本發(fā)明屬于醫(yī)用生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及骨充填材料的組合物、預(yù)備品以及它們的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

人體骨修復(fù)技術(shù)經(jīng)過了漫長的發(fā)展時期，主要是在材料的生物相容性方面做出了極大的改進(jìn)，從原始的柳條到金屬，再到醫(yī)用高分子，如今骨修復(fù)材料已經(jīng)進(jìn)入了仿生材料的階段。但是無論是何種材料，在臨床的使用手段上都沒有多大的改善，基本上仍沿用著顆粒型或條形這些不易塑形的材料，在臨床使用中對醫(yī)生技術(shù)要求很高，尤其是對于骨裂或不愈合的骨縫，操作起來十分不便。由于外傷、腫瘤、病理性疾病或其他形式造成的骨創(chuàng)傷及在口腔科骨植入術(shù)中，骨缺損處的形狀常常很不規(guī)則，或創(chuàng)口部位較深。而植骨術(shù)中常用的填充物形狀固定規(guī)整(或散成顆粒狀不成形)，不易隨意塑形，導(dǎo)致在填充過程中在缺損處殘留死腔，影響成骨效果，延長愈合時間。為改善植骨效果，若能采用涂膜、手指塑形、注射器注入等方式對骨充填材料進(jìn)行塑形，必然能獲得更好的修復(fù)效果，但這就對骨填充材料的塑形性提出了更高要求。

中國專利文獻(xiàn)CN102755668公開了一種可塑型醫(yī)用骨泥，其為主要由多糖或蛋白膠液或有機(jī)粘合劑和骨粉組成的泥狀復(fù)合材料。這種骨泥形態(tài)的骨填充物，由于其柔軟易塑的特性，除了在細(xì)小骨縫隙的填充中仍然存有一定欠缺外，能滿足大多植骨術(shù)的塑形要求，但是在骨填充材料的應(yīng)用中，仍然存在以下問題。

就骨粉而言，以Bio-Oss骨粉為例，Bio-Oss骨粉一般自牛骨中提取，經(jīng)過工藝加工，將所有的有機(jī)成分從牛的松質(zhì)骨中徹底去除，而精細(xì)的骨小梁結(jié)構(gòu)和內(nèi)部空隙被保存下來，從而為成骨細(xì)胞的長入提供了支架，并保證了血凝塊的穩(wěn)定和血管的再生，是一種天然的、無抗原性、具有骨傳導(dǎo)作用的移植材料，目前在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。Bio-Oss骨粉化學(xué)成分接近人體骨無機(jī)結(jié)構(gòu)(低晶體天然磷灰石)，宏觀及微觀物理結(jié)構(gòu)與人體松質(zhì)骨也極為相似。但在臨床使用及成骨誘導(dǎo)能力方面卻存在以下不足：(1)骨粉顆粒的彈性模量約1GPa，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于公認(rèn)的能夠誘導(dǎo)干細(xì)胞骨向分化的彈性基底硬度(約0.1MPa)；(2)單純無機(jī)骨材料不能在化學(xué)或生物因子誘導(dǎo)條件下促進(jìn)成骨作用；(3)在那些作為顆粒狀骨粉使用的情形中，顆粒狀骨粉還存在移位、游走、難以成形、不易放置的缺點，導(dǎo)致臨床操作不便，植骨效果難以保證。

目前，臨床上常用的骨充填材料除Bio-Oss骨粉外，還有Bio-Oss骨膠原，是指由90％的Bio-Oss和10％的膠原組成，為疏松多孔結(jié)構(gòu)，呈立體矩形塊狀(3mm*5mm*7mm)。該材料的彈性模量較Bio-Oss骨粉有所降低(約1MPa)，但仍然高于誘導(dǎo)干細(xì)胞骨向分化的理想范圍，且價格昂貴，給病人帶來經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

綜上，目前已有的骨充填材料難以同時解決以下問題：

(1)臨床上常用的骨充填材料(異種骨或人工合成骨材料)硬度過大，不適宜間充質(zhì)干細(xì)胞的骨向分化及骨細(xì)胞功能的維持；

(2)材料只為缺損部位提供物理支持，缺少生長因子的誘導(dǎo)作用；

(3)材料塑形性較差，不能滿足大面積或特殊形態(tài)要求的缺損移植手術(shù)，不適宜臨床上骨缺損治療的個性化需求。

此外，部分骨充填材料的商業(yè)成品，還存在價格昂貴，難以廣泛應(yīng)用的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供一種骨充填材料組合物，包括骨粉、明膠和交聯(lián)劑。

本發(fā)明還提供一種骨充填材料預(yù)備品，其為所述骨充填材料組合物制備的溶液經(jīng)冷凍干燥處理后獲得的凍干產(chǎn)品。

本發(fā)明還提供一種制備骨充填材料預(yù)備品的方法，包括對所述骨充填材料組合物制備的溶液實施冷凍干燥處理。

本發(fā)明進(jìn)一步還提供一種制備骨充填材料的方法，包括將所述骨充填材料組合物或骨充填材料預(yù)備品與醫(yī)學(xué)上可接受的溶劑混合。

此外，本發(fā)明還提供本發(fā)明方法制備的骨充填材料在科研領(lǐng)域中的應(yīng)用和作為醫(yī)用材料的應(yīng)用。

本發(fā)明骨充填材料組合物能夠制得適宜彈性模量的骨填充材料，又由于骨填充材料硬度適宜，可進(jìn)一步促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化及成骨細(xì)胞功能。經(jīng)冷凍干燥處理的骨充填材料組合物，形成了具有大量空隙的骨粉支架結(jié)構(gòu)，更有彈性和韌性，易于塑形，且更具誘導(dǎo)作用。其可以粉末、流體、半固體的形式使用，因而塑形性好。因此，本發(fā)明的骨充填材料兼有彈性、誘導(dǎo)作用、塑形性好的特點。所述方法原材料來源廣泛，制備簡易，在臨床應(yīng)用時，能及時提供可填充的骨充填材料，可適應(yīng)多種骨修復(fù)情形的塑形。

附圖說明

圖1為實施例1的實驗組4制備的骨粉-明膠膜的外觀圖；

圖2為實施例2制備明膠/京尼平-骨粉支架過程中，第一次預(yù)凍后產(chǎn)品的外觀圖；

圖3為實施例2制備明膠/京尼平-骨粉支架過程中，第一次凍干后產(chǎn)品在京尼平水溶液中浸泡的外觀圖；

圖4為實施例2制備明膠/京尼平-骨粉支架過程中，第二次凍干后產(chǎn)品在京尼平水溶液中浸泡后的外觀圖；

圖5為實施例2制備的明膠/京尼平-骨粉支架的環(huán)境掃描電鏡圖；

圖6為倒置顯微鏡下BMSCs的形態(tài)X100；

圖7為免疫印跡檢測成骨標(biāo)記物蛋白水平表達(dá)圖；

圖8為Real-time熒光定量PCR檢測成骨標(biāo)記物mRNA水平表達(dá)圖；

圖9為免疫熒光染色檢測成骨標(biāo)記物的分布狀態(tài)——激光共聚焦顯微鏡下Col-I成骨分化標(biāo)志蛋白標(biāo)記的細(xì)胞染色結(jié)果；

圖10為免疫熒光染色檢測成骨標(biāo)記物的分布狀態(tài)——激光共聚焦顯微鏡下OCN成骨分化標(biāo)志蛋白標(biāo)記的細(xì)胞染色結(jié)果；

圖11為免疫熒光染色檢測成骨標(biāo)記物的分布狀態(tài)——激光共聚焦顯微鏡下OPN成骨分化標(biāo)志蛋白標(biāo)記的細(xì)胞染色結(jié)果；

圖12為免疫熒光染色檢測成骨標(biāo)記物的分布狀態(tài)的統(tǒng)計結(jié)果圖；

圖13為堿性磷酸酶活性測定培養(yǎng)皿中細(xì)胞染色的肉眼觀察情況(上)和倒置顯微鏡下觀察的情況(下)；

圖14為堿性磷酸酶(ALP)活性測定的統(tǒng)計結(jié)果圖。

具體實施方式

在本發(fā)明中，如無特別說明，所有操作均在室溫、常壓條件實施，所有“％”為質(zhì)量百分比。

本發(fā)明的骨充填材料組合物，包括骨粉、明膠和交聯(lián)劑。

本發(fā)明使用的明膠，作為可降解的生物大分子，是成骨誘導(dǎo)因子之一，可有效促進(jìn)植骨區(qū)周圍骨質(zhì)的新生；明膠與膠原相比，還降低了生產(chǎn)成本。以成品骨粉為原材料，保留了材料本身的化學(xué)特性，經(jīng)過與明膠凝膠的混合，重建了材料的多孔支架結(jié)構(gòu)。明膠和骨粉的比例能夠調(diào)節(jié)材料的彈性模量，能夠制備不同彈性模量的骨充填材料，利用物理環(huán)境的誘導(dǎo)作用促進(jìn)了骨移植后的成骨效果，適宜間充質(zhì)干細(xì)胞的骨向分化及骨細(xì)胞功能的維持。明膠具有粘結(jié)固體的效果，經(jīng)交聯(lián)后形成半固體，加入骨粉顆粒后，材料變得易于塑形，不受骨缺損形態(tài)和大小的限制，可根據(jù)需要進(jìn)行個性化的材料制備。

我們已知，間充質(zhì)干細(xì)胞來源的成骨細(xì)胞的數(shù)量和功能對促進(jìn)新骨形成至關(guān)重要。近年來，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)彈性即細(xì)胞所感知的材料的彈性，可以影響誘導(dǎo)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過程。我們經(jīng)過探索，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞成骨分化在彈性大約為10⁵Pa的基質(zhì)上明顯占優(yōu)勢，過軟或者過硬的胞外基質(zhì)都對體外培養(yǎng)的干細(xì)胞成骨分化、成骨細(xì)胞功能維持不利。臨床上常用的骨粉顆粒的彈性模量約1GPa，臨床上單純使用這類材料，在物理環(huán)境角度可能不能達(dá)到最理想的促成骨作用。即，傳統(tǒng)的骨充填材料(包括大多數(shù)骨泥)硬度非常高，而經(jīng)研究顯示，過硬基底(即骨充填材料形成的基底)不利干細(xì)胞骨向分化，而適宜硬度材料可以促進(jìn)骨細(xì)胞活力和成骨。本發(fā)明骨充填材料組合物可通過調(diào)整其成分比例使材料硬度可控，為干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化提供了良好的物理環(huán)境。

所述本發(fā)明骨充填材料組合物，還可包括醫(yī)學(xué)上可接受的溶劑。具體在作為產(chǎn)品包裝時，所述組分可分開包裝，或部分或全部組分混合后包裝。

膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，是人體中含量最豐富的一種結(jié)構(gòu)蛋白，占人體蛋白總量的30％以上。膠原具有來源廣泛、容易獲得、生物安全性好、免疫原性低等特點，在體內(nèi)可被生物體降解，降解產(chǎn)物可被機(jī)體吸收且降解速率可控，利于干細(xì)胞的黏附、增殖、分化，且有利于表型的保持。但是，膠原由于降解速率過快、制備的支架機(jī)械強(qiáng)度小，以及高純度膠原獲得成本高等不足，使其應(yīng)用受到限制。明膠是膠原的降解產(chǎn)物，為一種天然多肽聚合物。使用上，明膠具有可改性、便于加工塑型等優(yōu)點。明膠與膠原相似，具有生物活性強(qiáng)，可促進(jìn)細(xì)胞的生長增殖等優(yōu)點。明膠水溶液在溫度低于35℃可形成熱可逆性的凝膠，在溫度低于35℃時為凝膠狀態(tài)，高于35℃時為溶液。明膠水凝膠的熱穩(wěn)定性和力學(xué)穩(wěn)定性不高，一般通過化學(xué)交聯(lián)的方法改善。

本發(fā)明使用的明膠具有生物因子誘導(dǎo)的作用，同時與Ⅰ型膠原相比還降低了成本。更出乎意料的是，明膠與骨粉的配合使用，還可以調(diào)整骨充填材料的彈性模量，促進(jìn)骨移植后的成骨效果，同時還易于塑形。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述骨粉為羥基磷灰石為主要成分的骨替代材料；優(yōu)選Bio-Oss骨粉。Bio-oss骨粉主要成分是羥基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)，HA是人體及動物骨的主要無機(jī)成分，生物相容性好、硬度大，具有良好的承重性，還具有骨誘導(dǎo)性，可與骨組織牢固結(jié)合。但HA抗疲勞強(qiáng)度不佳、脆性大、強(qiáng)度低，限制了其在生物材料中的直接應(yīng)用。本發(fā)明骨粉與明膠的協(xié)同使用，避免了該問題。

所述骨粉以微觀顆粒大小及所需骨充填材料形狀為標(biāo)準(zhǔn)，可將成品骨粉進(jìn)行不同程度的研磨。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述骨粉的顆粒大小為10um-200um。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述交聯(lián)劑為京尼平、戊二醛、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC HCl)等中的一種或多種；優(yōu)選京尼平。

京尼平(genipin)是從梔子中提取京尼平苷，再由β－葡萄糖苷酶水解后得到的環(huán)烯醚萜類化合物，可以與蛋白質(zhì)、膠原、明膠和殼聚糖等交聯(lián)制作生物材料，是一種優(yōu)良的天然生物交聯(lián)劑，其毒性遠(yuǎn)低于甲醛、戊二醛等傳統(tǒng)化學(xué)交聯(lián)劑。研究表明，genipin的細(xì)胞毒性低于戊二醛的1/10⁴，而其促細(xì)胞增值的能力則是戊二醛的5×10³倍。

所述骨粉與明膠的用量關(guān)系為：相同交聯(lián)劑濃度下，骨粉比例越大，明膠濃度越大，材料越硬。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述明膠與骨粉的質(zhì)量比為0.05-0.4:1，更優(yōu)選0.15-0.4:1。

所述交聯(lián)劑的用量，以本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的能夠達(dá)到交聯(lián)目的的用量范圍為限。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述交聯(lián)劑的用量為骨充填材料總重量的0.05-0.5％，優(yōu)選0.2％。

本發(fā)明還提供一種骨充填材料預(yù)備品，為所述骨充填材料組合物制備的溶液經(jīng)冷凍干燥處理后獲得的凍干產(chǎn)品。該預(yù)備品由冷凍干燥工藝制備，形成了具有大量空隙的骨粉支架結(jié)構(gòu)，更有彈性和韌性，易于塑形。

本發(fā)明另外還提供一種制備骨充填材料預(yù)備品的方法，包括對所述骨充填材料組合物制備的溶液實施冷凍干燥處理。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述冷凍干燥處理分兩步進(jìn)行：

第一步，制備明膠溶液，并與骨粉混合成明膠溶液和骨粉的混合物，冷凍干燥明膠溶液和骨粉的混合物，得明膠-骨粉支架；

第二步，制備交聯(lián)劑溶液，并與明膠-骨粉支架混合成交聯(lián)劑溶液和明膠-骨粉支架的混合物，冷凍干燥交聯(lián)劑溶液和明膠-骨粉支架的混合物，得明膠/交聯(lián)劑-骨粉支架，得所述骨充填材料預(yù)備品。

上述步驟中，制備溶液的常用溶劑為適應(yīng)冷凍干燥工藝常規(guī)使用的溶劑，典型地為生理鹽水。

冷凍干燥法制備的明膠/交聯(lián)劑-骨粉支架，除利用了材料的化學(xué)性質(zhì)和生物特性外，所形成的三維支架結(jié)構(gòu)可模擬體內(nèi)松質(zhì)骨骨小梁的結(jié)構(gòu)，為移植后骨缺損區(qū)血管化和間充質(zhì)干細(xì)胞的附著提供良好的空間結(jié)構(gòu)。而且，可通過與Bio-oss骨粉混合的方法，對材料的力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行改進(jìn)和調(diào)控。此處采用的冷凍干燥法，利用深度冷凍的溶劑在真空下升華的原理制備了多孔支架。采用二次凍干操作，可得到更為均勻和大量空隙的骨粉支架，以利于成骨；而且，這樣獲得的交聯(lián)結(jié)構(gòu)更有彈性和韌性，易于塑形。

此外，凍干法制備三維支架時，還可通過改變混合物的濃度來改變孔的尺寸。在更優(yōu)選的實施方案中，第一步冷凍干燥時，所述明膠溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-10％。在另一更優(yōu)選的實施方案中，第二步冷凍干燥時，所述交聯(lián)劑溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3％-1％，優(yōu)選0.3％。

本發(fā)明另外還提供一種制備骨充填材料的方法，包括：將所述骨充填材料組合物或所述骨充填材料預(yù)備品與醫(yī)學(xué)上可接受的溶劑混合。

所述醫(yī)學(xué)上可接受的溶劑，例如為血液、生理鹽水等。溶劑的用量，以形成便于臨床植骨術(shù)操作的半固態(tài)骨填充材料為限。半固態(tài)的骨填充材料即可用于各種骨充填情形的塑形。具體在臨床應(yīng)用中，還可將所述骨粉、明膠和交聯(lián)劑混合后，直接施入患者的骨移植區(qū)，患者的體液、血液等與所述混合物作用而實現(xiàn)骨的填充。

在一個優(yōu)選的實施方案中，獲得的骨充填材料的彈性模量為0.05-0.8MPa，更優(yōu)選0.05-0.3MPa，最優(yōu)選0.1-0.2MPa。

本發(fā)明還包括所述骨充填材料組合物和骨充填材料預(yù)備品以及它們的制備方法之間任意組合后形成的實施方案。

上述方法制備的骨充填材料作為實驗材料，可廣泛用于科研領(lǐng)域中，例如建立動物模型、實驗分析等。

上述方法制備的骨充填材料作為醫(yī)用材料，可廣泛用于醫(yī)藥領(lǐng)域中，例如作為骨骼或牙齒的修復(fù)材料等。

以下參照實施例和附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，其中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)條件進(jìn)行。

實施例1

(1)在無菌條件下將成品Bio-Oss骨粉(購自GeistlichPharmaAG)研磨成粉末狀，研磨后的粉末顆粒在環(huán)境掃描電子顯微鏡下觀察，顆粒大小約10um-200um。此顆粒大小正適宜混勻制作彈性硬度均勻的支架材料，并形成大小適宜的空隙，以利于細(xì)胞長入，成骨。

(2)配置5％和10％濃度的明膠水溶液，50℃水浴攪拌促溶解，恢復(fù)至室溫待用；配置5％的戊二醛水溶液。

(3)根據(jù)表1的用量，按照下述步驟，分別制備不同配比的骨粉-明膠膜。

操作步驟：

a.在玻璃片上將研磨后的骨粉粉末與明膠溶液、戊二醛溶液迅速混勻，用另一玻璃片蓋在混合后的膠體表面，并適當(dāng)加壓，使混合后的膠體形成完整均勻的膜狀，厚度約1mm。

b.室溫靜置10分鐘后，將蓋有玻璃片的骨粉-明膠膜放入純水中，小心揭去玻璃片，保證膜的完整，注意避免長時間暴露在空氣中，防止明膠水分流失導(dǎo)致膜變形。

c.用抽濾后的1％甘氨酸溶液浸泡并反復(fù)洗脫數(shù)次，至少24小時，以中和游離的戊二醛。

d.以PBS溶液清洗膜3次，并用紫外線照射30-40min，材料制備完畢。

制得的骨粉-明膠膜的彈性模量如表1所示，實驗組4制備的骨粉-明膠膜的外觀如圖1所示。

表1骨粉-明膠膜的制備及彈性模量結(jié)果

備注：上述彈性模量通過原子力顯微鏡對基底材料進(jìn)行測量測得(測試方法具體見實驗例部分)，該測量方法在生物力學(xué)彈性測量實驗中得到了廣泛認(rèn)可和應(yīng)用。

由表1可知，當(dāng)明膠溶液的濃度為5％時，我們逐漸增加組合物中明膠的質(zhì)量比來調(diào)節(jié)組合物的彈性模量，在相同明膠溶液濃度時，增加明膠質(zhì)量比同時伴隨著溶劑(水)的增加，可使組合物的彈性模量隨著明膠的質(zhì)量比增加而下降，此時調(diào)節(jié)組合物彈性模量的關(guān)鍵物質(zhì)是溶劑——水；但具有生物活性的物質(zhì)的添加是本發(fā)明的初衷和優(yōu)勢，于是我們嘗試增加了明膠溶液的濃度，發(fā)現(xiàn)在10％明膠溶液濃度下，得到了相較于5％明膠溶液濃度時更小范圍的彈性變化，并且在溶液-骨粉質(zhì)量比為4：1時，所得到的彈性模量值符合目前已知的干細(xì)胞成骨分化的理想硬度范圍。另外，在對該材料進(jìn)行制備時，我們發(fā)現(xiàn)10％明膠溶液因具有良好的半固體性質(zhì)，在骨粉-明膠膜的制備中表現(xiàn)出了良好的塑形性，所得到的骨粉-明膠膜具有很好的韌性，易于保存，如圖1示。

實施例2

(1)在無菌條件下將成品Bio-Oss骨粉(購自GeistlichPharmaAG)研磨成粉末狀，研磨后的粉末顆粒環(huán)境掃描電子顯微鏡下觀察顆粒大小約10um-200um。此顆粒大小正適宜混勻制作彈性硬度均勻的支架材料，以利于細(xì)胞長入，成骨。

(2)配置10％濃度的明膠水溶液，50℃水浴攪拌促溶解，恢復(fù)至室溫待用；配置1％京尼平水溶液儲液(京尼平購自上海士鋒生物科技有限公司)。

(3)根據(jù)表2的用量，按照下述步驟，制備明膠/京尼平-骨粉支架。制備獲得的明膠/京尼平-骨粉支架的彈性模量見表2。

操作步驟：

a.在冰上操作，明膠水溶液在低溫下緩慢凝固，凝固過程中不斷攪拌，使骨粉均勻分布于凝膠中，約5min穩(wěn)定后，立即放入-20℃，預(yù)凍過夜。得明膠-骨粉如圖2所示。

b.樣品從-20℃冰箱中取出后，放入真空冷凍干燥機(jī)，冷凍干燥24h。

c.凍干后的樣品呈海綿狀，在配置好質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3％的京尼平水溶液中浸泡，37℃恒溫，24h，此時因交聯(lián)反應(yīng)，凝膠呈深藍(lán)色，如圖3所示。

d.再一次進(jìn)行預(yù)凍及凍干過程，得到明膠/京尼平-骨粉支架，呈深藍(lán)色多孔結(jié)構(gòu)，如圖4所示。

表2明膠/京尼平-骨粉支架的制備及彈性模量結(jié)果

(4)電鏡觀察

獲得的明膠/京尼平-骨粉支架孔隙分布均勻，孔隙大小在20-100微米之間，如圖5所示。圖中a和b所示為材料的表面形貌，放大倍數(shù)分別是500X和2000X，箭頭所指為骨粉顆粒，*號所指為明膠支架的孔隙結(jié)構(gòu)。可見材料表面呈均勻的多孔結(jié)構(gòu)，骨粉顆粒均勻相間于明膠多孔結(jié)構(gòu)中。

由以上實驗及結(jié)果可知，利用冷凍干燥的方法，可以得到孔隙均勻分布、大小適宜的支架結(jié)構(gòu)，孔隙大小在20-100微米之間，為干細(xì)胞在材料支架中的附著和鋪展提供了良好的空間結(jié)構(gòu)；研磨后的骨粉在支架結(jié)構(gòu)中均勻鑲嵌，使該支架中發(fā)揮作用的生物活性物質(zhì)良好暴露，從而發(fā)揮其誘導(dǎo)干細(xì)胞骨向分化的作用；通過明膠與Bio-oss骨粉的混合，使所得組合物的彈性模量可控，達(dá)到了適宜干細(xì)胞骨向分化的理想硬度范圍；所得組合物的形態(tài)、大小在上述各步驟中都可進(jìn)行調(diào)節(jié)，可滿足不同缺損的空間需求。所以，本發(fā)明的方法巧妙地將空間結(jié)構(gòu)、支架彈性、生物誘導(dǎo)等對干細(xì)胞成骨有影響的因素綜合在一起，最大程度的保證了植骨后的成骨效果。

實驗例成骨分化誘導(dǎo)實驗

(1)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)能夠穩(wěn)定傳代，在倒置相差顯微鏡下見鋪展的細(xì)胞呈梭形(如圖6)，三天左右達(dá)到90％密度，進(jìn)行1:2傳代，本實驗取3-6代細(xì)胞進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)實驗觀察。

(2)基底材料的制備

采用表3的交聯(lián)劑配比，按照下述方法制備實驗用基底：

a.取彈性模板材料聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)前驅(qū)物A劑(基本組分)至離心管內(nèi)，稱量其質(zhì)量。

b.按質(zhì)量比10:1、20:1、35:1、60:1、80:1比例分別加入B劑(交聯(lián)劑)，充分混合均勻，配平后5000rpm離心5分鐘，去除膠體內(nèi)因攪拌產(chǎn)生的氣泡。

c.將混合好的PDMS混合液傾倒于培養(yǎng)皿內(nèi)，水平靜置1h，待膠體完全鋪展于皿底后，保持水平置入鼓風(fēng)干燥箱中70℃烘烤24h。

d.置于超凈臺內(nèi)，紫外光照射下2h后，再在凝膠表面覆蓋一層0.2mg/mL的I型膠原蛋白溶液(I型膠原蛋白購自：Sigma Ltd)，孵育過夜。

e.在接種細(xì)胞前，用PBS清洗凝膠3遍，并用紫外線照射30～40min，待細(xì)胞接種。

(3)基底材料硬度測量

采用原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope，AFM)對基底材料進(jìn)行彈性測量，本實驗所用儀器為AFM(NT-MDT,NTEGRA)。實驗中采用四棱錐針尖，將AFM探針定位在基底表面，在AFM力曲線模式下進(jìn)行測量，采用赫茲-斯內(nèi)登模型對所得曲線進(jìn)行擬合，得到楊氏模量值。該力學(xué)測定方法用于研究材料的機(jī)械性能，利用AFM力-距離曲線測量系統(tǒng)在相同的負(fù)載速率下測量得到材料表面力的曲線，每個硬度的材料分別測量至少10個點，獲得至少10條力曲線。測量值如表3，可知，基底彈性硬度隨交聯(lián)劑的減少而下降，呈現(xiàn)數(shù)量級的差異。

表3基底材料配比及硬度測量結(jié)果

(4)免疫印跡檢測(Western blot)成骨標(biāo)記物蛋白水平表達(dá)

將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別培養(yǎng)于上述5個不同硬度的胞外基質(zhì)和一個空白培養(yǎng)皿上，提取接種7天后細(xì)胞的總蛋白，用Col-I、OPN、BMP2的特異性抗體進(jìn)行免疫印記實驗，GAPDH作為內(nèi)參。

結(jié)果如圖7，圖中，A是免疫印記的條帶結(jié)果，B、C、D是對A結(jié)果的數(shù)據(jù)統(tǒng)計。該實驗結(jié)果來自8次獨立實驗，其統(tǒng)計結(jié)果的數(shù)值是在各組取平均值和標(biāo)準(zhǔn)差后歸一的結(jié)果，各組值與1:10組進(jìn)行比較，“*”表示P<0.05。

(5)Real-time熒光定量PCR檢測成骨標(biāo)記物mRNA水平表達(dá)

將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別培養(yǎng)于上述5個不同硬度的胞外基質(zhì)和一個空白培養(yǎng)皿上，提取收集接種7天后細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用Col-I、OPN、BMP2的啟動子區(qū)的引物進(jìn)行實時熒光定量PCR去檢測富集到的DNA片段的量，GAPDH作為內(nèi)參。

結(jié)果如圖8，圖中A、B、C、D是實時定量PCR的結(jié)果對實驗所得CT值的數(shù)據(jù)統(tǒng)計。該實驗結(jié)果來自4次獨立實驗，其統(tǒng)計結(jié)果的數(shù)值是在各組取平均值和標(biāo)準(zhǔn)差后歸一的結(jié)果，各組值與1:10組進(jìn)行比較，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01。

(6)免疫熒光染色檢測成骨標(biāo)記物的分布狀態(tài)

6組細(xì)胞在上述不同基底上培養(yǎng)7天后，收集細(xì)胞，應(yīng)用抗Col-I、OCN、OPN抗體，F(xiàn)ITC、羅丹明和DAPI染色，激光共聚焦顯微鏡觀測(20×油鏡)。

結(jié)果見圖9-12。圖9-11是激光共聚焦顯微鏡下的細(xì)胞染色結(jié)果；隨機(jī)挑選5個視野，計算細(xì)胞熒光強(qiáng)度，總計細(xì)胞量大于50個，統(tǒng)計結(jié)果如D圖。該實驗結(jié)果來自3次獨立實驗，其統(tǒng)計結(jié)果的數(shù)值是在各組取平均值和標(biāo)準(zhǔn)差后歸一的結(jié)果，各組值與1:10組進(jìn)行比較，結(jié)果如圖12，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01。綠色：示Col-I和OPN，紅色：示OCN，藍(lán)色：示細(xì)胞核。

(7)堿性磷酸酶(ALP)活性測定

6組細(xì)胞在不同基底上培養(yǎng)7天后，用染色的方法進(jìn)行堿性磷酸酶活性檢測，染色后分別進(jìn)行肉眼觀察和鏡下觀察。

結(jié)果見圖13-14。圖13示培養(yǎng)皿中細(xì)胞染色的肉眼觀察情況(上)和倒置顯微鏡下觀察的情況(下)；隨機(jī)選取鏡下5個視野，進(jìn)行染色密度的統(tǒng)計，各組值與1:10組(高彈性模量)進(jìn)行比較，所得統(tǒng)計結(jié)果如圖14，“*”表示P<0.05。

結(jié)論：由以上實驗說明，利用不同檢測方法、在不同檢測水平上，大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)在聚二甲基硅氧烷(PDMS)彈性基底誘導(dǎo)下表現(xiàn)出了大致相同的骨向分化差異，與較硬基底誘導(dǎo)條件相比，其分化高峰出現(xiàn)在基底彈性模量0.354±0.04MPa的范圍內(nèi)，這一結(jié)果說明，如Bio-oss骨粉(彈性模量約1GPa)這樣高彈性模量的骨充填材料可能不能為干細(xì)胞向成骨分化提供最理想的物理環(huán)境，而本發(fā)明利用高彈性模量的骨粉和低彈性模量的明膠進(jìn)行混合，降低了材料的彈性模量，并且通過嘗試，實現(xiàn)了具體的材料制備過程、模擬了適宜干細(xì)胞生長分化的結(jié)構(gòu)。最重要的是，在本實驗的理論指導(dǎo)下，得到了接近于實驗結(jié)論的優(yōu)選的明膠-骨粉比例和彈性模量數(shù)值。在該數(shù)值的指導(dǎo)下，可通過本發(fā)明的骨填充材料組合物制備出適宜硬度/彈性，兼具骨引導(dǎo)和骨誘導(dǎo)作用、塑形性好的骨填充材料。

最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍的情況下，對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行的修改或者等同替換，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。