本發(fā)明屬于生物材料及免疫治療領域，具體涉及一種磷酸化殼聚糖作為免疫佐劑在疫苗治療中的應用。
背景技術：
：殼聚糖因具有良好的生物相容性、生物活性、生物可降解性、生物粘附性等優(yōu)點而被廣泛研究。有研究證明，殼聚糖作為抗原遞送載體可顯著提高亞單位疫苗的免疫活性。然而由于殼聚糖只溶解在稀酸條件下，這使其在生物醫(yī)學應用領域受到很大的限制。為了克服此缺點，研發(fā)人員將殼聚糖進行水溶性改性并用于制備免疫佐劑已經(jīng)有較多的報道。目前國內(nèi)外更多的研究是將殼聚糖季銨化，并用于提高亞單位疫苗的igg抗體效價和血凝抑制抗體水平(amidi,m.,etal.,n-trimethylchitosan(tmc)nanoparticlesloadedwithinfluenzasubunitantigenforintranasalvaccination:biologicalpropertiesandimmunogenicityinamousemodel[j].vaccine,2007.25(1):p.144-153.)。而殼聚糖含磷衍生物磷酸化殼聚糖除了具有殼聚糖的優(yōu)點外，最重要的是具有良好的水溶性，因此在生物醫(yī)學應用領域備受關注。目前對磷酸化殼聚糖的研究集中在合成、表征及其組織再生與修復應用方面(孫國棟，李志忠等，殼聚糖/亞磷酸化殼聚糖復合海綿復合人臍帶間充質干細胞用于異位成骨的實驗研究，中國修復重建外科雜志，2011年12期)，而尚沒發(fā)現(xiàn)將磷酸化殼聚糖(pcs)作為免疫佐劑用于疫苗治療的相關研究。隨著現(xiàn)代醫(yī)學技術的發(fā)展，疫苗已經(jīng)被視為可最有效地防止和根除威脅生命的傳染病如肝炎、肺結核等，可保護機體免受不同病原體的感染。大部分傳統(tǒng)疫苗來源于具有良好免疫原性的病原體漿液或裂解物，然而此類疫苗的不徹底減毒和滅活將會引發(fā)一系列安全問題。隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展，不同類型的新型疫苗被廣泛開發(fā)如重組亞單位疫苗、dna疫苗和合成肽疫苗，然而即使該類疫苗具有較高的純度和安全性，不足的是他們具有免疫原性較低等缺點。因此設計具有更高的免疫原性、安全性，同時能有效增強機體特異性免疫應答的免疫佐劑成為首要任務。免疫佐劑是一類能幫助遞送抗原、活化抗原遞呈細胞(apc)并引發(fā)機體免疫細胞的活化與分化的非特異性免疫刺激分子。理想的免疫佐劑必須包括以下幾個條件：他們必須便宜且可規(guī)模生產(chǎn)；他們必須安全用于人體；他們可提高抗原的免疫原性并增強體液和細胞免疫應答。而目前傳統(tǒng)的佐劑主要是弗氏完全佐劑和鋁佐劑。弗氏完全佐劑主要用于實驗室，雖然能有效提高機體的體液和細胞免疫反應，但對機體具有毒副作用。而鋁佐劑是唯一一種被批準用于臨床治療的佐劑，但具有誘導細胞免疫能力較弱和引發(fā)局部炎癥反應等缺點。因此研究開發(fā)新型、安全并且能有效誘導細胞和體液免疫的免疫佐劑具有重大的意義。技術實現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種磷酸化殼聚糖作為免疫佐劑在疫苗治療中的應用。用于增強機體抗原特異性免疫應答。本發(fā)明所要解決的第一個技術問題是，提供一種水溶性的磷酸化殼聚糖作為疫苗佐劑。為解決該技術問題，本發(fā)明采用均相法合成水溶性磷酸化殼聚糖。作為免疫佐劑，所述的磷酸化殼聚糖能溶于生理鹽水中，且磷酸化殼聚糖生理鹽水溶液濃度設置分別為1mg/ml、10mg/ml、30mg/ml。本發(fā)明要解決的第二個技術問題是，提供制備的磷酸化殼聚糖作為免疫佐劑用于疫苗治療的應用。所述的疫苗治療免疫方式為腿部肌肉注射，所述的疫苗為模型疫苗卵清蛋白ova抗原。本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：本發(fā)明提供一種磷酸化殼聚糖作為免疫佐劑的應用。所述的磷酸化殼聚糖作為免疫佐劑在疫苗治療中的應用。所述的疫苗治療免疫方式為腿部肌肉注射；所述的疫苗為模型疫苗卵清蛋白ova抗原；配制磷酸化殼聚糖/ova生理鹽水溶液，其為1～30mg/mlpcs/ova；優(yōu)選為10～30mg/mlpcs/ova；更優(yōu)選為30mg/mlpcs/ova。所述的疫苗治療方法主要包括以下步驟：1)配制濃度梯度的磷酸化殼聚糖/ova生理鹽水溶液，分別為1mg/mlpcs/ova、10mg/mlpcs/ova、30mg/mlpcs/ova。2)分別用不同濃度的磷酸化殼聚糖/ova生理鹽水溶液免疫小鼠。對小鼠進行三次腿部肌肉注射，每次注射間隔時間為10天。3)第三次免疫10天后，眼球取血，分離血清；取脾臟，制備不同濃度的脾細胞懸液。4)通過elisa、elispot、流式細胞儀、免疫組化、動物活體成像等方法考察磷酸化殼聚糖作為免疫佐劑能否顯著誘導機體產(chǎn)生抗原特異性免疫應答，并且研究其是否具有磷酸化殼聚糖濃度依賴性。本發(fā)明的機理是：磷酸化殼聚糖基佐劑與傳統(tǒng)免疫佐劑的作用機理不同。磷酸化殼聚糖作為佐劑用于疫苗治療具有以下的優(yōu)勢：第一，生物可降解的磷酸化殼聚糖制備簡單、來源豐富、無致突性、無毒副作用，具有良好的生物相容性。第二，磷酸化殼聚糖具有良好的水溶性、生物粘附性且?guī)жS富的正電荷，可高效包裹帶負電荷的抗原，并通過靜電相互作用粘附于帶負電荷的細胞膜，使抗原更有效的被抗原遞呈細胞(apc)識別、攝取。此外磷酸化殼聚糖能保護抗原免受體內(nèi)的酸、堿、蛋白酶等破壞，提高抗原的利用率。第三，我們也研究發(fā)現(xiàn)，憑借良好的生物粘性、ph響應性和帶電性，當將磷酸化殼聚糖/抗原疫苗免疫于機體內(nèi)時，磷酸化殼聚糖對包裹的抗原具有一定的倉儲效應，并對抗原進行緩控釋放，使機體不斷接受免疫刺激從而誘導長期有效的免疫應答。第四，據(jù)國外學者研究，磷酸化殼聚糖本身具有一定的免疫原性，能激活抗原遞呈細胞，從而提高機體的免疫水平。因此將磷酸化殼聚糖作為免疫佐劑用于提高疫苗的抗原特異性免疫應答具有重要的應用價值。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術，具有如下的優(yōu)點及效果：(1)首次采用磷酸化殼聚糖作為免疫佐劑，具有一定的創(chuàng)新性。(2)與傳統(tǒng)的佐劑相比，磷酸化殼聚糖合成簡單、成本低廉，且具有良好的生物可降解性和生物相容性，對生物體和環(huán)境均不產(chǎn)生危害。(3)磷酸化殼聚糖具有良好的水溶性，可很好的應用于人體內(nèi)環(huán)境中而不產(chǎn)生不良毒副作用。(4)磷酸化殼聚糖作為一種免疫佐劑能顯著誘導更高水平的抗原特異性igg抗體效價、ifn-γ/il-4細胞因子和cd4+/cd8+t淋巴細胞免疫反應以及能更好地活化樹突狀細胞(dcs)，增強疫苗的免疫原性，有效提高機體的抗原特異性免疫應答，因此在疫苗治療領域具有重要的應用價值。附圖說明圖1是不同免疫組小鼠的血清抗原特異性igg抗體效價(n＝5)的結果圖。圖2是不同免疫組小鼠的脾細胞增殖系數(shù)(n＝5)的結果圖。圖3是不同免疫組小鼠的脾細胞因子分泌水平(n＝5)的結果圖；其中，通過elisa測定ifn-γ(a)和il-4(b)細胞因子分泌水平；ifn-γ(c)和il-4(d)分泌型細胞數(shù)量由elispot測定，sfc表示形成的斑點細胞；ifn-γ和il-4分泌型細胞的elispot二維圖(e)。圖4是不同免疫組小鼠的cd4+和cd8+效應/中央記憶t細胞數(shù)量(n＝5)的結果圖；其中，cd4+中央記憶t細胞(a)、cd4+效應記憶t細胞(b)、cd8+中央記憶t細胞(c)及cd8+效應記憶t細胞數(shù)量均由流式細胞儀測定；facs流式圖(e)為每個免疫組代表圖。圖5是抗原在免疫部位的控制釋放的結果圖；其中，不同免疫組小鼠的腿部熒光活體成像代表圖(n＝3)(a)；cy5.5標記抗原在免疫部位不同時間點的相對熒光強度(占免疫部位初始熒光強度的百分比)(b)。圖6是在免疫2天和7天后通過免疫組化法測定抗原轉移至脾臟(n＝4)的結果圖；箭頭指示的黃色點代表抗原。圖7是不同免疫組小鼠mhcⅱ分子在脾臟樹突狀細胞上的表達水平(n＝5)的結果圖；其中，mhcⅱ分子在cd11c+樹突狀細胞上表達的百分比(a)和平均熒光強度(b)；不同免疫組小鼠mhcⅱ分子在樹突狀細胞表達的流式代表圖(c)。具體實施方式下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。下列實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法，實施例中所使用的實驗材料、試劑等如無特殊說明，均為商業(yè)途徑獲取。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不是用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1一、磷酸化殼聚糖的制備：10g殼聚糖(3000cps)溶于500ml1％(v/v)的乙酸中，并升溫至70℃。將10g亞磷酸溶于20ml水中，并一次性加入反應體系中?；旌暇鶆蚝?，加入13ml37％～40％的甲醛溶液中，攪拌3小時。反應結束后，將反應液加入至無水乙醇中進行分離沉淀。用乙醇重復洗滌、純化兩次，透析后冷凍干燥得到水溶性磷酸化殼聚糖。二、6種不同配方疫苗的制備：以卵清蛋白ova為抗原，不同配方的疫苗按以下表格進行配制，分別為生理鹽水(空白對照組)、ova/生理鹽水(陰性對照組)、1mg/mlpcs/ova、10mg/mlpcs/ova、30mg/mlpcs/ova及弗氏佐劑(陽性對照組)。表1不同組別疫苗的配方組別pcsova生理鹽水弗氏佐劑空白對照組001ml0ova/生理鹽水(陰性對照)01mg1ml01mg/mlpcs/ova1mg1mg1ml010mg/mlpcs/ova10mg1mg1ml030mg/mlpcs/ova30mg1mg1ml0陽性對照01mg500μl500μl三、小鼠免疫方案的制定：6～8周的雌性balb/c小鼠隨機分成6組，每組5只；分別于第0、10、20天腿部注射疫苗免疫小鼠，劑量為每只小鼠每次注射100μl疫苗溶液(每次注射含100μgova，每只腿注射一半劑量)。第三次免疫10天后，摘取小鼠眼球取血，分離血清，-20℃下保存?zhèn)溆?；取小鼠脾臟，研磨、重懸制備不同濃度的脾細胞懸浮液，備用。四、各項免疫指標的測定：1)igg抗體效價的測定用5μg/ml的ova抗原包被液包被96孔板，4℃包被過夜。然后用然后用的pbst洗板1次。在每孔中加入200μl的封閉液置于37℃的搖床上孵育60min，然后用pbst洗板3次。在空白對照孔中加入100μlpbs，樣品孔中100μl小鼠血清稀釋液，置于37℃的搖床上孵育60min。然后用pbst洗板3次，并在所有孔中加入50μlhrp標記的抗小鼠igg二抗，在37℃的搖床上孵育1h，然后用pbst洗板4次。每孔加入100μl的tmb顯色液。在室溫下避光孵育15min。隨后每孔加入100μl的終止液。立即用酶標儀在450nm處檢測吸收值。2)脾細胞增殖實驗在96孔板中，每孔加100μl上述脾細胞懸液(2×106cells/ml)，分別加100μl的卵清蛋白溶液(濃度為100μg/ml，rpmi1640基礎培養(yǎng)液)或rpmi1640基礎培養(yǎng)液(空白對照)，每組3個平行。37℃，5％co2培養(yǎng)72h后，向每孔加入20μlcck-8溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響od值的讀數(shù)，cck-8溶液需混勻)；將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4h；用酶標儀測定在450nm處的吸光度。3)elisa測定脾細胞分泌的細胞因子水平在24孔板中，每孔加750μl脾細胞懸液(2×106cells/ml)，分別加750μl的卵清蛋白溶液(濃度為100μg/ml，rpmi1640培養(yǎng)液)，每只小鼠脾細胞1個孔。37℃，5％co2培養(yǎng)60h，收集細胞懸液到1.5mlep管中，2000r/min，離心5min，收集上清，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^elisa法測定脾細胞ifn-γ和il-4細胞因子水平。4)elispot實驗(酶聯(lián)免疫斑點法)在超凈臺中用無菌pbs洗板4次，然后在每孔中加入200μl含10％血清的培養(yǎng)基，在室溫下孵育30min以上。棄液，每孔加100μl脾細胞懸液(2.5×106cells/ml)，分別加100μl的卵清蛋白溶液，每組3個平行，37℃，5％co2培養(yǎng)12～48h。棄液，每孔加入pbs200μl，洗板5次。將二抗加入到孔中，每孔100μl，在室溫下孵育2小時，棄液，每孔加入pbs200μl，洗板5次。用pbs-0.5％fcs按1:1000稀釋streptavidin-alp，每孔加入100μl稀釋液，室溫下孵育1h，棄液，每孔加入pbs200μl，洗板5次。每孔加入100μl顯色液，斑點出現(xiàn)后用自來水終止反應。用elispotreader觀察和計數(shù)。5)流式細胞術測定記憶t細胞反應取脾細胞懸液(1×106cells)100μl轉移到1.5ml離心管中，離心，棄上清，加入100μl配含四種染料(fitc450-anti-cd4，percp-cy5.5-anti-cd8α，pe-anti-cd44和apc-anti-cd62l)的pbs溶液重懸。4℃下靜置15min。3000rpm離心5min，棄上清，用300μlpbs重懸。用流式細胞儀測定。6)熒光染色活體成像實驗檢測抗原的緩釋為了監(jiān)測體內(nèi)注射部位抗原的緩釋，用cy5.5染料標記卵清蛋白。設5個實驗組，每組3只雌性balb/c小鼠，通過腿部肌肉注射，每條后腿注射50μl上述卵清蛋白疫苗混合液(除空白對照組外)，在指定的時間點，通過活體成像儀記錄抗原在注射部位的緩釋情況。7)免疫組化試驗將小鼠隨機分為6組(n＝4)，并用100μl不同的疫苗制劑(每只小鼠100μgova，每條腿半劑量)進行肌內(nèi)免疫。在免疫后2或7天，對小鼠實施安樂死，并手術分離脾臟，固定在10％甲醛中，石蠟包埋，并在聚賴氨酸包被的載玻片上切成4μm厚的切片。根據(jù)制造商的說明書進行免疫組織化學染色。8)檢測活化的cd11c+樹突細胞取脾細胞懸液(1×106cells)100μl轉移到1.5ml離心管中，離心，棄上清，加入100μl配含四種染料(fitc-cd11c和pe-mhc-ii)的pbs溶液重懸。4℃下靜置15min。3000rpm離心5min，棄上清，用300μlpbs重懸。用流式細胞儀測定。五、結果與討論1)血清igg抗體效價血清igg抗體水平是評價體液免疫反應強度的重要指標。在本研究中，通過測定免疫小鼠的抗原特異性igg抗體水平來評價磷酸化殼聚糖凝膠基疫苗載體的遞送效力。如圖1所示，免疫30mg/mlpcs/ova組疫苗的小鼠產(chǎn)生的igg效價顯著高于生理鹽水/ova組和1mg/mlpcs/ova組，表明30mg/mlpcs/ova組疫苗能誘導顯著高水平的抗原特異性體液免疫反應。2)體外脾細胞增殖實驗體外抗原重刺激脾細胞增殖水平可以反映抗原特異性脾細胞的活化能力。如圖2所示，經(jīng)過體外抗原重刺激后，免疫30mg/mlpcs/ova組疫苗的小鼠脾細胞增殖水平顯著高于生理鹽水/ova組和1mg/mlpcs/ova組，表明30mg/mlpcs/ova組疫苗可誘導顯著高的抗原特異性脾細胞活化水平。3)細胞因子分泌水平脾細胞因子分泌水平也是反映抗原特異性免疫反應的一個重要指標。ifn-γ和il-4細胞因子分別為th1型和th2型免疫反應的標志物。本實驗通過測定小鼠脾細胞分泌的ifn-γ和il-4細胞因子水平來評價th1型和th2型免疫反應水平。如圖3a所示，免疫30mg/mlpcs/ova組疫苗的小鼠分泌的ifn-γ水平顯著高于生理鹽水/ova組和1mg/mlpcs/ova組；如圖3b所示，免疫30mg/mlpcs/ova組疫苗的小鼠分泌的il-4水平顯著高于生理鹽水/ova組。這結果表明30mg/mlpcs/ova組疫苗均可誘導顯著高水平的th1型和th2型免疫反應。此外，本實驗還通過elispot法測定細胞因子分泌型細胞頻數(shù)。如圖3c-e所示，免疫30mg/mlpcs/ova組疫苗的小鼠產(chǎn)生的ifn-γ-和il-4-分泌型細胞頻數(shù)均顯著高于生理鹽水/ova組。這一系列結果表明，30mg/mlpcs/ova組疫苗可作為一種疫苗遞送系統(tǒng)誘導高水平的th1型和th2型免疫反應。4)抗原特異性記憶t細胞反應免疫記憶反應是疫苗免疫的基礎和前提，疫苗的主要目的是誘導免疫記憶。記憶t細胞在免疫記憶反應中起著重要的作用，當宿主再次被同樣的抗原感染的時候，記憶t細胞將會快速地誘導抗原特異性免疫反應，提供有效的免疫保護，抵抗抗原的侵入。記憶t細胞依據(jù)其表型、分布及生物功能可分為兩種亞型：記憶cd4+和cd8+t細胞。而每一種亞型又分為中央記憶t細胞和效應記憶t細胞，且他們的表面標志物分別為cd44hicd62lhi和cd44hicd62llow。在本實驗中，通過流式細胞儀分別測定記憶cd4+和cd8+t細胞的表面標志物(cd44hicd62lhi和cd44hicd62llow)比例。如圖4a-b所示，相比生理鹽水/ova組，30mg/mlpcs/ova組疫苗誘導顯著高的cd4+中央記憶t細胞和效應記憶t細胞比例。如圖4c所示，相比生理鹽水/ova組，1、10和30mg/mlpcs/ova組疫苗均能誘導顯著高的cd8+中央記憶t細胞比例；而如圖4d所示，相比生理鹽水/ova組，30mg/mlpcs/ova組疫苗誘導顯著高的cd8+效應記憶t細胞比例。如圖4e所示分別為流式細胞術代表圖。此外我們發(fā)現(xiàn)，無論是記憶cd4+或cd8+t細胞，其效應記憶t細胞比例(cd4+:17.5～33.5％；cd8+:18.9～43.0％)均高于中央記憶t細胞(cd4+:7.45～17.4％；cd8+:1.16～5.22％)。這意味著效應記憶t細胞在抗原特異性免疫記憶反應中起主要作用?？傊?，30mg/mlpcs/ova組疫苗可誘導顯著高水平的記憶t細胞免疫反應。5)抗原在免疫部位釋放上述的實驗結果表明，30mg/mlpcs/ova組疫苗可誘導顯著高水平的抗原特異性免疫反應。為了揭示其誘導機理，我們通過熒光活體成像實驗檢測標記cy5.5的ova抗原在免疫部位的釋放情況，并計算不同時間點的平均熒光強度變化。如圖5a所示，免疫生理鹽水/ova組疫苗的小鼠在注射120h后幾乎無法檢測到熒光信號，而免疫30mg/mlpcs/ova組疫苗的小鼠即使在注射240h后仍可清晰地檢測到熒光信號。如圖5b所示，隨著pcs濃度的增高，抗原在免疫部位的停留時間越長。免疫30mg/mlpcs/ova組疫苗的小鼠即使在注射240h后仍可在免疫部位檢測到約32.7％的抗原。綜上結果可知，pcs的引入可以顯著增長抗原在注射部位的停留時間，并具有一定的pcs濃度依賴性。因此pcs可對抗原進行控制釋放進而提供長期的免疫刺激，誘導更有效的免疫應答。6)免疫組化實驗免疫組化實驗進一步用于檢驗從注射部位釋放的抗原是否被抗原遞呈細胞有效呈遞至脾淋巴器官。如圖6所示，免疫2天后，檢測所有組別的小鼠脾臟的抗原陽性反應幾乎沒有差異。而當免疫7天后，免疫生理鹽水/ova組疫苗的小鼠脾臟幾乎無法檢測到抗原陽性；而免疫1、10和30mg/mlpcs/ova組疫苗的小鼠脾臟仍能檢測到明顯的抗原陽性。這結果進一步表明，在pcs基疫苗中(尤其是30mg/mlpcs/ova組疫苗)，隨著抗原在注射部位的持續(xù)釋放，抗原逐漸被呈遞至脾淋巴組織。7)樹突狀細胞(dcs)活化未成熟的dcs隨著對抗原的攝取而活化、成熟。只有活化及成熟的dcs才能呈遞抗原至t淋巴細胞?；罨俺墒斓膁cs在其膜表面表達高水平的mhcⅰ和mhcⅱ分子及共刺激分子。在本工作中，我們通過流式細胞術檢測mhcⅱ分子在cd11c+dcs上的表達水平，用于評價dcs的活化程度。如圖7a-b所示，30mg/mlpcs/ova組疫苗誘導的mhcⅱ+百分比及平均熒光強度均顯著高于生理鹽水/ova組及1mg/mlpcs/ova組；10mg/mlpcs/ova組疫苗誘導的mhcⅱ+平均熒光強度顯著高于生理鹽水/ova組。如圖7c所示為流式細胞術代表圖。總之，30mg/mlpcs/ova組疫苗能誘導dcs膜表面顯著高表達mhcⅱ分子，從而促進dcs的活化。六、結論綜上所述結果，具有良好水溶性、ph敏感性的磷酸化殼聚糖在免疫佐劑領域比殼聚糖本身更方便更具可行性。一系列的免疫結果表明，30mg/mlpcs基水凝膠具有良好的抗原控制釋放能力，從而進一步提高免疫效率，誘導顯著高水平的抗原特異性免疫反應。因此磷酸化殼聚糖作為疫苗遞送載體用于免疫治療具有良好的應用前景。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁12