(wěn)定性，在成分分離精制過程中已轉(zhuǎn)化分解從而影響產(chǎn)品質(zhì)量、造成資源浪費(fèi)。

樹脂精制根據(jù)其分離特點(diǎn)包括大孔樹脂、聚酰胺、陰（陽）離子交換樹脂等，根據(jù)成分與樹脂間的范德華引力、氫鍵及分子篩性等效應(yīng)對中藥制劑的有效成分進(jìn)行富集純化。

基于上述背景，提供一種新生化顆粒的制備方法，實(shí)現(xiàn)有效成分的高效富集，提升產(chǎn)品質(zhì)量均一性和生產(chǎn)技術(shù)水平，降低患者服藥量，具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種新生化顆粒的制備方法，以實(shí)現(xiàn)中藥制劑的有效成分高效富集，提升產(chǎn)品質(zhì)量均一性和生產(chǎn)技術(shù)水平，降低患者服藥量。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種新生化顆粒的制備方法，包含以下步驟：

a.按以下重量份配比稱取原料：益母草20-40份，當(dāng)歸20-30份，川芎8-10份，桃仁2-5份，炙甘草1-5份，干姜炭1-5份，紅花1-5份；

b.取益母草加水煎煮1-3次，每次為8-10倍加水量，提取時(shí)間均為1小時(shí)，提取液用1000-5000da超濾膜去除大分子雜質(zhì)，采用截留分子量100-800da納濾膜去除小分子雜質(zhì)及脫水濃縮至比重1.10，得益母草總生物堿；

c.取當(dāng)歸、川芎粉碎成粗粉，超臨界萃取裝置提取揮發(fā)油，50-90%乙醇為夾帶劑，萃取壓力為30-45mpa，溫度35-55℃，制備得到揮發(fā)油，稱取β-環(huán)糊精400-800份純化溶解，對揮發(fā)油進(jìn)行分散包合，包合溶液采用10000-50000da截留分子量的超濾膜分離，收集包合物超濾液；

d.取桃仁、炙甘草、干姜炭、紅花與步驟c中的當(dāng)歸、川芎藥渣合并，加8-12倍量水進(jìn)行水蒸汽蒸餾收集蒸餾液，蒸餾液加β-環(huán)糊精80-160份攪拌，采用截留分子量100-500da納濾膜脫水濃縮，至比重1.10，得揮發(fā)油提取物；

e.步驟d蒸餾后的水提取液放出，藥渣再加8-10倍水量，煎煮1-2小時(shí)，合并提取液，10%鹽酸水溶液調(diào)ph值2-3，采用大孔樹脂吸附分離，水洗2-4倍柱體積后，采用濃度50-85%濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收至比重1.10，得黃酮、多酚、苷類提取物；

f.將步驟b益母草總生物堿，步驟c包合物超濾液，步驟d揮發(fā)油提取物，步驟e黃酮、多酚、苷類提取物合并，加入紅糖粉采用一步制粒法制粒，整粒，即得新生化顆粒制粒。

本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)方案為：

一種新生化顆粒的制備方法，包含以下步驟：

a.按以下重量份配比稱取原料：益母草30份，當(dāng)歸24份，川芎9份，桃仁3份，炙甘草3份，干姜炭3份，紅花3份；

b.取益母草加水煎煮2次，每次為10倍加水量，提取時(shí)間均為1小時(shí)，提取液用1000da超濾膜去除大分子雜質(zhì)，采用截留分子量300da復(fù)合聚酰胺材質(zhì)納濾膜去除小分子雜質(zhì)及脫水濃縮，至比重1.10，得益母草總生物堿;

c.取當(dāng)歸、川芎粉碎成粗粉，超臨界萃取裝置提取揮發(fā)油，80%乙醇為夾帶劑，萃取壓力為35mpa，溫度45℃，制備得到的揮發(fā)油55ml，稱取600gβ-環(huán)糊精純化溶解，對揮發(fā)油進(jìn)行分散包合，包合溶液采用5萬截留分子量的超濾膜分離，收集包合物超濾液;

d.取桃仁、炙甘草、干姜炭、紅花與步驟c中的當(dāng)歸、川芎藥渣合并，加水10倍量水進(jìn)行水蒸汽蒸餾，收集蒸餾液，蒸餾液加β-環(huán)糊精100g攪拌20min，采用截留分子量300da復(fù)合聚酰胺材質(zhì)納濾膜脫水濃縮，至比重1.10，得揮發(fā)油提取物；

e.步驟d蒸餾后的水提取液放出，藥渣再加量8倍水，煎煮1.5小時(shí)，合并提取液，10%鹽酸水溶液調(diào)ph值2，采用大孔樹脂吸附分離，水洗3倍柱體積后，采用濃度75%濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收至比重1.10，得黃酮、多酚、苷類提取物；

f.將步驟b益母草總生物堿，步驟c包合物超濾液，步驟d揮發(fā)油提取物，步驟e黃酮、多酚、苷類提取物合并，加入紅糖粉采用一步制粒法制粒，整粒，即得新生化顆粒制粒。

本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)方案為：

所述步驟b中的陽離子交換樹脂型號為d-001、d-113、001×8中的一種。

所述步驟b和c中的超濾膜的材質(zhì)為聚醚砜、聚偏氟乙烯和纖維素中的一種。

所述步驟b和d中的納濾膜為芳香聚酰胺類復(fù)合膜、聚哌嗪酰胺類復(fù)合膜和磺化聚醚砜類復(fù)合膜中的一種。

所述步驟e中的打孔樹脂型號為d-101、ab-8、hpd-800中的一種。

所述步驟f中紅糖的重量份為180-340份。

本發(fā)明對處方中的有效成分，針對結(jié)構(gòu)類型進(jìn)行針對性富集，益母草采用超濾與納濾相組合的精制方法富集生物堿，采用聚酰胺樹脂對紅花、桃仁、川芎、當(dāng)歸、甘草、干姜中黃酮、皂苷、酚酸、苦杏仁苷等有機(jī)化合物富集，進(jìn)一步采用一定濃度的乙醇洗脫、回收制備；其中當(dāng)歸、川芎的揮發(fā)油在大生產(chǎn)中難以提取獲得，采用水蒸汽蒸餾制備蒸餾液，蒸餾液加β-環(huán)糊攪拌包合后，再納濾濃縮的方法提升納濾對溶質(zhì)成分的截留率，得到高含量揮發(fā)油提取物，解決了川芎、當(dāng)歸生產(chǎn)中揮發(fā)油揮難以提取而影響產(chǎn)品質(zhì)量的技術(shù)難題，實(shí)現(xiàn)高效富集。

本發(fā)明采用超臨界萃取可以對揮發(fā)性成分有效富集。同時(shí)，通過環(huán)糊精包合與超濾技術(shù)聯(lián)用，在提升揮發(fā)油水溶性的同時(shí)，通過膜分離界面效應(yīng)實(shí)現(xiàn)水溶液中締合態(tài)及游離態(tài)揮發(fā)油有效分離，降低了游離態(tài)揮發(fā)油對新生化顆粒成品在運(yùn)輸、儲(chǔ)藏時(shí)因?yàn)槌煞謸p失影響產(chǎn)品質(zhì)量的技術(shù)難題。本發(fā)明結(jié)合膜分離的技術(shù)優(yōu)勢，采用納濾技術(shù)對其提取液進(jìn)行濃縮富集，通過常溫化處理，有效成分得到有效富集。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

（1）采用超臨界萃取與水蒸氣蒸餾相結(jié)合的方法，保障了處方中揮發(fā)性成分的提取效率，并進(jìn)而采用環(huán)糊精包合技術(shù)，在提升藥效的、實(shí)現(xiàn)資源合理利用的同時(shí)，提升了顆粒質(zhì)量。

（2）處方藥材中熱敏性成分通過納濾實(shí)現(xiàn)常溫富集富集，杜絕了采用常規(guī)熱濃縮造成的有效成分損失，同時(shí)也是的本發(fā)明更為標(biāo)準(zhǔn)、可控。

（3）實(shí)現(xiàn)有效成分的高效富集，采用樹脂精制技術(shù)，去除蛋白、鞣制等大分子物質(zhì)，降低制劑中間體浸膏量，保障療效的同時(shí)，減少患者服藥量。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：新生化顆粒的制備

分別稱取益母草30kg，當(dāng)歸24kg，川芎9kg，桃仁3kg，炙甘草3kg，干姜炭3kg，紅花3kg；

取益母草加水煎煮1次，每次為10倍加水量，提取時(shí)間均為1小時(shí)，提取液用1000da超濾膜去除大分子雜質(zhì)，采用截留分子量300da復(fù)合聚酰胺材質(zhì)納濾膜去除小分子雜質(zhì)及脫水濃縮，至比重1.10，得益母草總生物堿。

取當(dāng)歸、川芎粉碎成粗粉，超臨界萃取裝置提取揮發(fā)油，80%乙醇為夾帶劑，萃取壓力為35mpa，溫度45℃，制備得到的揮發(fā)油55ml，稱取600gβ-環(huán)糊精純化溶解，對揮發(fā)油進(jìn)行分散包合，包合溶液采用5萬截留分子量的超濾膜分離，收集包合物超濾液。

取桃仁、炙甘草、干姜炭、紅花與上述步驟中的當(dāng)歸、川芎藥渣合并，加10倍量水進(jìn)行水蒸汽蒸餾，收集蒸餾液，蒸餾液加β-環(huán)糊精100g攪拌20min，采用截留分子量300da復(fù)合聚酰胺材質(zhì)納濾膜脫水濃縮，至比重1.10，得揮發(fā)油提取物；

上述步驟蒸餾后的水提取液放出，藥渣再加量8倍水，煎煮1.5小時(shí)，合并提取液，10%鹽酸水溶液調(diào)ph值2，采用d101型大孔樹脂吸附分離，水洗3倍柱體積后，采用濃度75%濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收至比重1.10，得黃酮、多酚、苷類提取物。

合并益母草總生物堿、包合物超濾液、揮發(fā)油提取物及黃酮、多酚、苷類提取物，用紅糖粉250g一步制粒法制粒，整粒即得新生化顆粒制粒。

實(shí)施例2：新生化顆粒的制備

分別稱取益母草20kg，當(dāng)歸20kg，川芎8kg，桃仁2kg，炙甘草1kg，干姜炭1kg，紅花1kg；

取益母草加水煎煮2次，每次為8倍加水量，提取時(shí)間均為1小時(shí)，提取液用1000da超濾膜去除大分子雜質(zhì)，采用截留分子量300da復(fù)合聚酰胺材質(zhì)納濾膜去除小分子雜質(zhì)及脫水濃縮，至比重1.10，得益母草總生物堿。

取當(dāng)歸、川芎粉碎成粗粉，超臨界萃取裝置提取揮發(fā)油，5%乙醇為夾帶劑，萃取壓力為30mpa，溫度35℃，制備得到的揮發(fā)油55ml，稱取400gβ-環(huán)糊精純化溶解，對揮發(fā)油進(jìn)行分散包合，包合溶液采用5萬截留分子量的超濾膜分離，收集包合物超濾液。

取桃仁、炙甘草、干姜炭、紅花與上述步驟中的當(dāng)歸、川芎藥渣合并，加8倍量水進(jìn)行水蒸汽蒸餾，收集蒸餾液，蒸餾液加β-環(huán)糊精80g攪拌20min，采用截留分子量300da復(fù)合聚酰胺材質(zhì)納濾膜脫水濃縮，至比重1.10，得揮發(fā)油提取物；

上述步驟蒸餾后的水提取液放出，藥渣再加量8倍水，煎煮1小時(shí)，合并提取液，10%鹽酸水溶液調(diào)ph值2，采用d101型大孔樹脂吸附分離，水洗2倍柱體積后，采用濃度55%濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收至比重1.10，得黃酮、多酚、苷類提取物。

合并益母草總生物堿、包合物超濾液、揮發(fā)油提取物及黃酮、多酚、苷類提取物，用紅糖粉180g一步制粒法制粒，整粒即得新生化顆粒制粒。

實(shí)施例3：新生化顆粒的制備

分別稱取益母草40kg，當(dāng)歸30kg，川芎10kg，桃仁5kg，炙甘草5kg，干姜炭5kg，紅花5kg；

取益母草加水煎煮3次，每次為10倍加水量，提取時(shí)間均為1小時(shí)，提取液用1000da超濾膜去除大分子雜質(zhì)，采用截留分子量300da復(fù)合聚酰胺材質(zhì)納濾膜去除小分子雜質(zhì)及脫水濃縮，至比重1.10，得益母草總生物堿。

取當(dāng)歸、川芎粉碎成粗粉，超臨界萃取裝置提取揮發(fā)油，90%乙醇為夾帶劑，萃取壓力為45mpa，溫度55℃，制備得到的揮發(fā)油55ml，稱取800gβ-環(huán)糊精純化溶解，對揮發(fā)油進(jìn)行分散包合，包合溶液采用5萬截留分子量的超濾膜分離，收集包合物超濾液。

取桃仁、炙甘草、干姜炭、紅花與上述步驟中的當(dāng)歸、川芎藥渣合并，加水12倍量水進(jìn)行水蒸汽蒸餾，收集蒸餾液，蒸餾液加β-環(huán)糊精160g攪拌20min，采用截留分子量300da復(fù)合聚酰胺材質(zhì)納濾膜脫水濃縮，至比重1.10，得揮發(fā)油提取物；

上述步驟蒸餾后的水提取液放出，藥渣再加量10倍水，煎煮2小時(shí)，合并提取液，10%鹽酸水溶液調(diào)ph值3，采用d101型大孔樹脂吸附分離，水洗4倍柱體積后，采用濃度75%濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，回收至比重1.10，得黃酮、多酚、苷類提取物。

合并益母草總生物堿、包合物超濾液、揮發(fā)油提取物及黃酮、多酚、苷類提取物，用紅糖粉340g一步制粒法制粒，整粒即得新生化顆粒制粒。

實(shí)施例4：新生化顆粒質(zhì)量評價(jià)

將實(shí)施例1-3制備得到的新生化顆粒與常規(guī)生產(chǎn)工藝中的有效成分進(jìn)行對比分析，檢測方法為：

樣品制備：精密稱取裝量差異項(xiàng)下的樣品3g，于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20ml，稱定重量，超聲處理1小時(shí)，取出放冷，用甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得，金液相檢測。

阿魏酸檢測條件：：zorbaxsb-c18色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸水溶液（11:89）為流動(dòng)相，檢測波長：316nm，流速：1ml/min;水蘇堿檢測條件：用丙基酰胺鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.2%乙酸水溶液(87：13)為流動(dòng)相；蒸發(fā)光散射條件：溫度78℃，氣體流速2.0l/min;蒿本內(nèi)酯檢測條件：zorbaxsb-c18色譜柱，以甲醇-1%乙酸水溶液(75：25)為流動(dòng)相，檢測波長280nm，流速：1ml/min;羥基紅花黃色素檢測條件：zorbaxsb-c18色譜柱，以甲醇-0.5%磷酸水溶液(40：60)為流動(dòng)相，檢測波長400nm，流速：0.8ml/min;苦杏仁苷檢測條件：zorbaxsb-c18色譜柱，以水-甲醇-乙腈(75:20:5)流動(dòng)相，檢測波長210nm，流速：0.8ml/min;6-姜酚檢測條件：zorbaxsb-c18色譜柱，以甲醇-1%乙酸水溶液(50:50)流動(dòng)相，檢測波長280nm，流速：1ml/min;甘草苷檢測條件：kromasil-c18色譜柱，乙腈-0.5%乙酸水溶液(20:80)為流動(dòng)相，檢測波長276nm，流速：1ml/min;甘草酸檢測條件：流動(dòng)相為甲醇-0.2mol·l^-1乙酸銨溶液-冰乙酸(67:32:1)，檢測波長252nm，，流速：1ml/min;結(jié)果見表1。

表1不同生產(chǎn)工藝制備的新生化顆粒質(zhì)量對比

本發(fā)明通過采用樹脂精制、膜分離等現(xiàn)代制藥工藝，制備得到的新生化顆粒中酚酸、黃酮、生物堿及揮發(fā)性成分均明顯高于常規(guī)生產(chǎn)工藝，質(zhì)量得到提升的同時(shí)，生產(chǎn)控制較常規(guī)工藝更容易實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化控制及質(zhì)量溯源系統(tǒng)的建立。

實(shí)施例5：對大鼠在體子宮平滑肌的影響

實(shí)驗(yàn)方法：將sd大鼠按照雌雄比例2：1合籠，上午8:00檢查雌鼠陰栓或陰道涂片，以發(fā)現(xiàn)陰栓或精子的當(dāng)天為妊娠第1天。隨機(jī)將妊娠大鼠分為正常妊娠組、米非司酮組、新生化顆粒低、中、高劑量組，共5組，每組10只。于妊娠第7天，正常妊娠組8時(shí)、18時(shí)按照2ml/100g體重灌胃1次生理鹽水，其余各組大鼠8時(shí)灌胃米非司酮8.3mg/kg，18時(shí)按照100μg/kg灌胃造模。妊娠第8天始，正常妊娠組和米非司酮組每天灌胃生理鹽水2ml/100g，新生化顆粒低、中、高劑量組39.3、59.0、78.8g/kg。妊娠第14天，除正常妊娠組外，其余各組大鼠稱重后以25%烏拉坦(12g/kg)腹腔注射麻醉。固定于臺上，開腹并找出一側(cè)子宮角，輕輕剝離周圍組織。在該側(cè)子宮角選取長約2cm的一段，將其拉過塑料筒底部橡膠膜中央的卵圓孔，用連有棉線的蛙心夾輕輕夾??；連接肌肉張力換能器，固定好麥?zhǔn)显〔?，并在槽?nèi)注入36~37℃的臺氏液20ml，恒溫水槽保持工作溫度在(37±0.5)℃，并不斷向營養(yǎng)液中通氧(60~80個(gè)氣泡/min)，待子宮收縮平穩(wěn)后(約10~20min)，通過生理記錄儀記錄各組給藥前及灌胃給生理鹽水、新生化顆粒低、中、高劑量組之后30、60、90min的子宮平滑肌活動(dòng)曲線。觀察子宮活動(dòng)力(頻率×幅度)。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2新生化顆粒對大鼠在體子宮收縮活動(dòng)力的影響（）

注:與米非司酮組對比，*p<0.05，**p<0.01；與給藥前對比，#p<0.05，##p<0.01。

新生化顆粒中劑量組給藥后30、60min能顯著增加子宮平滑肌收縮活動(dòng)力(p<0.05，p<0.01)。新生化中、高劑量組相對于米非司酮在30、60min能顯著增加子宮平滑肌收縮活動(dòng)力(p<0.05，p<0.01)。

實(shí)施例6：對小鼠出、凝血時(shí)間的影響

將昆明種健康小白鼠70只，隨機(jī)分為空白對照組、新生化顆粒低、中、高劑量組，每組14只，雌雄各半。空白對照組每天灌胃生理鹽水2ml/100g，低、中、高劑量組依次灌胃新生化顆粒57.7、86.5、115.4g/kg·d。每天給藥1次，連續(xù)7d。于末次給藥后60min，分別用利剪將小鼠尾巴自距離尾尖0.5cm處橫斷，待血液自行溢出時(shí)開始用秒表計(jì)時(shí)，每隔30s用濾紙吸去血滴1次，直至血液自然停止（濾紙吸時(shí)無血）為止，計(jì)算出血時(shí)間。將小鼠斷尾端溢出血液，分別滴于清潔載玻片上的兩端，立即開始計(jì)時(shí)，此后每隔30s用干燥針頭自血滴邊緣挑動(dòng)1次，至針頭能挑起纖維蛋白絲為止，即為凝血時(shí)間。另一滴血供復(fù)試。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3新生化顆粒對小鼠出、凝血時(shí)間的影響（）

注:與空白組組對比，*p<0.05，**p<0.01。

新生化顆粒中、高劑量組能明顯延長消除的出血及凝血時(shí)間，與空白對照組比較有較顯著性差異(p<0.05)。低劑量組有延長小鼠出、凝血時(shí)間的趨勢。

實(shí)施例7：新生化顆粒中揮發(fā)性成分穩(wěn)定性考察

采用實(shí)施例1中的新生化顆粒制備方法，制備得到的新生化顆粒，選擇揮發(fā)性成分中的蒿本內(nèi)酯進(jìn)行穩(wěn)定性考察，結(jié)果見表4。

表4新生化顆粒穩(wěn)定性

通過穩(wěn)定性考察發(fā)現(xiàn)新生化顆粒中的揮發(fā)性成分蒿本內(nèi)酯含量相對穩(wěn)定，以β-環(huán)糊精-揮發(fā)油締合態(tài)形式存在可以有效提升顆粒劑中揮發(fā)油的穩(wěn)定性，從而保障質(zhì)量的均一性和臨床藥效。