專利名稱：豬瘟病毒疫苗和診斷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸順序、含有該核酸順序的重組核酸分子，含有這樣一個重組核酸分子的重組表達(dá)系統(tǒng)、豬瘟病毒特有的多肽、含有這樣一種多肽或重組表達(dá)系統(tǒng)的疫苗以及制備這種疫苗的方法。
在世界上許多國家，豬瘟(HC)一直是有著經(jīng)濟(jì)上重要性的豬疾病。在自然條件下，豬是已知的易感HC的僅有動物。豬瘟是有高度傳染性的疾病，其可引起毛細(xì)血管壁的退化，導(dǎo)致內(nèi)臟出血和壞死，發(fā)病初期，豬瘟的特征是發(fā)燒、厭食、嘔吐和腹瀉，進(jìn)而出現(xiàn)以母豬不育、流產(chǎn)和仔豬發(fā)育不良為特征的慢性疾病過程。但幾乎所有的豬均在早期出現(xiàn)癥狀后2周內(nèi)死亡。
已證明豬瘟的病原體豬瘟病毒(HCV)在結(jié)構(gòu)和血清學(xué)上與牛的病毒性腹瀉病毒(BVDV)及羊的邊地病病毒(BDV)有關(guān)。這些病毒屬于披膜病毒科內(nèi)的瘟病毒屬。很早就知道瘟病毒的遺傳物質(zhì)是RNA，即缺乏重要聚腺苷酸化的正股RNA。HCV可能包含3-5種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，其中兩種可能是糖基化的。尚不知道非結(jié)構(gòu)病毒蛋白質(zhì)的數(shù)目。
已經(jīng)制成并且使用了對抗HC感染的修飾的HCV疫苗(包括減毒或殺死的病毒)。然而，因為在所說的修飾的病毒疫苗中，使用的是感染組織培養(yǎng)細(xì)胞所得到的HCV材料，故病毒產(chǎn)率很低而且病毒顆粒難于純化。使用修飾的活病毒疫苗時，因使用了部分減毒的病原性HCV接種動物，故可因病毒仍有致病力而引起被接種動物或其子代患病，并可能在疫苗中污染其他病毒。另外，減毒的病毒還可能逆轉(zhuǎn)成為強(qiáng)毒力狀態(tài)的病毒。
使用失活的疫苗還有其他一些缺點，如存在因病毒部分地失活所造成的危險、只能達(dá)到低免疫水平而須追加免疫的問題、以及因失活處理改變了抗原決定基而造成失活病毒之免疫原性差的問題。
此外，使用修飾的HCV疫苗不適于根除治療。
據(jù)我們所知，迄今為止還沒有一種鑒別豬的HCV和BVDV感染的診斷試驗。建立這一試驗方法是很重要的，因為豬的BVDV感染沒有HCV感染后果嚴(yán)重或受人重視，即意味著BVDV感染的豬還沒有被消除。
含有必要和相關(guān)HCV免疫原性物質(zhì)的疫苗，應(yīng)能在不表現(xiàn)出上述修飾疫苗之缺點的情況下引發(fā)抗病原體的免疫反應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明，現(xiàn)已找到了編碼豬瘟病毒所特有之多肽的核酸順序。所說核酸順序或所說的多肽的片段也屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)?？墒褂迷摵怂犴樞蚝投嚯幕蚱淦沃苽溆糜趯笻CV感染的、只含有必需和相關(guān)免疫原性物質(zhì)的動物疫苗?！昂怂犴樞颉笔侵负颂呛怂犴樞蚝兔撗鹾颂呛怂犴樞?。
圖2中顯示了本發(fā)明的核酸順序。如眾所周知，鑒于遺傳密碼的簡并性，可以在仍不改變被編碼的氨基酸的情況下產(chǎn)生密碼子中堿基的取代，如編碼谷氨酸的密碼子可以是GAT或GAA。因此，顯然可以使用與圖2中所示核酸順序不同的核酸順序(即具有可替代的密碼子組成)來表達(dá)具有圖2所示之氨基酸順序的多肽。
包括于本發(fā)明范圍內(nèi)的還有在嚴(yán)格條件下與圖2所示核酸順序雜交的核酸順序。這些核酸順序與圖2中所示者有關(guān)，但可能包括核苷酸取代、突變、插入、缺失等。并且可編碼圖2所示之多肽的功能上的等同物，即編碼的相關(guān)多肽的氨基酸順序與圖2所示的氨基酸順序不完全相同，但表現(xiàn)有HCV特有的相應(yīng)免疫學(xué)性質(zhì)。
本發(fā)明還包括由這些相關(guān)核酸順序編碼的多肽。
圖2中所示的核酸順序是由HCV的基因組RNA得到的CDNA順序。該連續(xù)順序長度為12284個核苷酸，其含有一個由364-366位ATG密碼子開始，并終止在12058-12060位轉(zhuǎn)譯終止密碼子TGA的長開放讀碼(ORF)。該ORF是由能編碼435KD蛋白質(zhì)的3898個密碼子組成的。
在體內(nèi)，HCV在被感染的細(xì)胞中復(fù)制期間，該蛋白質(zhì)是作為多聚蛋白質(zhì)前體分子合成的，繼后經(jīng)酶促裂解該前體分子而加工成片段多肽。經(jīng)過可能的轉(zhuǎn)譯后修飾，這些片段形成病毒的結(jié)構(gòu)或非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。優(yōu)選的核酸順序含有這種抗HCV免疫特性或HCV特有之免疫學(xué)性質(zhì)的片段的遺傳信息，或含有仍可表現(xiàn)抗HCV免疫特性或HCV特有之免疫學(xué)性質(zhì)的該片段的一部分的遺傳信息。
依據(jù)圖2之多肽的片段多肽和其部分-其可用于免疫動物對抗HC或用于診斷HC-也構(gòu)成本發(fā)明的一個部分。片段編碼區(qū)位于氨基酸位序約1-249、263-487、488-688或689-1067之間。1-249區(qū)域基本上代表核心蛋白，而263-487、488-688和689-1067區(qū)域則基本上分別代表33KD、44/48KD和55KD糖蛋白。本發(fā)明還包括含有上述一個或多個編碼區(qū)或其部分的遺傳信息的核酸順序。
摻入抗HCV感染之疫苗中的優(yōu)選區(qū)域是相當(dāng)于HCV之55KD蛋白質(zhì)或其仍具有免疫活性之部分的區(qū)域。
此外，本發(fā)明可優(yōu)先選用至少包括上述55KD蛋白質(zhì)或其部分之編碼順序的核酸順序。
再者，可使用具有病毒中和活性的抗55KD蛋白的單克隆抗體來分析HCV缺失突變體，以檢測可用于免疫豬以對抗HCV感染的HCV55KD蛋白之優(yōu)選部分。該部分包含約跨越氨基酸順序812-859的抗原決定基，并且是由核苷酸順序2799-2938編碼的。至少包含所說氨基酸順序的多肽或至少包含所說核苷酸順序的核酸順序也構(gòu)成本發(fā)明的一部分內(nèi)容。
可用于診斷豬的HCV感染并用于鑒別HCV和BVDV的本發(fā)明的核酸順序可由編碼55KD蛋白質(zhì)的基因得到。
最好由核苷酸順序2587-2619或2842-2880得到該核酸順序，上述兩順序都是編碼55KD蛋白質(zhì)之基因的一部分。用于診斷目的的優(yōu)選寡核苷酸是5′－CCTACTAACCACGTTAAGTGCTGTGACTTTAAA-3′或5′-TTCTGTTCTCAAGGTTGTGGGGCTCACTGCTGTGCACTC-3′至少包含該寡核苷酸之亞順序且仍可用于區(qū)分HCV和BVDV的核酸順序也屬于本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明還涉及用于檢測試驗的試驗藥盒，該試驗藥盒包含本發(fā)明的核酸順序。
試驗藥盒最好包含上述寡核苷酸或至少含有其亞順序的核酸順序。
在仍保留同樣免疫學(xué)性質(zhì)的情況下，圖2所示的多肽或其片段可以發(fā)生變異或修飾，如不同毒株或其他衍生物之間的自然變異?？筛鶕?jù)整個順序中氨基酸差異或所說多肽中氨基酸的缺失、取代、插入、倒位或加入來證明這些變異。
此外，在使用DNA重組技術(shù)制備圖2所示多肽或其片段的不同衍生物時，還可能因所得的單個或多個氨基酸取代、缺失、加入或置換(如借助基礎(chǔ)DNA的位點特異性誘變)而發(fā)生不同的修飾。所有這些經(jīng)修飾的圖2所示多肽或其片段的衍生物，只要所說多肽或其片段的必需特有活性保持不變，也都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
從沉淀之病毒顆粒中分離RNA并用于合成CDNA。在噬菌體λgt11中克隆該CDNA，擴(kuò)增個別CDNA庫并用羊抗HCV抗血清篩選之?？设b定出兩個陽性克隆并證明具有兩個大小為0.8Kb和1.8Kb的插入段。測定了0.8Kbλgt11插入段的部分順序(見圖3)并確定其位于HCV基因組上的約1.2和2.0Kb之間(見圖2)。
根據(jù)本發(fā)明，可用于診斷動物的HCV感染并可用于鑒別HCV與BVDV的核酸順序是由圖2所示的核苷酸順序5551-5793代表的。
至少包含所說核苷酸順序的亞順序，并仍可用于區(qū)分HCV和BVDV的核酸順序也構(gòu)成本發(fā)明的一個部分。
本發(fā)明還涉及用于檢測分析的試驗藥盒，該試驗藥盒包含根據(jù)本發(fā)明的核酸順序。
該試驗藥盒最好包含由圖2所示的核苷酸順序5551-5793所代表的核酸順序，或至少包含上述其亞順序的核酸順序。
從病毒粒子沉淀物中分離RNA并用于合成CDNA。在噬菌體λgt11中克隆該CDNA，擴(kuò)增個別CDNA庫并用羊抗HCV抗血清篩選之?？设b別出兩個陽性克隆并證明其具有大小為0.8Kb和1.8Kb的插入段。測定0.8Kbλgt11插入段的部分核苷酸順序(見圖3)并確定其位于HCV基因組的約1.2和2.0Kb之間(見圖2)。
可將本發(fā)明的核酸順序連接到各種載體核酸分子如質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA或病毒DNA上，以形成重組核酸分子。該載體核酸分子最好含有啟動、控制和終止轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)譯過程的DNA順序?？墒褂脭y帶于含有這種重組核酸分子之宿主內(nèi)的重組表達(dá)系統(tǒng)，以使本發(fā)明的核酸順序得以表達(dá)由該核酸順序編碼的多肽。上述重組表達(dá)系統(tǒng)的宿主可以是原核細(xì)胞，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和假單胞菌等細(xì)菌，病毒如牛痘病毒和鳥痘病毒，或真核細(xì)胞如酵母或高等真核細(xì)胞如昆蟲、植物或動物細(xì)胞。
可給動物使用本發(fā)明的多肽，作為所謂“亞單位”疫苗使動物獲得抗HC免疫力。本發(fā)明的亞單位疫苗含有基本上純的多肽，且還可含有醫(yī)藥上可接受的載體。
為了提高免疫原性，最好將小片段連接到載體分子上。適用的載體有大分子物質(zhì)如天然聚合物(蛋白質(zhì)，如鎖孔血藍(lán)蛋白、白蛋白、毒素)、合成的聚合物如多聚氨基酸(多聚絲氨酸、多聚丙氨酸)，或兩性化合物膠束如皂角苷。另外也可以其聚合物且最好是線性聚合物的形式提供這些片段?？砂幢绢I(lǐng)域中已知的方法制備用于這種亞單位疫苗中的多肽，如由豬瘟病毒中分離所說的多肽，或用DNA重組技術(shù)或化學(xué)合成方法制備。
必要時可在體內(nèi)或體外，通過糖基化、酰胺化、羧化或磷酸化等方式修飾用于疫苗中的根據(jù)本發(fā)明的多肽。
可替代亞單位疫苗的是所謂“載體”疫苗?？捎弥亟M技術(shù)將根據(jù)本發(fā)明的核酸順序整合到其他微生物(如病毒或細(xì)菌)的遺傳材料中以使該微生物能夠表達(dá)本發(fā)明的多肽。當(dāng)將這種重組表達(dá)系統(tǒng)用于被免疫的動物之后，它即可在被接種動物體內(nèi)復(fù)制，并表達(dá)能刺激該動物之免疫系統(tǒng)的多肽。疫苗載體的適當(dāng)例子有痘病毒(如牛痘、兔痘病毒)、禽痘病毒(如雞痘病毒)、假狂犬病病毒、腺病毒、流感病毒、噬菌體或細(xì)菌(如大腸桿菌和沙門氏菌)。
在其核酸順序中插入了依據(jù)本發(fā)明之核酸順序的重組表達(dá)系統(tǒng)可以在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長，需要時可以由被感染的細(xì)胞中收獲之并制成凍干形式的疫苗。也可由用所說的微生物感染的活的動物體內(nèi)收獲上述經(jīng)過遺傳操作的微生物。還可在表達(dá)本發(fā)明之多肽的細(xì)胞培養(yǎng)物中增殖上述重組表達(dá)系統(tǒng)，然后由該培養(yǎng)物中分離出所需多肽。
可按本領(lǐng)域中已知的方法制備含有本發(fā)明之多肽或重組表達(dá)系統(tǒng)的疫苗。本發(fā)明的疫苗可由上述的整個宿主、宿主提取物、部分或完全純化的多肽，或者部分或完全純化的重組表達(dá)系統(tǒng)組成。
可按常規(guī)主動免疫程序使用本發(fā)明的疫苗即以與劑量配方相適的方式或以治療及預(yù)防上有效的量，一次或多次應(yīng)用該疫苗。疫苗的給予途徑包括皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或鼻內(nèi)等、為進(jìn)行胃腸道外給藥，疫苗可另外含有水，鹽水或緩沖溶液等適當(dāng)載體，并可以加入或不加佐劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、乳化劑等。
疫苗可另外含有與其他疾病有關(guān)的免疫原或編碼這些免疫原(如細(xì)小病毒、假狂犬病病毒、豬流感病毒、TGE病毒、輪狀病毒、大腸桿菌、博德特氏桿菌、巴斯德氏菌、丹毒等的抗原)的核酸順序，以產(chǎn)生多價疫苗。本發(fā)明的多肽也可用于診斷方法中，以檢測動物體內(nèi)HCV抗原或抗體的存在。此外，可用依據(jù)本發(fā)明的核酸順序生產(chǎn)用于上述診斷方法中的多肽，或用作檢測樣品中HCV核酸存在的雜交探針。
實施例1CDNA克隆的免疫學(xué)鑒定細(xì)胞的感染和病毒的收獲使pk15和38A1D細(xì)胞生長于加有10%FCS的DMEM中(體積為20-30ml，細(xì)胞濃度為5×107/ml)，并用強(qiáng)毒力HCV病毒株Alfort，于37℃感染90分鐘(用免疫熒光法測定m.O.i為0.01至0.001)然后將PK15細(xì)胞接種在組織培養(yǎng)皿(直徑150mm)上，同時使懸浮細(xì)胞38A1D在瓶內(nèi)于輕輕攪拌(Tecnomara Switzerland)下保溫。為完成CDNA合成，感染后48小時收獲組織培養(yǎng)物上清液，以12，000g離心澄清，并在TFA20轉(zhuǎn)子(Contron，Italy)中以54，000g離心12小時得到病毒沉淀物。
羊抗HCV血清的制備用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，由年輕羊的皮膚活組織檢查中建立一株成纖維細(xì)胞。細(xì)胞最初生長在含10%FCS的F-10培養(yǎng)基中，然后培養(yǎng)在含10%FCS的DMEM中。用HCV感染羊成纖維細(xì)胞。在腹腔注射后的最初26小時內(nèi)，每8小時用PBS將細(xì)胞洗3次，然后在含有10%預(yù)免疫羊血清(PGS)的DMEM中保溫。預(yù)免疫48小時，收獲培養(yǎng)物上清并用作儲備病毒。免疫前，對30個組織培養(yǎng)皿(150mm直徑)中的羊細(xì)胞在加有10%PGS的培養(yǎng)基中進(jìn)行3次傳代，然后用儲備病毒感染。預(yù)免疫48小時后，用X射線滅活的病毒沉淀物和被感染的細(xì)胞免疫羊。兩者均在弗氏佐劑中乳化(基礎(chǔ)免疫用完全佐劑，加強(qiáng)免疫用不完全佐劑)。然后作皮下注射。為了得到識別變性分子的抗體，注射前將抗原制劑在0.2%SDS、3mMDTT中于95℃保溫5分鐘。
RNA制備、CDNA合成和克隆使用Chirgwin等人(1979)所述的硫氰酸胍方法由病毒粒子分離RNA。將由離心沉淀的病毒粒子分離的RNA(5μg總RNA，約0.5μg HCV RNA)和0.1μg隨機(jī)六核苷酸引物(Pharmacia，Sweden)在20μl水中于65℃加熱10分鐘，在冰上冷卻，并調(diào)整到終體積達(dá)32μl的第一股鏈緩沖液(每毫升含50mM Tris-HCl，PH8.3;30mM KCl;8mM MgCl21mM DTT、各1mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP及500單位RNAguard「Pharmacia，Sweden」)加入35單位AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Life Sciences Inc，uSA)。43℃保溫1小時后，將該反應(yīng)混合物加到含第二股鏈合成混合物(CDNA合成試劑盒，Pharmacia，Sweden)的小瓶內(nèi)。第二股鏈合成、平頭制備及EcoRⅠ接頭連接及磷酸化均按制造商推薦的方法完成。
用制備瓊脂糖凝膠電泳法按大小分離CDNA。棄去凝膠中含小于0.5Kb之DNA分子的部分。倒置凝膠并電泳15分鐘以濃縮余留的DNA，冷凍并用苯酚解凍3次后，由瓊脂糖中提取之。
在總體積為10μl的連接酶緩沖液(30mM Tris-HCl PH7.4;10mMMgCl2;10mMDTT;1mM ATP)中用3單位T4DNA連接酶(Pharmacia，Sweden)連接乙醇共沉淀的CDNA和λgt11DNA(1μgECORI消化并去磷酸化的臂，Promega，USA)。按制造商推薦的方法用商品提取物(Packagene，Pramega，USA)體外包裝，并用所得噬菌體感染大腸桿菌K12細(xì)胞(菌株Y1090)。按已述方法(Davisetal，1986)將文庫擴(kuò)增一次。
λgt11文庫的篩選按已述方法(Young and Davia，1983)使用購自Promega，USA(Huynh et al，1985)的Protoblot系統(tǒng)和10-3血清稀釋液進(jìn)行篩選。為減少本底影響，用濃度為0.8mg/ml的大腸桿菌溶菌產(chǎn)物(菌株Y1090)處理羊抗HCV血清(Huynh et al.，1985)。分別鑒定出兩個有0.8Kb和1.8Kb插入段的陽性克隆。
切口轉(zhuǎn)譯和Northern雜交以切口轉(zhuǎn)譯法(切口轉(zhuǎn)譯試劑盒，Amersham Buchler，F(xiàn)RG)用「α32P」dCTP(3000Ci/m M，Amersham Buchler，F(xiàn)RG)標(biāo)記50ng0.8KbHCV核酸順序，然后于68℃下以每毫升雜交混合物(每毫升含5×SSC1×Denhardt′S20mM磷酸鈉PH6.8;0.1%SDS和100μg酵母tRNA「Boehringer-Mannheim，F(xiàn)RG」)5ng的濃度經(jīng)12至14小時雜交到Northern濾膜上。然后按已述方法洗濾膜(Keil et al.，1984)并于-70℃下使用Agfa Curix MR800增光屏與Kodakχ-Omat AR膠片接觸不同時間。
0.8Kb核酸順序不僅與完整的HCVRNA雜交，而且與其降解產(chǎn)物雜交。0.8Kb核酸順序并不與1.8Kb核酸順序雜交，此表明這兩個核酸順序相當(dāng)于不位于基因組RNA之同一區(qū)域中的HCV基因組片段。
核苷酸順序分析按標(biāo)準(zhǔn)方法(Maniatis et al.，1982)將HCV特異性噬菌體DNA插入段再克隆到質(zhì)粒PEMBL18+中。按已述方法(Dente et al.，1985)制備重組PEMBL質(zhì)粒的單股DNA。按制造商(Pharmacia，Sweden)推薦的方法進(jìn)行雙脫氧順序測定反應(yīng)(Sanger et al.，1977)。
實施例2HCV基因組的分子克隆和核苷酸順序RNA制備，CDNA合成和克隆RNA制備、CDNA合成、大小選擇和共沉淀CDNA與λgt10 DNA的連接(1μg ECORI消化的去磷酸化的臂，Promega，USA)均按上述方法進(jìn)行。使用Packagene(Promega，USA)體外包裝噬菌體DNA并按制造商提供的方法在大腸桿菌菌株C600HFL上滴定噬菌體。將該DNA庫擴(kuò)增一次(Davis et al.，1986)，并使轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Amersham Buchler，F(xiàn)RG)上的復(fù)制物(Benton and Davis，1977)與上述用于Northern雜交的寡核苷酸雜交。按Benton和Davis(1977)所述方法用通過切口轉(zhuǎn)譯(切口轉(zhuǎn)譯試劑盒，Amersham Buchler，F(xiàn)RG)以「α32P」dCTP標(biāo)記的CDNA片段進(jìn)行篩選。噬班純化陽性克隆并將插入段再克隆到PEMBL質(zhì)粒中(Maniatis et al.，1982;Denteetal.，1985;Davisetal.，1986)。
使用與編碼氨基酸順序Cys GlyAsp Asp Gly phe之RNA順序互補(bǔ)的17堿基32P5′端標(biāo)記的寡核苷酸篩選λgt10 CDNA庫。該與HCV的約12Kb基因組RNA雜交的寡核苷酸，除鑒別一個有0.75kb插入段的克隆外，還可與HCV RNA雜交。將這個代表HCV基因組的片段的0.75Kb核酸順序連同0.8Kbλgt11核酸順序插入段進(jìn)一步用于DNA庫篩選，得到一組其相對位置和限制性位點圖如圖1所示的交迭HCV核酸順序。HCV基因組的這些核酸順序片段位于下列核酸位置之間4.0Kb片段27-40274.5Kb片段54-44940.8Kb片段1140-20024.2Kb片段3246-72525.5Kb片段6656-11819且存在于大約如下示的核酸位置內(nèi)3.0Kb片段8920-119201.9Kb片段10384-122840.75Kb片段10913-11663核苷酸順序分析為完成核苷酸順序測定，使用核酸外切酶Ⅲ和核酸酶S1(BoehringerMannheim，F(xiàn)RG)建立得自已再克隆到PEMBL18+或19+質(zhì)粒中之CDNA插入段之HCV的缺失庫(Hennikoff，1987)。使用T7聚合酶順序分析試劑盒(Pharmacia，Sweden)對單股(Denteetal.，1985)或雙股DNA模板進(jìn)行雙脫氧DNA順序分析(Sangeretal.，1977)。
來自CDNA片段的長度為12284核苷酸的連續(xù)順序如圖2中所示。該順序含有一個由364-366位的ATG密碼子開始，并終止在12058-12060位之TGA密碼子(作為轉(zhuǎn)譯終止密碼子)的長的開放讀碼(ORF)。該ORF由能編碼有圖2所示氨基酸順序的435KD蛋白質(zhì)的3898個密碼子組成。由于病毒群體的可能的異源性，而出現(xiàn)若干核苷酸順序的差異，故測得存在3處核苷酸互換，其中有兩個導(dǎo)致了推測的氨基酸順序的改變(圖2)。
綜上可見，已按上述方法克隆了幾乎全部HCV基因組并測定了它們的順序。
部分地測定了編碼可用抗HCV血清鑒定之免疫原性HCV多肽的0.8Kbλgt11核酸順序(見圖3)，結(jié)果表明該順序位于HCVRNA上1.2和2.0Kb之間。
實施例3HCV之融合蛋白質(zhì)的分子克隆和表達(dá)在PEX系統(tǒng)(Strebel，K.etal.，1986)中作為融合蛋白質(zhì)表達(dá)得自HCV基因組的兩個區(qū)域，即編碼氨基酸262-546(見圖2)之實施例1的0.8Kbλgt11插入段和編碼氨基酸747-1071(見圖2)之核酸順序的CDNA片段。
用SDS-PAGE方法分離細(xì)菌提取物并按標(biāo)準(zhǔn)方法染色，然后試驗其在Western印跡分析中與羊抗HCV血清(實施例1)的反應(yīng)活性。
經(jīng)SDS-PAGE法部分純化HCV特異性融合蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并與羊抗HCV血清一起保溫。洗脫后得到抗所說融合蛋白質(zhì)的特異性抗體。
對上述融合蛋白質(zhì)特異的抗體被用于放射免疫沉淀分析中。
結(jié)果與羊抗HCV血清反應(yīng)后，明確證明在PEX系統(tǒng)中表達(dá)的兩種融合蛋白質(zhì)均是對HCV特異的。
抗兩種融合蛋白質(zhì)的單一特異性抗血清可沉淀HCV糖蛋白。
對262-546融合蛋白質(zhì)特異的抗體沉淀病毒感染之細(xì)胞的44/48KD和33KD蛋白質(zhì)，對747-1071融合蛋白質(zhì)特異的抗體則沉淀病毒感染之細(xì)胞的55KD蛋白質(zhì)。
實施例4結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的分子克隆和其通過牛痘病毒的表達(dá)制備圖1所示的在HinfⅠ限制性位點(核苷酸372)處開始并在人工EcoRⅠ位點(核苷酸4000)處終止的4.0Kb克隆的片段(PHCK11)(Maniatisetal.，1982)。為連接5′端而合成一寡核苷酸接頭，其含有一個與BamHⅠ相適應(yīng)的突出部分、作為轉(zhuǎn)譯起始密碼子的起始信號ATG(364-366)及一個在3′端可與HinfⅠ相配合的突出末端。
5′GATCCACCATGGAGTT HinfIBamHIGTGGTACCTCAACTTA5′在構(gòu)建物的3′末端，通過用綠豆核酸酶刪除EcoRⅠ突出末端而引入轉(zhuǎn)譯終止密碼子并連接到平端StuⅠ/EcoRⅠ接頭殘留部分中
5′GCCTGAATTC3′EcoRICGGACTTAAG(Maniatisetal.，1982)。
將上述HCV順序插入牛痘病毒之前，將該異源基因克隆到重組載體內(nèi)。為此而使用在4.9Kb胸苷激酶順序內(nèi)p7.5k啟動子下游含有克隆位點的PGS62質(zhì)粒(Cranage，M·P·etal.，1986)。克隆位點包括三個獨特的限制性酶切點，即BamHⅠ、SmaⅠ和EcoRⅠ。將所述的HCV順序(372-4000)連同接頭一起連接到BamHⅠ/EcoRⅠ消化的PGS62中即構(gòu)成重組載體PGS62-3.8。
基于該質(zhì)粒得到一組15個缺失突變體，經(jīng)用核酸外切酶Ⅲ處理(Hennikof et al.，1987)，結(jié)果由3′端縮短了HCV CDNA。除去約100bp后，所有缺失位于編碼HCV55KD蛋白的區(qū)域內(nèi)在終止于核苷酸2589的突變體15中丟失了55KD蛋白的大部分。將ExoⅢ剪短的CDNA克隆連接到PGS62中，得到PGS62-3.8Exo1-15(圖4)。
用牛痘病毒(Copenhagen病毒株，TS7突變體)感染CVI細(xì)胞(MOI為0.1)。感染3小時后，用Ca3(PO4)2沉淀法轉(zhuǎn)染PGS62-3.8DNA及牛痘WR DNA并保溫2天，收獲病毒子代并在溴-脫氧尿苷(100μg/ml)存在下根據(jù)143tk細(xì)胞上的tk表型選擇之，至少進(jìn)行兩次選擇，然后再作兩次噬班純化。
牛痘-HCV重組體的鑒定于MOI為2-10時用牛痘-HCV重組體感染CVI細(xì)胞并保溫8-16小時。固定細(xì)胞后，使用對HCV55KD蛋白特異的單克隆抗體或多價抗HCV抗血清進(jìn)行間接免疫熒光分析。所有情況下均可證實胞漿熒光的存在。
對牛痘病毒重組體感染的細(xì)胞進(jìn)行放射免疫沉淀和Western印跡分析后，檢測四種HCV特異性蛋白質(zhì)。經(jīng)用「3H」葡糖胺標(biāo)記，顯示其中三種蛋白質(zhì)是已糖基化的。這些蛋白質(zhì)的表觀分子量與用HCV特異性血清檢測到的HCV感染之細(xì)胞的蛋白質(zhì)表觀分子量相同，即分別為20KD(核心)、44/48KD、33KD和55KD。
因為通過牛痘病毒經(jīng)表達(dá)而產(chǎn)生的HCV蛋白與HCV感染之細(xì)胞中的蛋白質(zhì)有相同的表觀分子量，所以其蛋白水解加工和修飾作用顯然是可靠的。
在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)抗HCV中和抗體用下列純化的病毒經(jīng)腹腔內(nèi)注射一次感染四組小鼠(每組3只)a.牛痘WR野生型(每只5×106Pfu)WRb.牛痘3.8重組體(每只5×107Pfu)VAC3.8c.牛痘3.8EXO4(55KD缺失的)(每只5×107Pfu)VAC3.8Exo4d.牛痘3.8Exo5(每只5×107Pfu)VAC3.8Exo5e.牛痘3.8Exo15(55KD缺失的)(每只5×107Pfu)VAC3.8Exo153周后放血，經(jīng)系列稀釋后，在使用HCV(Alfort)的病毒中和檢測法中檢測血清對PK「15」細(xì)胞的反應(yīng)活性(RümenapfT·etal.，1989)。
中和效價a.WR＜1∶2b.VAC3.81∶96c.VAC3.8Exo4 1∶96d.VAC3.8Exo5 ＜1∶2e.VAC3.8Exo15 ＜1∶2由以上結(jié)果可以看出，含有編碼所有結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的遺傳信號之核酸順序的牛痘病毒(VAC3.8)能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生病毒中和抗體，而不完整的構(gòu)建體VAC3.8Exo5-15和WR則不能。
因為所有缺失都位于編碼HCV55KD蛋白的區(qū)域內(nèi)(大部分55KD蛋白在終止于核苷酸2589處的突變體15中丟失)，并且其他結(jié)構(gòu)蛋白仍可由重組牛痘病毒表達(dá)，所以HCV中和抗體顯然是由55KD蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的。
實施例5用VAC3.8免疫豬用野生型牛痘病毒(WR病毒株)感染三頭小豬(重約20Kg)中的一只(28號)，并用重組VAC3.8感染另外兩頭(26和27號)(分別為腹腔注射、靜脈注射和皮內(nèi)注射)。每個動物感染相當(dāng)于1×108Pfu的牛痘病毒。
牛痘感染過程中的臨床征象為在劃痕側(cè)出現(xiàn)紅斑并在感染后6天發(fā)燒(41℃)。
抗牛痘和豬瘟病毒的效價感染后三天檢測抗牛痘(WR對CVI細(xì)胞)和抗HCV(Alfort對PK15細(xì)胞)血清的反應(yīng)活性。
血清經(jīng)系列稀釋后，通過檢查完全沒有CPe(牛痘)或在免疫熒光試驗中的特異信號(HCV)來測定各自的中和效價(Rumenapf，T·etal.，1989)。
抗牛痘病毒的中和效價28號豬(WR)1∶826號豬(VAC3.8)1∶1627號豬(VAC3.8)1∶16抗HCV的中和效價28號豬(WR)＜1∶226號豬(VAC3.8)1∶3227號豬(VAC3.8)1∶16用HCV攻擊用牛痘病毒免疫后四周，每頭豬各用5×107TCID50 HCV Alfort攻擊。按照自然感染途徑，經(jīng)口鼻給予病毒。使用病毒量差不多為豬的強(qiáng)制致死量。
攻擊后第5天，28號豬出現(xiàn)發(fā)燒(41.5℃)并持續(xù)到第12天。在表現(xiàn)有急性豬霍亂的典型臨床征象時殺死該垂死的動物。
用VAC3.8免疫的兩頭豬(26和27號)，在用HCV攻擊的14天后仍未顯示任何病征。
實施例655KD蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建按標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用限制性酶SacⅠ和HpaⅠ消化克隆PHCK11。
分離所得到的位于核苷酸2672(AGCTC)和3971(GTT)之間(其包含大部分HCV55KD蛋白的編碼順序)的1.3Kb片段，并克隆到假狂犬病病毒(PRV)gx基因中(Maniatisetal.，1982)。
簡單地說，用SalⅠ和ApaⅠ消化已克隆的gx順序。用Klenow片段將ApaⅠ5′突出末端填補(bǔ)成平頭。連接后假定的gx先導(dǎo)肽編碼順序正好位于被插入之HCV55KD順序的上游。
經(jīng)用BglⅡ消化(BglⅡ酶切點3936-3941)后在轉(zhuǎn)譯終止密碼子下游導(dǎo)入HCV順序，并在用Klenow片段填補(bǔ)突出端后重新連接。該構(gòu)建體位于PRVgx啟動子的下游(克隆16/4-1.3)。用DEAE葡聚糖法(Maniatisetal.，1989)將克隆16/4-1.3轉(zhuǎn)染到MDBK細(xì)胞中。16小時后用PRV(m.o.i＝1)感染細(xì)胞。感染后4小時用冷(-20℃)甲醇/丙酮的混合物固定細(xì)胞。用抗HCV55KD蛋白單克隆抗體(MAb)所作的間接免疫熒光分析表明，有5-10%的細(xì)胞中顯示特異性信號。PRV感染的細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)染，而且在該項檢測中只有用克隆16/4-1.3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞沒有顯示任何信號。


圖1顯示不同的HCV衍生之CDNA克隆的物理圖及它們相對于RNA基因組的位置(上面一行)。第二行顯示了用抗體探針(0.8Kb克隆)或簡并的寡核苷酸探針(0.75Kb克隆)篩選后分離的兩個HCV衍生的CDNA克隆。下面示出的是根據(jù)核苷酸順序分析結(jié)果選出的CDNA片段。所有數(shù)字均代表DNA片段的大小(Kb數(shù))。限制性切點B＝BglⅡ∶E＝EcoRⅠ∶H＝HindⅢ∶K＝KpnⅠ∶S＝SalⅠ∶Sm＝SmaⅠ。
圖2顯示HCV的核酸順序及長開放讀碼的推斷的氨基酸順序。指出了不同CDNA克隆間的核苷酸互換及所導(dǎo)致的相應(yīng)氨基酸順序的改變。下劃橫線的部分順序相當(dāng)于用于篩選的寡核苷酸。
圖3顯示由λgt11克隆之0.8KbHCV插入段的一部分衍生的CDNA順序及由之推斷的氨基酸順序(以一字母代號表示)。
圖4顯示克隆到PGS62載體中之HCV DNA長度。經(jīng)用核酸外切酶Ⅲ處理建立衍一組衍生于CDNA克隆PHCK11的15個缺失突變體，并克隆到PGS62載體中產(chǎn)生PGS62-3.8Exo1-15。其中標(biāo)出了3′端核苷酸序號。
權(quán)利要求
1.編碼豬瘟病毒特征性多肽的核酸順序。
2.編碼有圖2所示之氨基酸順序的豬瘟病毒特征性多肽的核酸順序。
3.編碼有圖2所示之氨基酸順序的豬瘟病毒特征性多肽片段的核酸順序。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的核酸順序，特征在于該核酸順序至少相當(dāng)于圖2所示脫氧核酸順序的一部分。
5.包含載體核酸分子和根據(jù)權(quán)利要求1-4之核酸順序的重組核酸分子。
6.能夠產(chǎn)生豬瘟病毒特征性多肽的重組表達(dá)系統(tǒng)，其包括含有根據(jù)權(quán)利要求5之重組核酸分子的宿主。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的重組表達(dá)系統(tǒng)，特征在于宿主是病毒或細(xì)菌。
8.豬瘟病毒特有的多肽。
9.含有圖2所示氨基酸順序或其片段的豬瘟病毒特有的多肽。
10.由根據(jù)權(quán)利要求6或7的重組表達(dá)系統(tǒng)合成的豬瘟病毒的特征性多肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10的多肽，特征在于它包含一處或多處轉(zhuǎn)譯后修飾。
12.使動物免受豬瘟病毒感染的疫苗，特征在于它含有根據(jù)權(quán)利要求8-11的多肽。
13.使動物免受豬瘟病毒感染的疫苗，特征在于它含有根據(jù)權(quán)利要求6或7的重組表達(dá)系統(tǒng)。
14.制備豬瘟病毒疫苗的方法，特征在于用根據(jù)權(quán)利要求8-11的多肽配制成有免疫活性的醫(yī)藥制劑。
15.制備豬瘟病毒疫苗的方法，特征在于在培養(yǎng)物中增殖根據(jù)權(quán)利要求6或7的重組表達(dá)系統(tǒng)，然后收獲該重組表達(dá)系統(tǒng)并制成具有免疫活性的醫(yī)藥制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有豬瘟病毒特征性多肽的豬瘟病毒疫苗。還涉及能夠表達(dá)編碼該多肽之核酸順序的載體疫苗。所說的多肽和核酸順序也能用于檢測豬瘟病毒感染。
文檔編號C07H21/04GK1047531SQ9010149
公開日1990年12月5日 申請日期1990年3月19日 優(yōu)先權(quán)日1989年3月19日
發(fā)明者格來哥·梅伊爾, 迪爾曼·魯麥納普, 享茨-余爾根·歇爾 申請人:阿克佐公司