本發(fā)明屬于抗病毒藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及含氮雜環(huán)芳香酯類化合物在制備抗柯薩奇病毒B3型的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

柯薩奇病毒(Coxsaekievirus)是小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬(Enterovirus)成員，其感染可引起多種疾病，如手足口病、無菌性腦膜炎、腦炎、心肌炎、流行性肌炎痛、皰疹性咽峽炎等。已報道的CV共有29個血清型，根據(jù)其對乳鼠的致病特點及對細胞敏感性的不同，可將其分為A和B兩組，即CVA(CVA1-22,24)和CVB(CVB1-6)。以CVBs的感染最為常見，其中CVB3是CVB六個血清型中致病性最強的一型，是病毒性心肌炎最主要的致病原因。據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心(CDC)統(tǒng)計數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，CVB(1-6型)每年可導(dǎo)致約500萬人患腸道系統(tǒng)疾病，其中10％-20％是由CVB3引起的急性心肌炎。近年來CVB3引起手足口病的趨勢也在上升，在我國也有很多CVB3引發(fā)疾病流行的報道。目前對于柯薩奇病毒感染無特效藥物，臨床尚無有針對性的治療手段。很多研究者找到了眾多在體內(nèi)外具有抑制CVB3活性的化合物，但是這些基本還處于實驗室試驗的初級階段，距離在臨床上的實際應(yīng)用還比較遙遠。因此開發(fā)特異有效的抗CVB3藥物勢在必行。

酯類化合物是一類重要的精細化工產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于藥物、材料、食品、增塑劑、溶劑等化工行業(yè)，含氮雜環(huán)芳香酯可廣泛用于香料、防腐劑、溶劑、藥物、染料、涂料和材料合成等方面。本申請人所在項目組自主合成了具有新型結(jié)構(gòu)的含氮雜環(huán)芳香酯化合物，并于2015年在期刊Tetrahedron Letters公開了這幾種含氮雜環(huán)芳香酯化合物的制備方法。未對其生物學(xué)活性進行評價。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供含氮雜環(huán)芳香酯類化合物WY92或WY112在制備抗柯薩奇病毒B3型的藥物中的應(yīng)用，所述的含氮雜環(huán)芳香酯類化合物WY92、WY112，其結(jié)構(gòu)式如下式：

進一步地，所述的含氮雜環(huán)芳香酯類化合物優(yōu)選為WY112。

本發(fā)明在細胞水平發(fā)現(xiàn)WY92和WY112具有抗CVB3病毒的活性，具體表現(xiàn)為可以抑制CVB3病毒引起的細胞病變效應(yīng)，增強感染細胞的存活率。抑制CVB3病毒在細胞內(nèi)的復(fù)制增殖，降低子代病毒產(chǎn)量，保護細胞免受CVB3感染引發(fā)的凋亡。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種抗柯薩奇病毒B3型的藥物，包含有效劑量的作為活性成份的化合物WY92或WY112，或它們的鹽，和藥學(xué)上可以接受的載體。

進一步地，所述藥物制劑是顆粒劑、片劑、丸劑、膠囊劑、注射劑或分散劑。

由此表明化合物WY92和WY112有制備抗CVB3感染的特異治療藥物的潛力，具有臨床應(yīng)用前景。

本發(fā)明的兩種新型含氮雜環(huán)芳香酯類化合物WY92和WY112的制備，參照文獻Tetrahedron Letters 2015，56，6136–6141的方法，具體以過渡金屬鈀為催化劑，在吡啶的鄰位誘導(dǎo)作用下，在芳環(huán)的鄰位用高價碘苯作用，進行芳酰氧基化，得到最終酯化產(chǎn)物。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

1、這些化合物合成工藝簡單，經(jīng)濟快速，易于大規(guī)模生產(chǎn)推廣。

2、從結(jié)構(gòu)相似的化合物中尋找抗CVB3藥物，易于通過構(gòu)效關(guān)系研究尋找到其作用靶點，為進一步制備藥物開發(fā)提供有價值的導(dǎo)向作用。

附圖說明

圖1是6種化合物對于CVB3作用的Hep-2細胞存活率的影響。

圖2是WY92和WY112對于CVB3引起的Hep-2細胞CPE的抑制效應(yīng)。

圖3是WY112對于CVB3子代病毒產(chǎn)量的抑制作用。

圖4是WY112對于CVB3引起的Hep-2細胞凋亡的抑制作用。

具體實施方式

通過以下詳細說明結(jié)合附圖可以進一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

在下文中，如果未特別說明，本發(fā)明所用材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的。

【實施例1】新型含氮雜環(huán)芳香酯類化合物的合成

本發(fā)明合成了以下6種新型含氮雜環(huán)芳香酯類化合物，參照文獻Tetrahedron Letters 2015，56，6136–6141的方法，具體以過渡金屬鈀為催化劑，在吡啶的鄰位誘導(dǎo)作用下，在芳環(huán)的鄰位用高價碘苯作用，進行芳酰氧基化，得到最終酯化產(chǎn)物。

【實施例2】對6種化合物抗CVB3活性進行評估

1、試驗方法：

1.1化合物對于宿主Hep-2細胞的毒性

將Hep-2細胞鋪板96孔板，在37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)長滿單層后，棄去細胞培養(yǎng)液，分別加含不同濃度測試化合物的細胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)，48h后顯微鏡目測并分別記錄其細胞毒性，MTT法測定細胞存活率。SPSS 11.5軟件計算藥物對于細胞的半數(shù)毒性濃度(Median cyctoxic concentration，CC50)。細胞存活率＝(藥物組平均OD₄₉₂值/細胞對照組平均OD₄₉₂值)×100％。

1.2化合物對于CVB3的抑制活性

將Hep-2細胞鋪板96孔板，在37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)長滿單層后，棄去培養(yǎng)液，100TCID50的CVB3病毒液感染細胞1h，加入不同濃度的測試化合物(利巴韋林作為陽性對照藥物)孵育細胞。待繼續(xù)培養(yǎng)約48h，病毒對照孔出現(xiàn)90％左右的CPE病變時，顯微鏡下觀察細胞病變效應(yīng)(CPE)。CPE的觀察記錄方法：無細胞病變記做-，25％以下細胞病變記做+，25％-50％細胞病變記做++，50％-75％細胞病變記做+++，75％以上細胞病變記為++++。

CPE觀察完畢后，利用MTT方法檢測藥物對CVB3的抑制率。具體步驟為：每孔加入MTT 50μL(5mg·mL^-1)，孵育3-4h后去掉上清液，加入等體積的DMSO溶解沉淀。用酶標(biāo)儀在492nm處讀取所對應(yīng)的吸光度(OD₄₉₂值)。利用如下公式計算藥物對CVB3的抑制率。用SPSS 11.5軟件計算藥物的半數(shù)有效濃度(Concentration for 50％of maximal effect，EC50)。

1.3藥物的治療指數(shù)(SI)

SI＝CC50/EC50。治療指數(shù)越高，說明抗病毒潛力越大。

2、試驗結(jié)果

表1具有新型結(jié)構(gòu)的酯類化合物細胞毒性及抗CVB3活性

a^”-”：低于50％的抑制效果或者無效

化合物細胞毒性及抗CVB3活性測試結(jié)果如表1所示。濃度依賴的化合物對于CVB3作用的Hep-2細胞存活率的影響如圖1所示。本發(fā)明檢測到WY92和WY112對于CVB3引起的Hep-2細胞病變效應(yīng)有明顯的抑制作用，其中WY112有強的抑制效果，和陽性對照藥物利巴韋林作用效果類似。其他化合物沒有檢測到抗CVB3活性或抑制效果不足50％?；衔颳Y92和WY112抑制CVB3引起的Hep-2細胞CPE效應(yīng)如圖2所示。CVB3感染的Hep-2細胞變圓，從細胞板壁脫離。40μg/mLWY92和WY112處理時，對于CVB3引起的Hep-2細胞病變效應(yīng)可以達到75％和88％的抑制效應(yīng)。

【實施例3】WY112對于CVB3子代病毒產(chǎn)量的抑制作用

1、試驗方法

對數(shù)生長期的Hep-2細胞鋪板24孔板，長滿單層后100TCID₅₀CVB3感染細胞，37℃孵育1.5h后移去病毒液，PBS洗滌三次，加入含40μg/mL WY112的細胞維持液。48h后收集細胞和上清培養(yǎng)液，-20℃和37℃三次凍融裂解后，TCID50方法測定CVB3病毒滴度。

2、試驗結(jié)果

如圖3所示，40μg/mL WY112處理的Hep-2細胞相對于病毒對照組，其病毒滴度顯著下降，說明了化合物對于CVB3子代病毒產(chǎn)量強烈的抑制作用。

【實施例4】WY112對于CVB3引起的Hep-2細胞凋亡的抑制作用

1、試驗方法

對數(shù)生長期的Hep-2細胞鋪板24孔板，長滿單層后100 TCID50 CVB3感染細胞，37℃孵育1.5h后移去病毒液，加入含40μg/mL WY112的細胞維持液。大約48h后，收集細胞，運用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒在流式細胞儀上進行細胞凋亡的檢測。

2、試驗結(jié)果

實驗結(jié)果如圖4所示，40μg/mL WY112可以有效抑制CVB3導(dǎo)致的細胞凋亡。在病毒對照組細胞凋亡率為83.03％，正常未處理細胞凋亡率1.27％的情況下，40μg/mL WY112處理的細胞凋亡率有17.74％?？梢奧Y112可以有效保護CVB3導(dǎo)致的細胞凋亡。

綜上所述，具有新型結(jié)構(gòu)的酯類化合物WY92和WY112具有較強的抑制CVB3活性，其中WY112具有更佳的抑制效果，有潛力制備一種臨床上有效對抗CVB3感染的藥物。