本發(fā)明涉及中醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種清下瀉胰方劑。

背景技術(shù)：

中醫(yī)學(xué)根據(jù)主癥，將胰腺癌歸屬于“伏梁”、“痞塊”、“黃疸”、“積聚”的范疇。胰頭癌者，以黃疸為主要表現(xiàn)，癥見：身目黃染，食少腹脹，或脅肋疼痛，小便黃赤，大便干結(jié)，舌紅苔黃膩，脈弦滑或滑數(shù)?！端貑?通評虛實(shí)論》曰：“消癉仆擊，偏枯痿厥，氣滿發(fā)逆，甘肥貴人，則高粱之疾也”，可見飲食不節(jié)導(dǎo)致脾胃損傷，運(yùn)化失常，濕熱阻滯；外加七情不節(jié)，情感抑郁不舒，臟腑功能失調(diào)，影響肝之氣機(jī)升降，常為本病病因?！端貑?玉機(jī)真臟論》曰：“肝傳之脾，病名曰脾風(fēng)，發(fā)癉，腹中熱，煩心，出黃?！惫时静∥痪又薪?，其發(fā)生與肝脾二臟功能失調(diào)密切相關(guān)。其病機(jī)為肝主疏泄，調(diào)暢氣機(jī)，協(xié)調(diào)脾胃升降，脾為后天之本，使氣血生化有源，肝體得養(yǎng)。反之，肝脾不調(diào)，則肝氣郁結(jié)，氣機(jī)不暢，故見脘腹不適、脹滿；脾虛生濕，濕郁化熱，膽熱液泄，與胃之濁氣共并，上不得越，下不得泄，熏蒸遏郁，則發(fā)為黃疸，小便赤黃；肝氣犯脾，脾氣虛弱，故見食少；證屬濕熱毒盛型。

隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，胰腺癌相關(guān)的機(jī)制研究、治療策略層出不窮，然從而從預(yù)防、診斷、治療到預(yù)后效果均不理想。中藥通過其獨(dú)特的配伍與現(xiàn)在醫(yī)學(xué)相結(jié)合，從抑癌、抗血管、改變微環(huán)境、提高免疫力等多種途徑，提高患者生活質(zhì)量，延長帶瘤生存時間。然而現(xiàn)階段，有很多治療胰頭癌的中藥，但大多數(shù)具有治療效果差、癥狀緩解率低，生存期短等特點(diǎn)。因此中藥抗胰腺癌，挑戰(zhàn)與機(jī)遇并存。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

要解決的技術(shù)問題：本發(fā)明的目的是提供一種清下瀉胰方劑，在經(jīng)過對藥物組分的大量篩選、重組、嘗試， 又通過大量體外實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)的研究后，提供一種更為有效的抗胰頭癌藥物，該藥疏肝利膽、清熱利濕，破積散結(jié)，可用于胰頭癌的治療。

技術(shù)方案：一種清下瀉胰方劑，由以下成分制備而成：柴胡15-30g、黃芩6-12g、枳實(shí)6-12g、生大黃6-12g、芒硝6-12g、茵陳15-20g 、半枝蓮20-45g、木香10-30g、芍藥9-20g、半夏10-20g、白術(shù)9-20g、鬼臼3-6g、生姜 6-12g。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的一種清下瀉胰方劑，由以下成分制備而成：柴胡18g、黃芩9g、枳實(shí)9g 、生大黃6g、芒硝6g、茵陳18g、半枝蓮30g、木香15g、芍藥9g、半夏10g、白術(shù)9g、鬼臼5g、生姜10g。

上述清下瀉胰方劑的制備方法包括以下步驟：

步驟1：將上述藥材混合，浸泡過夜，加8倍重量的水煮沸30-35 min，倒出藥液，再加8倍重量的水煮沸20-25 min，倒出藥液，再加5倍重量的水煮沸20-25min，倒出藥液；

步驟2：將3次獲得的藥液合并，經(jīng)真空抽濾器過濾，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在80℃水浴下濃縮成100-110ml的藥液；

步驟3：冷卻后，用70%乙醇進(jìn)行醇沉，混勻后密封，置于4℃冰箱內(nèi)冷藏48 h后取出濾液；

步驟4：加20 ml蒸餾水，置于水浴鍋中蒸發(fā)乙醇，濃縮成1.4-1.6 g/ml的藥液。

一種清下瀉胰方劑，可制備成口服液、 顆粒劑、片劑或膠囊劑。

根據(jù)中醫(yī)藥史料記載，本發(fā)明所選用的中藥材具有如下藥理活性和功能主治：

方中柴胡疏肝解郁，黃芩清熱燥濕、瀉火解毒，兩者合為君藥，既可調(diào)肝膽之氣機(jī)，又可清泄內(nèi)蘊(yùn)之濕熱，共除少陽之邪；枳實(shí)破氣消積除痞，大黃、芒硝通里攻下，三者相配可瀉陽明實(shí)結(jié)。茵陳、半枝蓮清熱利濕化濁，茵陳得大黃通腑瀉熱之助，大黃得茵陳通尿利濕，利膽退黃之力，使全身內(nèi)外濕熱、瘀熱從二便解出。木香疏肝理氣；同時白芍養(yǎng)肝陰，助柴、芩以清肝膽；濕邪得去肝陽易扶，肝氣得扶濕邪易去。半夏和胃降逆；佐白術(shù)健脾。腫塊形成，必有毒邪蘊(yùn)結(jié)，非攻不可中病，當(dāng)以鬼臼以毒攻毒，破積散結(jié)，同時輔以生姜解鬼臼之毒，同時增其功效，諸藥配伍，起到了疏肝利膽、清熱利濕、破積散結(jié)等功效。

本發(fā)明所選用的中藥材同時具有現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究機(jī)制：

柴胡、黃芩：柴胡皂苷是柴胡的主要生物活性成份；而黃芩的有效成分主要為黃酮類化合物，其中包括黃芩苷、黃芩素、漢黃芩?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，柴胡皂苷對多種腫瘤均有抑制作用，以消化道腫瘤為著；其可通過干擾腫瘤細(xì)胞S期DNA合成及蛋白質(zhì)代謝、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。分子機(jī)制主要與下調(diào)腫瘤細(xì)胞黏附分子，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并下調(diào)Bcl-2表達(dá)，增加p53和p21/WAFI蛋白的表達(dá)，提高Fas及其mFasL、sFasL兩個配體表達(dá)有關(guān)。亦有報道稱，黃芩苷、黃芩素、漢黃芩可通過自噬途徑抑制人肝癌細(xì)胞株增殖，具體機(jī)制尚不清楚。此外，柴胡和黃芩對機(jī)體特異性和非特異性免疫功能具有多環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)作用，可增加巨噬細(xì)胞表面受體活性，提高c-fos基因轉(zhuǎn)錄，從而使細(xì)胞因子生成增加，同時調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)抗體分泌，增強(qiáng)體液免疫。兩者在機(jī)制上有一定的共同性，即可直接殺傷腫瘤細(xì)胞，由可通過調(diào)節(jié)免疫，改變腫瘤微環(huán)境，共同抑制腫瘤細(xì)胞生長。

枳實(shí)、生大黃、芒硝、茵陳、芍藥：慢性胰腺炎是有多種原因所致的胰腺彌漫性或局限性炎癥，被認(rèn)為是胰腺癌的危險因素，但其機(jī)制仍然不明確。在慢性胰腺炎過程中，由于受到損傷因子的刺激，上皮細(xì)胞通過NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子等促進(jìn)促炎因子的分泌，激活生存和促生長信號通路。枳實(shí)、生大黃、芒硝為大承氣湯中的主要成分，而大承氣湯治療胰腺炎由來已久，有其獨(dú)特優(yōu)勢。多項(xiàng)研究表明，枳實(shí)、生大黃、芒硝可通過抑制NF-κB活性，下調(diào)TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10等炎癥因子表達(dá)，減輕胰腺炎癥反應(yīng)。此外，加用茵陳則為茵陳承氣湯的主要成分，亦是通過NF-κB途徑加強(qiáng)對胰腺炎癥的抑制作用。芍藥的主要活性成分為苷類化合物，研究表明，芍藥總苷通過阻斷Toll樣受體信號通路，抑制狀細(xì)胞的功能，減輕免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)；芍藥苷對巨噬細(xì)胞功能產(chǎn)生負(fù)調(diào)控，包括抑制T細(xì)胞中巨噬細(xì)胞移動抑制因子的表達(dá)，下調(diào)巨噬細(xì)胞移動抑制因子-細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶-環(huán)氧化酶信號，及脂多糖誘導(dǎo)的TNF-α和NO，以減緩慢性炎癥。

半枝蓮、木香：半枝蓮為民間抗癌要藥，在臨床上可治療消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等多種腫瘤。目前已經(jīng)從半枝蓮中分離出一些化合物，主要為生物堿和黃酮類。近來研究表明，半枝蓮含藥血清可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的表達(dá)；半枝蓮黃酮類通過抑制腫瘤細(xì)胞分泌VEGF、NO等促血管生成因子，抑制內(nèi)皮細(xì)胞小管樣結(jié)構(gòu)形成。木香中木香烴內(nèi)酯、川木香內(nèi)酯通過引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換（MPT）、細(xì)胞色素C釋放或破壞線粒體膜電位而誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞 HL-60 凋亡；去氫木香內(nèi)酯有抑制 Rb 蛋白和癌細(xì)胞生長的作用，其通過抑制CDK2激酶活性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來阻止癌細(xì)胞增殖，通過阻止 HL-60 細(xì)胞中 I-κBα 蛋白的降解和磷酸化來抑制 NF-κB活化，并通過增強(qiáng) caspase-8 和caspase-3 活性使 HL-60 癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

半夏、白術(shù)：半夏提取物對多種實(shí)體瘤均有一定抑制作用，其中多糖具有較強(qiáng)的內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)激活活性，增強(qiáng)其吞噬和分泌功能，抑制腫瘤發(fā)生和增殖。白術(shù)中的芹烷二烯酮、蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)醋亦有抗腫瘤作用。

鬼臼、生姜：鬼臼含鬼臼多糖和鬼臼毒素，均為其主要活性成分，鬼臼多糖有抗腫瘤，調(diào)節(jié)免疫等作用，可促進(jìn)免疫功能低下小鼠的淋巴細(xì)胞增殖；而鬼臼毒素可直接抑制裸鼠移植瘤模型中腫瘤的生長；生姜中的姜酚能抑制細(xì)胞因子的合成和緩釋，抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的誘導(dǎo)，而其中有些基因能表達(dá)細(xì)胞因子、細(xì)胞趨化因子和環(huán)氧化酶-2，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑制腫瘤作用；其機(jī)制可能與抑制PGE2、TNF- α的合成，減少促炎細(xì)胞因子IL-12、IL-1 β的產(chǎn)生相關(guān)。臨床發(fā)現(xiàn)，生姜與鬼臼同煎，可增強(qiáng)鬼臼破積散結(jié)之功效，增強(qiáng)抑瘤作用。

有益效果：本發(fā)明的清下瀉胰方劑能夠疏肝利膽、清熱利濕，破積散結(jié)，可用于胰頭癌的治療，可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，一定程度上抑制胰頭原位移植瘤的生長，可減輕晚期胰腺癌患者的癥狀，降低腫瘤指標(biāo)CA199，提高化療的有效率。

附圖說明

圖1是清下瀉胰方劑對裸鼠胰頭癌原位移植瘤生長的影響。**P<0.01，相對于對照組有顯著性差異。#P<0.05，相對于對比例1有顯著性差異。

圖2是清下瀉胰方劑抑制裸鼠胰頭癌原位移植瘤中的TAM的浸潤。**P<0.01，相對于對照組有顯著性差異。

圖3是清下瀉胰方劑含藥血清抑制胰腺癌細(xì)胞生長。*P<0.05，相對于對照組有顯著性差異。

圖4是清下瀉胰方劑含藥血清抑制胰腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型分化。**P<0.01，相對于對照組有顯著性差異。

圖5是清下瀉胰方劑含藥血清對M2型巨噬細(xì)胞分泌IL-6、IL-8、TGF-β能力的影響。**P<0.01，相對于對照組有顯著性差異。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

臨床治療案例

一種清下瀉胰方劑，由以下成分制備而成：柴胡18g、黃芩9g、枳實(shí)9g 、生大黃6g、芒硝6g、茵陳18g、半枝蓮30g、木香15g、芍藥9g、半夏10g、白術(shù)9g、鬼臼5g、生姜10g。

上述清下瀉胰方劑的制備方法為：

將上述藥材混合，加水2000ml，自動煎藥機(jī)煎取120ml各兩袋，每日早晚各服1袋。

收集老年胰腺腺導(dǎo)管腺癌患者30例，通過細(xì)胞病理學(xué)確診，年齡大于60歲，男性18例，女性12例，腫瘤部位：胰頭部，均為晚期無手術(shù)指征。首發(fā)癥狀為身目黃染，食少腹脹，或脅肋疼痛，小便黃赤，大便干結(jié)，舌紅苔黃膩，脈弦滑或滑數(shù)。證屬濕熱毒盛型。隨機(jī)分為2組，每組各15例，對照組吉西他濱單藥化療，治療組吉西他濱聯(lián)合中藥治療，化療療程為4周期，同步口服中藥，每2個周期CT評估患者腫瘤大小，CA199，黃疸指數(shù)，藥物毒副反應(yīng)（消化道反應(yīng)、神經(jīng)末梢反應(yīng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重反應(yīng)）。對照組治療有效率為35.2%，實(shí)驗(yàn)組為43.5%；治療組CA199下降幅度為38.9%，對照組為31.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在治療有效的患者中，治療組黃疸緩解率為40.7%，對照組為31.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組消化道、神經(jīng)末梢副反應(yīng)相仿，均未見嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)副反應(yīng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述，中藥聯(lián)合化療可減輕晚期胰腺癌患者的癥狀，降低腫瘤指標(biāo)CA199，提高化療的有效率，安全有效。

實(shí)施例2

一種清下瀉胰方劑，由以下成分制備而成：柴胡18g、黃芩9g、枳實(shí)9g 、生大黃6g、芒硝6g、茵陳18g、半枝蓮30g、木香15g、芍藥9g、半夏10g、白術(shù)9g、鬼臼5g、生姜10g。

上述清下瀉胰方劑的制備方法為：

步驟1：將上述藥材混合，浸泡過夜，加8倍重量的水煮沸30 min，倒出藥液，再加8倍重量的水煮沸20 min，倒出藥液，再加5倍重量的水煮沸20min，倒出藥液；

步驟2：將3次獲得的藥液合并，經(jīng)真空抽濾器過濾，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在80℃水浴下濃縮成100ml的藥液；

步驟3：冷卻后，用70%乙醇進(jìn)行醇沉，混勻后密封，置于4℃冰箱內(nèi)冷藏48 h后取出濾液；

步驟4：加20 ml蒸餾水，置于水浴鍋中蒸發(fā)乙醇，濃縮成1.5 g/ml的藥液。

裸鼠胰腺原位移植瘤模型的建立

①將1×10⁷個胰腺癌細(xì)胞系PANC-1，重懸于DMEM培養(yǎng)液中，調(diào)整體積為100μL，細(xì)胞密度為1×10⁷/100μL，再與100μL Matrigel等體積混合，得到細(xì)胞懸液，至于冰上備用，

②采用胰島素注射器，將50μL細(xì)胞懸液注射入裸鼠胰頭部胰腺包膜下，即得裸鼠胰頭原位移植瘤模型。

驗(yàn)證清下瀉胰方劑對腫瘤生長的影響

按《中藥藥理研究方法學(xué)》人鼠等效劑量進(jìn)行劑量換算，按0.14 ml/10 g體重計(jì)算用量，進(jìn)行裸鼠灌胃，每日一次，共干預(yù)3周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死實(shí)驗(yàn)動物，摘取移植瘤，測量腫瘤大小并稱重。

如圖1所示，實(shí)施例2可抑制裸鼠胰頭癌原位移植瘤的生長，具有顯著的抑制腫瘤作用。

驗(yàn)證清下瀉胰方劑對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）浸潤的影響

采用免疫組化，檢測腫瘤組織標(biāo)本中CD163（TAM表面標(biāo)志物）陽性細(xì)胞的浸潤程度。

如圖2所示，清下瀉胰方劑處理組，腫瘤中浸潤的CD163陽性細(xì)胞數(shù)目顯著減少，提示清下瀉胰方劑可抑制裸鼠胰頭癌原位移植瘤中的TAM的浸潤。

實(shí)施例3

一種清下瀉胰方劑，由以下成分制備而成：柴胡30g、黃芩12g、枳實(shí)12g、生大黃12g、芒硝12g、茵陳20g 、半枝蓮45g、木香30g、芍藥20g、半夏20g、白術(shù)20g、鬼臼6g、生姜 12g。

上述清下瀉胰方劑的制備方法為：

步驟1：將上述藥材混合，浸泡過夜，加8倍重量的水煮沸35 min，倒出藥液，再加8倍重量的水煮沸25 min，倒出藥液，再加5倍重量的水煮沸25min，倒出藥液；

步驟2：將3次獲得的藥液合并，經(jīng)真空抽濾器過濾，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在80℃水浴下濃縮成110ml的藥液；

步驟3：冷卻后，用70%乙醇進(jìn)行醇沉，混勻后密封，置于4℃冰箱內(nèi)冷藏48 h后取出濾液；

步驟4：加20 ml蒸餾水，置于水浴鍋中蒸發(fā)乙醇，濃縮成1.5 g/ml的藥液。

清下瀉胰方劑含藥血清的制備

①SD大鼠：雄性，體重250g±20g，清潔級。

②按《中藥藥理研究方法學(xué)》人鼠等效劑量進(jìn)行劑量換算，按0.14 ml/10 g體重計(jì)算用量，進(jìn)行裸鼠灌胃，每日2次，連續(xù)3天。第3天上午給藥1h后腹主動脈取血。末次給藥前12h禁食不禁水。

③所采動脈血室溫靜置3h后，3500r/min，10min離心，收集血清，將同組血清混合于同一離心管內(nèi)，56℃水浴鍋內(nèi)水浴30min以滅活，0.2um小濾器過濾。過濾后的血清分裝于1.5ml無菌離心管中，1ml/管，封口膜密封后標(biāo)記保存于-80℃冰箱。

④每只大鼠采血8ml，離心后所得血清為淡黃色澄清透明，分裝標(biāo)記為空白血清和清下瀉胰方劑含藥血清。

MTT法檢測清下瀉胰方劑含藥血清對胰腺癌細(xì)胞生長的影響

①取對數(shù)生長期的胰腺癌細(xì)胞PANC-1，調(diào)整細(xì)胞密度接種96孔板，每孔接種細(xì)胞0.5×104個，12小時后加清下瀉胰方劑含藥血清進(jìn)行處理。

②處理24、48、72、96、120小時后，每孔加入5 mg/ml的MTT 50 μl，37℃孵育4小時。棄盡培養(yǎng)液，每孔加DMSO 800 μl震蕩至紫色結(jié)晶完全消失。用全自動酶標(biāo)儀于490 nm波長測定各孔的吸光度(A490)值，并繪制生長曲線。

如圖3所示，清下瀉胰方劑含藥血清處理組，細(xì)胞生長速度顯著低于對照組。

實(shí)施例4

一種清下瀉胰方劑，由以下成分制備而成：柴胡18g、黃芩9g、枳實(shí)9g 、生大黃6g、芒硝6g、茵陳18g、半枝蓮30g、木香15g、芍藥9g、半夏10g、白術(shù)9g、鬼臼5g、生姜10g。

上述清下瀉胰方劑的制備方法為：

步驟1：將上述藥材混合，浸泡過夜，加8倍重量的水煮沸30 min，倒出藥液，再加8倍重量的水煮沸20 min，倒出藥液，再加5倍重量的水煮沸20min，倒出藥液；

步驟2：將3次獲得的藥液合并，經(jīng)真空抽濾器過濾，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在80℃水浴下濃縮成100ml的藥液；

步驟3：冷卻后，用70%乙醇進(jìn)行醇沉，混勻后密封，置于4℃冰箱內(nèi)冷藏48 h后取出濾液；

步驟4：加20 ml蒸餾水，置于水浴鍋中蒸發(fā)乙醇，濃縮成1.5 g/ml的藥液。

清下瀉胰方劑含藥血清的制備

①SD大鼠：雄性，體重250g±20g，清潔級。

②按《中藥藥理研究方法學(xué)》人鼠等效劑量進(jìn)行劑量換算，按0.14 ml/10 g體重計(jì)算用量，進(jìn)行裸鼠灌胃，每日2次，連續(xù)3天。第3天上午給藥1h后腹主動脈取血。末次給藥前12h禁食不禁水。

③所采動脈血室溫靜置3h后，3500r/min，10min離心，收集血清，將同組血清混合于同一離心管內(nèi)，56℃水浴鍋內(nèi)水浴30min以滅活，0.2um小濾器過濾。過濾后的血清分裝于1.5ml無菌離心管中，1ml/管，封口膜密封后標(biāo)記保存于-80℃冰箱。

④每只大鼠采血6ml，離心后所得血清為淡黃色澄清透明，分裝標(biāo)記為空白血清和清下瀉胰方劑含藥血清。

建立人巨噬細(xì)胞、人胰腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)體系

①人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系U937接種于Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)（Corning公司）上室，并經(jīng)PMA誘導(dǎo)成M0型巨噬細(xì)胞（可進(jìn)一步分化為M1或M2型巨噬細(xì)胞）

②Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)下室接種胰腺癌細(xì)胞系PANC-1。

③共培養(yǎng)系統(tǒng)中加入清下瀉胰方劑含藥血清，對照組加入空白血清。共培養(yǎng)14天。期間更換培養(yǎng)液3次。

④實(shí)驗(yàn)完畢，消化上室中的巨噬細(xì)胞，經(jīng)多聚甲醛固定1h后，采用CD68（巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志）、CD163（M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志）、CD206（M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志）抗體標(biāo)記，于流式細(xì)胞儀上檢測M2型巨噬細(xì)胞的比例。

如圖4所示，清下瀉胰方劑含藥血清處理組，巨噬細(xì)胞中CD163陽性細(xì)胞比例顯著減少，提示清下瀉胰方劑可抑制胰腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型分化。

實(shí)施例5

一種清下瀉胰方劑，由以下成分制備而成：柴胡15g、黃芩6g、枳實(shí)6g、生大黃6g、芒硝6g、茵陳15g 、半枝蓮20g、木香10g、芍藥9g、半夏10g、白術(shù)9g、鬼臼3g、生姜 6g。

上述清下瀉胰方劑的制備方法為：

步驟1：將上述藥材混合，浸泡過夜，加8倍重量的水煮沸30 min，倒出藥液，再加8倍重量的水煮沸20 min，倒出藥液，再加5倍重量的水煮沸20min，倒出藥液；

步驟2：將3次獲得的藥液合并，經(jīng)真空抽濾器過濾，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在80℃水浴下濃縮成100ml的藥液；

步驟3：冷卻后，用70%乙醇進(jìn)行醇沉，混勻后密封，置于4℃冰箱內(nèi)冷藏48 h后取出濾液；

步驟4：加20 ml蒸餾水，置于水浴鍋中蒸發(fā)乙醇，濃縮成1.5 g/ml的藥液。

清下瀉胰方劑含藥血清的制備

①SD大鼠：雄性，體重250g±20g，清潔級。

②按《中藥藥理研究方法學(xué)》人鼠等效劑量進(jìn)行劑量換算，按0.14 ml/10 g體重計(jì)算用量，進(jìn)行裸鼠灌胃，每日2次，連續(xù)3天。第3天上午給藥1h后腹主動脈取血。末次給藥前12h禁食不禁水。

③所采動脈血室溫靜置3h后，3500r/min，10min離心，收集血清，將同組血清混合于同一離心管內(nèi)，56℃水浴鍋內(nèi)水浴30min以滅活，0.2um小濾器過濾。過濾后的血清分裝于1.5ml無菌離心管中，1ml/管，封口膜密封后標(biāo)記保存于-80℃冰箱。

④每只大鼠采血6ml，離心后所得血清為淡黃色澄清透明，分裝標(biāo)記為空白血清和清下瀉胰方劑含藥血清。

制備M2型巨噬細(xì)胞

①人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系U937接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中。

②加MCSF誘導(dǎo)成M2型巨噬細(xì)胞。

清下瀉胰方劑含藥血清對M2型巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響

①M(fèi)2型巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中加入清下瀉胰方劑含藥血清

②ELISA檢測培養(yǎng)液中M2型巨噬細(xì)胞細(xì)胞分泌的促腫瘤細(xì)胞因子IL-6、IL-8、TGF-β分泌水平。

如圖5所示，清下瀉胰方劑含藥血清處理組，M2型巨噬細(xì)胞分泌的IL-6、IL-8、TGF-β顯著下降。

對比例1

一種清下瀉胰方劑，由以下成分制備而成：柴胡18g、黃芩9g、枳實(shí)9g 、生大黃6g、芒硝6g、茵陳18g、半枝蓮30g、木香15g、芍藥9g、半夏10g、白術(shù)9g。

上述清下瀉胰方劑的制備方法為：

步驟1：將上述藥材混合，浸泡過夜，加8倍重量的水煮沸30 min，倒出藥液，再加8倍重量的水煮沸20 min，倒出藥液，再加5倍重量的水煮沸20min，倒出藥液；

步驟2：將3次獲得的藥液合并，經(jīng)真空抽濾器過濾，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在80℃水浴下濃縮成100ml的藥液；

步驟3：冷卻后，用70%乙醇進(jìn)行醇沉，混勻后密封，置于4℃冰箱內(nèi)冷藏48 h后取出濾液；

步驟4：加20 ml蒸餾水，置于水浴鍋中蒸發(fā)乙醇，濃縮成1.5 g/ml的藥液。

裸鼠胰腺原位移植瘤模型的建立

①將1×10⁷個胰腺癌細(xì)胞系PANC-1，重懸于DMEM培養(yǎng)液中，調(diào)整體積為100μL，細(xì)胞密度為1×10⁷/100μL，再與100μL Matrigel等體積混合，得到細(xì)胞懸液，至于冰上備用，

②采用胰島素注射器，將50μL細(xì)胞懸液注射入裸鼠胰頭部胰腺包膜下，即得裸鼠胰頭原位移植瘤模型。

驗(yàn)證清下瀉胰方劑對腫瘤生長的影響

按《中藥藥理研究方法學(xué)》人鼠等效劑量進(jìn)行劑量換算，按0.14 ml/10 g體重計(jì)算用量，進(jìn)行裸鼠灌胃，每日一次，共干預(yù)3周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死實(shí)驗(yàn)動物，摘取移植瘤，測量腫瘤大小并稱重。

如圖1所示，對比例1可抑制裸鼠胰頭癌原位移植瘤的生長，但效果較實(shí)施例2差，說明清下瀉胰方劑中加入藥鬼臼和生姜可顯著提高方劑的抗腫瘤作用。

對比例2

一種清下瀉胰方劑，由以下成分制備而成：鬼臼5g、生姜10g。

上述清下瀉胰方劑的制備方法為：

步驟1：將上述藥材混合，浸泡過夜，加8倍重量的水煮沸30 min，倒出藥液，再加8倍重量的水煮沸20 min，倒出藥液，再加5倍重量的水煮沸20min，倒出藥液；

步驟2：將3次獲得的藥液合并，經(jīng)真空抽濾器過濾，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在80℃水浴下濃縮成100ml的藥液；

步驟3：冷卻后，用70%乙醇進(jìn)行醇沉，混勻后密封，置于4℃冰箱內(nèi)冷藏48 h后取出濾液；

步驟4：加20 ml蒸餾水，置于水浴鍋中蒸發(fā)乙醇，濃縮成1.5 g/ml的藥液。

裸鼠胰腺原位移植瘤模型的建立

①將1×10⁷個胰腺癌細(xì)胞系PANC-1，重懸于DMEM培養(yǎng)液中，調(diào)整體積為100μL，細(xì)胞密度為1×10⁷/100μL，再與100μL Matrigel等體積混合，得到細(xì)胞懸液，至于冰上備用，

②采用胰島素注射器，將50μL細(xì)胞懸液注射入裸鼠胰頭部胰腺包膜下，即得裸鼠胰頭原位移植瘤模型。

驗(yàn)證清下瀉胰方劑對腫瘤生長的影響

按《中藥藥理研究方法學(xué)》人鼠等效劑量進(jìn)行劑量換算，按0.14 ml/10 g體重計(jì)算用量，進(jìn)行裸鼠灌胃，每日一次，共干預(yù)3周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死實(shí)驗(yàn)動物，摘取移植瘤，測量腫瘤大小并稱重。

如圖1所示，對比例2對腫瘤生長抑制作用不明顯。