本發(fā)明的主題是一種多糖水溶液的滅菌方法以及通過所述方法制備的多糖溶液。
背景技術(shù)：
：關(guān)節(jié)病（變形性關(guān)節(jié)?。┦且环N常見的關(guān)節(jié)退行性疾病。其包括軟骨表面的損傷（磨損）、軟骨顆粒的脫離、以及軟骨顆粒導(dǎo)致的滑膜炎癥。在輕中度關(guān)節(jié)病的情況下，近年來已經(jīng)嘗試使用透明質(zhì)酸的關(guān)節(jié)內(nèi)注射(粘性補(bǔ)充療法(visco-supplementation))來改善患者的疼痛狀態(tài)并同時(shí)減緩關(guān)節(jié)病的進(jìn)展。透明質(zhì)酸是滑液（關(guān)節(jié)液）的一種天然成分。透明質(zhì)酸在滑液中起到潤(rùn)滑劑的作用。特別有利的是，透明質(zhì)酸水溶液是粘彈性的。這導(dǎo)致非常良好的潤(rùn)滑性和滑動(dòng)性。由于有利的潤(rùn)滑性，過去的近二十年以來，透明質(zhì)酸溶液已被用于粘性補(bǔ)充療法。現(xiàn)有技術(shù)的目前狀態(tài)是使用由發(fā)酵制成并且以無菌透明質(zhì)酸水溶液形式使用的透明質(zhì)酸。除此之外，原則上也可以將水溶性纖維素衍生物，如羧甲基纖維素和甲基纖維素，以及淀粉衍生物，如羥乙基淀粉，用于粘性補(bǔ)充療法。迄今為止，一般通過暴露于伽馬輻射來滅菌透明質(zhì)酸水溶液。在此情況下通常使用25kgy或更高的劑量。該滅菌法對(duì)最終包裝好的透明質(zhì)酸溶液實(shí)施。但是，伽馬輻射暴露會(huì)帶來嚴(yán)重的缺陷。由于聚合物鏈的降解，根據(jù)伽馬輻射的劑量會(huì)產(chǎn)生或多或少的低分子量降解產(chǎn)物，除此之外，還可能出現(xiàn)導(dǎo)致透明質(zhì)酸溶液變色的副反應(yīng)。使用伽馬輻射的另一個(gè)缺陷是，常用的伽馬源具有球面輻射場(chǎng)。因此，入射劑量可隨著待滅菌物體的位置而變化。這導(dǎo)致不均勻的聚合物降解，不均勻的聚合物降解可能會(huì)造成最終粘度的不均勻性。實(shí)際上不可能得到滅菌后的透明質(zhì)酸溶液的可重復(fù)的最終粘度。另外，伽馬輻射會(huì)導(dǎo)致包裝器件（通常是一次性塑料注射器）的脆性。透明質(zhì)酸水溶液的蒸汽滅菌也會(huì)帶來類似的缺陷，其會(huì)導(dǎo)致透明質(zhì)酸和塑料包裝器件的損壞。由于溶液的粘度相對(duì)較高，透明質(zhì)酸水溶液的無菌過濾基本上是不可行的，或者僅在付出超常努力的情況下可行。并且，無菌過濾僅能夠除去一定尺寸的微生物生命形態(tài)。無菌過濾不能除去或滅活病毒。除了所述物理方法外，通常還使用化合物用于醫(yī)療產(chǎn)品的滅菌。這些化合物包括甲醛、戊二醛、鄰苯二甲醛。使用醛類滅菌的缺陷在于，需要在滅菌后再將醛類除去，以防止在人體中使用期間造成損害。這就排除了在儲(chǔ)存在其最終包裝中的透明質(zhì)酸水溶液的情況下用醛類進(jìn)行滅菌。醛類無法再?gòu)膬?chǔ)存在其最終包裝中的透明質(zhì)酸溶液中除去。氧化劑，如過氧化氫、過氧甲酸、過氧乙酸、次氯酸以及釋放次氯酸的物質(zhì)（如氯胺t2或三氯異氰尿酸），是非常有效的滅菌手段。這些試劑的缺陷在于，它們會(huì)造成溶解的透明質(zhì)酸的顯著氧化降解。另外，未反應(yīng)的氧化劑殘余物可殘留在儲(chǔ)存在其最終包裝中的透明質(zhì)酸溶液中，并且可能會(huì)具有局部毒性作用。制藥業(yè)中已知，蛋白質(zhì)水溶液，如疫苗，對(duì)氧化滅菌劑和各種物理滅菌法（例如用伽馬輻射滅菌）的作用非常敏感。為此，這些蛋白質(zhì)水溶液先經(jīng)過無菌過濾，然后添加少量的β-丙內(nèi)酯以滅活病毒。β-丙內(nèi)酯?；《镜膁na/rna或蛋白質(zhì)的氨基。作為溶劑存在的水能夠緩慢分解β-丙內(nèi)酯，從而僅經(jīng)過短時(shí)間就可使蛋白質(zhì)水溶液中不再存在任何活性的β-丙內(nèi)酯。迄今為止，已知?dú)鈶B(tài)β-丙內(nèi)酯會(huì)不可逆地滅活內(nèi)生孢子（r.k.hoffmann,b.warshowsky:beta-propiolactonevaporasadisinfectant.appl.microbiol.1958年9月；6(5):358-362）。并且，已知β-丙內(nèi)酯在非水有機(jī)單體/單體混合物和含有有機(jī)單體的糊狀粘固粉（pastycements）中滅活內(nèi)生孢子（ep2596812b1）。但是，除了繁殖形態(tài)（vegetativeform）外，微生物還具有可生性形態(tài)（generativeform），如內(nèi)生孢子。微生物的這些可生性生存形態(tài)由革蘭氏陽性菌，特別是桿菌和梭菌屬形成，作為在不利生存條件下持續(xù)存在的一種手段。在它們的休眠狀態(tài)下，內(nèi)生孢子沒有活躍的代謝，并且具有多層孢子莢膜以極大程度地保護(hù)孢子芯免受化學(xué)物質(zhì)作用和其他環(huán)境影響。這使得孢子對(duì)熱和化學(xué)物質(zhì)的作用極為耐受（borick,p.m.:chemicalsterilizers.adv.appl.microbiol.10(1968)291-312;gould,g.w.:recentadvancesintheunderstandingofresistanceanddormancyinbacterialspores.j.appl.bacteriol.42(1977)297-309;gould,g.w.:mechanismsofresistanceanddormancy.p.173-209.inhurst,a.andgould,g.w.(ed.),thebacterialspore.vol.2academicpress,inc.紐約,1983）。由于它們的抗性高，內(nèi)生孢子被用作驗(yàn)證和控制滅菌過程有效性的生物指示物。這是基于以下假設(shè)：內(nèi)生孢子的滅活指示殺滅了所有繁殖型微生物生命形態(tài)。革蘭氏陽性菌的內(nèi)生孢子被分類在國(guó)際抗性iii級(jí)中?？剐詉級(jí)包括無孢子形成的細(xì)菌和形成孢子的細(xì)菌的繁殖形態(tài)，抗性ii級(jí)包括在105℃的蒸汽流中幾分鐘之內(nèi)被殺滅的孢子。根據(jù)dab2008（德國(guó)藥典），所有抗性i-iii級(jí)的微生物均必須被殺滅或不可逆地滅活。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于開發(fā)一種多糖水溶液的滅菌方法。所述方法能夠在滅菌的同時(shí)不引起溶解的多糖聚合物的顯著降解。并且，要開發(fā)的滅菌方法應(yīng)適于對(duì)儲(chǔ)存在其最終包裝中的多糖水溶液、包括與所述多糖水溶液接觸的包裝器件的內(nèi)壁進(jìn)行滅菌。要開發(fā)的滅菌方法應(yīng)安全地滅活耐受性iii級(jí)的微生物。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，無菌應(yīng)被理解為意指根據(jù)en556-1:2001不含活的微生物的狀態(tài)。根據(jù)權(quán)利要求1，本發(fā)明的目的通過一種多糖水溶液的滅菌方法得以解決。根據(jù)本發(fā)明，在緩沖液存在下將β-內(nèi)酯添加到多糖水溶液中，混合物在4℃至40℃的溫度下儲(chǔ)存至少24小時(shí)。一個(gè)優(yōu)選的方法的特征在于：a)將至少一種多糖溶解在水中；b)將至少0.5重量%的β-內(nèi)酯添加到a）中制備的多糖水溶液中；c)將混合物在4℃至40℃的溫度下儲(chǔ)存至少24小時(shí)，其中所述水溶液含有緩沖體系，該緩沖體系的緩沖能力足以緩沖由所述β-內(nèi)酯的水解產(chǎn)生的3-羥基丙酸，從而使滅菌后的多糖水溶液的ph值等于未滅菌的多糖溶液的ph值。根據(jù)權(quán)利要求14，所述目的通過根據(jù)上述方法中的任一種制得的無菌多糖溶液也得以實(shí)現(xiàn)。顯然，令人驚訝地，通過使用根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，可對(duì)多糖水溶液進(jìn)行滅菌而僅發(fā)生最低程度的聚合物降解。這意味著滅菌后的多糖溶液的增比比濃粘度（reducedspecificviscosity）與未滅菌的多糖溶液的增比比濃粘度的比率可保持在大于/等于0.8。在確定該比率時(shí)，是否測(cè)量增比比濃粘度、動(dòng)力粘度或運(yùn)動(dòng)粘度是不重要的。在對(duì)多糖水溶液可進(jìn)行凝膠滲透色譜法處理的情況下，滅菌后的多糖的數(shù)均摩爾質(zhì)量與未滅菌的多糖的數(shù)均摩爾質(zhì)量的比率可保持在大于/等于0.8。并且，根據(jù)本發(fā)明的滅菌方法不會(huì)引起任何由于滅菌過程中的副反應(yīng)而導(dǎo)致的變色。懸浮在多糖水溶液中的耐受性iii級(jí)的內(nèi)生孢子通過根據(jù)本發(fā)明的方法經(jīng)由β-內(nèi)酯的作用滅活。在這種情況下，所述多糖溶液含有緩沖液，所述緩沖液足以能夠緩沖由所述β-內(nèi)酯的水解釋放的3-羥基丙酸，從而使滅菌后的多糖溶液的ph值等于之前未滅菌的多糖溶液的ph值。優(yōu)選在這種情況下使用與β-內(nèi)酯等量的緩沖液。本發(fā)明進(jìn)一步基于以下令人驚訝的發(fā)現(xiàn)：β-內(nèi)酯允許多糖水溶液的滅菌在緩沖液的存在下進(jìn)行，而在所述滅菌過程中沒有發(fā)生多糖的顯著聚合物降解。根據(jù)本發(fā)明的滅菌方法的特別優(yōu)勢(shì)在于，所述多糖溶液在滅菌前后的粘度保持相等。提及多糖水溶液用于粘性補(bǔ)充療法的用途，這意味著所述溶液的粘度可在滅菌前精確調(diào)整，因?yàn)闆]有由于滅菌過程而導(dǎo)致的粘度變化。因此，可提供精確調(diào)整了粘度和其他流變性質(zhì)的無菌多糖溶液用于粘性補(bǔ)充療法。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，不存在由于所述滅菌方法導(dǎo)致的多糖水溶液的變色。多糖是其中大量（至少10個(gè)）單糖通過糖苷鍵彼此相連形成的碳水化合物。在本發(fā)明范圍內(nèi)的水溶性多糖為由單糖、雙糖、其進(jìn)一步的寡聚物或衍生物組成并且以相同的方式彼此相連的多糖。根據(jù)本發(fā)明，所述多糖為天然多糖和人工多糖。根據(jù)本發(fā)明，衍生物應(yīng)被理解為鹽、醚、酸或酯的酯，尤其是堿金屬鹽，特別是鈉鹽和鉀鹽。實(shí)例包括海藻酸、海藻酸鈉、透明質(zhì)酸、透明質(zhì)酸的鈉鹽、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素的鈉鹽、羥乙基纖維素、纖維素醚、淀粉、淀粉醚、瓜爾膠、甲殼素、殼聚糖。優(yōu)選地，所述多糖選自透明質(zhì)酸的鈉鹽、羧甲基纖維素的鈉鹽、羥乙基纖維素、羥乙基淀粉、甲基纖維素和氧化纖維素。根據(jù)本發(fā)明，所述多糖也可以是上述多糖的混合物。所述多糖優(yōu)選以至少0.5重量%的量使用。并且，優(yōu)選以至多5重量%的量使用。特別優(yōu)選以1-2重量%的量使用多糖。每種情況下的量是指水中多糖的量。所述β-內(nèi)酯可為由通式（i）表示的化合物（a1），在所述式中，r1、r2、r3和r4彼此獨(dú)立地可代表h、取代或未取代的烴基、鹵素基團(tuán)、硝基或氰基?；衔铮╝1）的立體化學(xué)不受任何方式的限制。優(yōu)選地，本發(fā)明的范圍包括由通式（i）表示的所有異構(gòu)體作為化合物（i），無論它們的確切構(gòu)型如何。所述烴基彼此獨(dú)立地可為取代的或未取代的烴基。取代的烴基的至少一個(gè)取代基優(yōu)選選自鹵素基團(tuán)、硝基和氰基。所述烴基彼此獨(dú)立地可為飽和或不飽和烴基。優(yōu)選地，不飽和烴基包括至少一個(gè)碳-碳雙鍵。所述烴基彼此獨(dú)立地可為支化或未支化的烴基。優(yōu)選烴基r1、r2、r3和r4為未支化的烴基。所述烴基彼此獨(dú)立地具有1-4個(gè)碳原子范圍內(nèi)的主鏈長(zhǎng)度，優(yōu)選1-2個(gè)碳原子范圍內(nèi)的主鏈長(zhǎng)度，甚至更優(yōu)選1個(gè)碳原子。氟基、氯基和溴基是通式（i）中優(yōu)選的鹵素基團(tuán)。所述基團(tuán)各自彼此獨(dú)立地可代表基團(tuán)r1、r2、r3和r4中的一個(gè)或多個(gè)。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，基團(tuán)r1、r2、r3和r4各自代表h。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，基團(tuán)r1代表甲基且基團(tuán)r2、r3和r4代表h。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，基團(tuán)r1、r2和r3代表h且基團(tuán)r4代表甲基。根據(jù)再一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，基團(tuán)r1和r3代表h且基團(tuán)r2和r4代表甲基。根據(jù)一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，化合物（a1）為β-丙內(nèi)酯（cas編號(hào)57-57-8）。所述β-丙內(nèi)酯也可以是化合物（a2），其為任一化合物（a1）的二聚體?；衔铮╝2）的立體化學(xué)不受任何方式的限制。根據(jù)本發(fā)明，ph值7.0-8.0的磷酸鹽緩沖液優(yōu)選作為緩沖液，其中ph值7.4的磷酸鹽緩沖液是特別優(yōu)選的。特別地，磷酸氫鉀和磷酸氫二鈉的組合、磷酸氫鈉和磷酸氫二鈉的組合、磷酸二鈉和磷酸的組合、磷酸三鈉和磷酸氫鈉的組合以及磷酸三鈉和磷酸的組合非常適合制備所述磷酸鹽緩沖液。優(yōu)選地，以大于/等于0.5重量%的濃度將所述磷酸鹽緩沖液的所有組分一起溶解在所述多糖水溶液中。根據(jù)本發(fā)明，由所述β-丙內(nèi)酯的水解產(chǎn)生的3-羥基丙酸是所述緩沖液的組分。根據(jù)本發(fā)明，3-羥基丙酸和透明質(zhì)酸的鈉鹽或3-羥基丙酸和羧甲基纖維素的鈉鹽組成緩沖液。對(duì)于本發(fā)明而言重要的是，所述多糖水溶液的滅菌在初級(jí)包裝內(nèi)部發(fā)生。因此，不需要額外的努力，如伽馬輻射或電子輻射或高壓蒸汽滅菌。因此，可節(jié)省大量生產(chǎn)成本。為了成功滅菌，重要的是將所述多糖水溶液和β-丙內(nèi)酯混合后立刻將多糖水溶液填充到初級(jí)包裝器件中。這保證了可將足夠的滅菌劑用于多糖溶液和初級(jí)包裝器件內(nèi)壁的滅菌。反之，如果將所述多糖溶液和β-丙內(nèi)酯混合一段延長(zhǎng)的時(shí)間后再填充所述初級(jí)包裝器件，則根據(jù)溫度和在填充所述初級(jí)包裝器件之前消逝的時(shí)間,可能會(huì)因水解生成3-羥基丙酸而損失β-丙內(nèi)酯。特別地，這會(huì)導(dǎo)致所述初級(jí)包裝器件的內(nèi)壁的滅菌產(chǎn)生問題。本發(fā)明的范圍包括根據(jù)本發(fā)明的方法制備的無菌多糖水溶液。所述無菌多糖溶液的特征在于，所述多糖水溶液含有至少一種至少部分可溶于水的多糖、水和3-羥基丙酸，以及緩沖體系。并且，根據(jù)本發(fā)明，所述無菌多糖水溶液含有由鈉離子、磷酸二氫根離子、磷酸氫根離子、磷酸根離子、3-羥基丙酸和3-羥基丙酸根組成的緩沖體系。其中也可含有鉀離子。根據(jù)本發(fā)明，滅菌后的多糖溶液的比濃粘度（reducedviscosity）與未滅菌的多糖溶液的比濃粘度的比率大于0.8。本發(fā)明的范圍還包括所述無菌多糖水溶液用于粘性補(bǔ)充療法以及作為人用藥和獸用藥的藥物載體的用途。具體實(shí)施方式通過以下呈現(xiàn)的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，但不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例將以下的多糖和/或多糖衍生物用于下述實(shí)驗(yàn)中：透明質(zhì)酸的鈉鹽（mn~130萬道爾頓，kraebergmbh），羧甲基纖維素的鈉鹽（mn~90,000道爾頓，sigma-aldrich），甲基纖維素（sm-4000,shin-etsu-chemicalco.），羥乙基纖維素（60sh-4000,shin-etsu-chemical.co）制備ph值為7.4的磷酸鹽緩沖液。為此目的，將1.65g磷酸氫鉀和9.71g二水合磷酸氫二鈉溶于1升蒸餾水中。實(shí)施例1各使用30ml磷酸鹽緩沖液（ph值7.4）制備多糖溶液。多糖多糖在磷酸鹽緩沖液中的濃度[wt.%]透明質(zhì)酸的鈉鹽0.25羧甲基纖維素的鈉鹽2.00甲基纖維素(sm-4000)1.00羥乙基纖維素(60sh-4000)1.00將總計(jì)106cfu的萎縮芽孢桿菌（bacillusatropheus）的孢子懸浮液添加到無菌的25ml塑料管中的5ml的各多糖溶液中。然后用渦旋混合器使孢子均勻懸浮。接下來，將0.5重量%、1.0重量%和2.0重量%的β-丙內(nèi)酯添加到5ml的預(yù)先混合了孢子的各多糖溶液中。然后將樣品在渦旋混合器中再次均化。未用β-丙內(nèi)酯處理的多糖溶液用作陽性對(duì)照。在室溫下儲(chǔ)存48小時(shí)之后，按照dinenisp11737第二部分對(duì)多糖溶液進(jìn)行無菌測(cè)試。該測(cè)試一式兩份進(jìn)行。（+）生長(zhǎng)（-）未生長(zhǎng)。與用作陽性對(duì)照的未處理的多糖溶液相比，用β-丙內(nèi)酯滅菌的多糖溶液顯示沒有任何變色。實(shí)施例2將以下的多糖用于下述實(shí)驗(yàn)中：nahya1:透明質(zhì)酸的鈉鹽（mn~100萬道爾頓，sigma-aldrich），nahya2:透明質(zhì)酸的鈉鹽（mn~130萬道爾頓，kraebergmbh），nahya3:透明質(zhì)酸的鈉鹽（mn~200,000道爾頓，用二氧化氯降解的透明質(zhì)酸）將透明質(zhì)酸溶解在ph7.4的磷酸鹽緩沖液中，以各自達(dá)到1重量%的濃度?？傆?jì)5ml的各透明質(zhì)酸溶液與100μl的β-丙內(nèi)酯混合，并在室溫下儲(chǔ)存48小時(shí)。與此平行地，也儲(chǔ)存未用β-丙內(nèi)酯處理的透明質(zhì)酸溶液作為對(duì)照。在另一個(gè)對(duì)比中，未用β-丙內(nèi)酯處理的透明質(zhì)酸溶液用伽馬輻射滅菌。透明質(zhì)酸溶液的伽馬滅菌由bbfsterilisationsservicegmbh使用co60源以25.2kgy的劑量進(jìn)行。未滅菌條件下的透明質(zhì)酸溶液的ph值為7.4，在用β-丙內(nèi)酯滅菌后ph仍為7.4。與未滅菌的透明質(zhì)酸溶液相比，用β-丙內(nèi)酯滅菌的透明質(zhì)酸溶液顯示沒有任何變色。未滅菌的透明質(zhì)酸溶液和用β-丙內(nèi)酯滅菌的透明質(zhì)酸溶液目測(cè)均為透明且無色的。相反，用伽馬輻射滅菌的透明質(zhì)酸溶液表現(xiàn)出輕微的變黃。透明質(zhì)酸樣品的分子量和分子量分布通過凝膠滲透色譜法使用普魯蘭標(biāo)準(zhǔn)品來確定。使用折光指數(shù)檢測(cè)器（ri檢測(cè)器）作為檢測(cè)器。該測(cè)量使用來自jasco的gpc設(shè)備一式兩份進(jìn)行。mn：數(shù)均摩爾質(zhì)量mw：重均摩爾質(zhì)量d：多分散性。多糖溶液用β-丙內(nèi)酯滅菌并未導(dǎo)致聚合物降解。通過對(duì)比可見，伽馬滅菌導(dǎo)致了顯著的聚合物降解。實(shí)施例3將以下的多糖衍生物用于下述實(shí)驗(yàn)中：羧甲基纖維素的鈉鹽（mw~90,000道爾頓，sigma-aldrich），羥乙基纖維素（60sh-4000,shin-etsu-chemical.co）各使用30ml的磷酸鹽緩沖液（ph值7.4）制備多糖溶液。多糖多糖在磷酸鹽緩沖液中的濃度[wt.%]羧甲基纖維素的鈉鹽2.00羥乙基纖維素(60sh-4000)1.00將總計(jì)100mg的β-丙內(nèi)酯添加到5ml的各多糖溶液中，混合，并在室溫下儲(chǔ)存48小時(shí)。未處理的多糖溶液用作對(duì)照。為了對(duì)溶液進(jìn)行粘度測(cè)量，將溶液稀釋至0.2重量%和0.4重量%的多糖濃度。由于聚合物降解程度高，通過伽馬輻射滅菌的多糖溶液未進(jìn)行稀釋而測(cè)量。與未滅菌的多糖溶液相比，用β-丙內(nèi)酯滅菌的透明質(zhì)酸溶液顯示沒有任何變色。在25℃下使用ubbelohde粘度計(jì)（毛細(xì)管i，k=0.010257）測(cè)量稀釋后的多糖溶液（5倍測(cè)量）。注：使用了目測(cè)透明的甲基纖維素溶液。但是，不能排除甲基纖維素溶液中可能存在透明的凝膠顆粒。這可能是滅菌后的甲基纖維素溶液與未滅菌的甲基纖維素溶液相比運(yùn)動(dòng)粘度略高的原因。在滅菌后的甲基纖維素溶液中可能存在凝膠顆粒。用β-丙內(nèi)酯滅菌的多糖溶液的運(yùn)動(dòng)粘度基本上與未滅菌的多糖溶液的運(yùn)動(dòng)粘度相同。多糖溶液用β-丙內(nèi)酯滅菌并不會(huì)引起聚合物降解。相反，由伽馬滅菌的多糖溶液的運(yùn)動(dòng)粘度與未滅菌的多糖溶液的運(yùn)動(dòng)粘度的對(duì)比明顯可見，伽馬滅菌導(dǎo)致相當(dāng)量的聚合物降解。當(dāng)前第1頁(yè)12