本發(fā)明提供一種兼具促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收作用的二氧化鈦納米管及其制備方法。屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，涉及一種利用旋轉(zhuǎn)涂布層層自組裝技術(shù)在負(fù)載辛伐他汀的二氧化鈦納米管表面構(gòu)建殼聚糖/明膠多層膜的方法，屬于鈦材表面功能化的方法。
背景技術(shù)：
：鈦材由于具有良好的機(jī)械性能和生物相容性，而被廣泛作為骨組織植入材料應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。但在植入初期，因其存在生物惰性，缺乏誘導(dǎo)骨生成潛能，導(dǎo)致鈦基植入體與周邊自然骨組織的整合性差，植入體容易松動(dòng)并引發(fā)骨溶癥。尤其對(duì)于患有骨質(zhì)疏松癥的老年患者，骨移植手術(shù)是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。Park和Oh等通過(guò)模擬自然骨的納米結(jié)構(gòu)，在鈦材表面構(gòu)建二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)并證實(shí)具有良好的促成骨作用（Park,2009,Small&Oh,2009,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences）。二氧化鈦納米管因重復(fù)性好、簡(jiǎn)單易行且具有獨(dú)特的納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，可作為負(fù)載藥物、生長(zhǎng)因子等的載體在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。辛伐他汀作為他汀類藥物已被廣泛應(yīng)用于臨床領(lǐng)域，可有效降低血漿膽固醇水平，治療心血管疾病。近年，研究表明辛伐他汀可促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收，成為臨床常見(jiàn)的骨類病癥治療藥物，并且有很大的開(kāi)發(fā)潛力。目前，Jegal和Pullisaar等研究發(fā)現(xiàn)負(fù)載辛伐他汀的支架材料能促進(jìn)成骨分化，進(jìn)而提高骨整合性（Jegal,2016,MacromolecularResearch&Pullisaar,2009,Biochemical&BiophysicalResearchCommunications）。但是如何有效地控制辛伐他汀藥物釋放，避免濃度不適引起炎癥反應(yīng)，仍是一大挑戰(zhàn)。層層自組裝技術(shù)是基于聚陽(yáng)離子和聚陰離子交替沉積制備聚電解質(zhì)自組裝多層膜的技術(shù)。殼聚糖和明膠因具有良好的生物相容性而分別作為多聚陽(yáng)離子和多聚陰離子。隨著多層膜結(jié)構(gòu)的不斷降解，所負(fù)載的藥物釋放，進(jìn)而引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是要提供一種兼具促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收作用的二氧化鈦納米管及其制備方法，其利用二氧化鈦納米管的管狀結(jié)構(gòu)裝載辛伐他汀，并在其表面構(gòu)建多層膜，隨著多層膜結(jié)構(gòu)的物理降解控制二氧化鈦納米管中辛伐他汀藥物釋放性能。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：利用陽(yáng)極氧化法合成二氧化鈦納米管，進(jìn)一步利用滴加法在二氧化鈦納米管里裝載藥物辛伐他汀，最后利用旋轉(zhuǎn)涂布層層自組裝技術(shù)在負(fù)載辛伐他汀的二氧化鈦納米管上構(gòu)建殼聚糖/明膠多層膜。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：a、將鈦材按照常規(guī)方法進(jìn)行預(yù)處理；b、利用陽(yáng)極氧化法在步驟a預(yù)處理后的鈦材表面制備管徑約30-100nm的二氧化鈦納米管；c、采用直接滴加法在步驟b制得的二氧化鈦納米管上負(fù)載辛伐他??；d、利用旋轉(zhuǎn)涂布層層自組裝技術(shù)在步驟c制得的負(fù)載辛伐他汀的二氧化鈦納米管上構(gòu)建殼聚糖/明膠多層膜。進(jìn)一步，所述步驟a是將鈦材剪切成(1-2)cm×(1-2)cm鈦片，依次利用丙酮、無(wú)水乙醇和雙蒸水超聲清洗10-30min，置于37-40℃烘箱干燥備用。進(jìn)一步，所述步驟b是以步驟a預(yù)處理后的鈦片為陽(yáng)極，鉑片為陰極，以體積分?jǐn)?shù)為50%的丙三醇溶液配制的0.27mol/L氟化銨溶液為電解質(zhì)，在10-30V的恒定電壓下電解1-3h，將氧化后的鈦片超聲清洗2-5min，干燥，最后放置于馬弗爐中400-600℃條件下加熱1-3h，制得管徑為30-100nm的二氧化鈦納米管。進(jìn)一步，所述步驟c是以體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液配制的10-15mmol/L辛伐他汀溶液。進(jìn)一步，所述步驟d是以體積分?jǐn)?shù)為0.3-0.5%的醋酸溶液配制5-10mg/mL的殼聚糖，常溫?cái)嚢璨⑷芙猓灰匀羲渲?-10mg/mL的明膠溶液，40-50℃水浴加熱使其溶解；用旋轉(zhuǎn)涂布法在負(fù)載辛伐他汀的二氧化鈦納米管表面構(gòu)建殼聚糖/明膠多層膜，共6-10個(gè)循環(huán)，旋轉(zhuǎn)速度為2000-4000rpm，每層旋轉(zhuǎn)時(shí)間為20-40s。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明利用二氧化鈦納米管的管狀結(jié)構(gòu)裝載辛伐他汀，并通過(guò)多層膜結(jié)構(gòu)的物理降解控制辛伐他汀藥物釋放。實(shí)現(xiàn)藥物緩釋的目的。優(yōu)點(diǎn)：該方法簡(jiǎn)單易行、周期短、成本較低，具有良好的應(yīng)用前景。附圖說(shuō)明圖1是掃描電子顯微鏡圖像：未處理鈦材（a），管徑為70nm的二氧化鈦納米管（b），負(fù)載辛伐他汀的二氧化鈦納米管（c），負(fù)載辛伐他汀并被殼聚糖/明膠多層膜覆蓋的二氧化鈦納米管（d）。圖2是原子力顯微鏡圖像：未處理鈦材（a），管徑為70nm的二氧化鈦納米管（b），負(fù)載辛伐他汀的二氧化鈦納米管（c），負(fù)載辛伐他汀并被殼聚糖/明膠多層膜覆蓋的二氧化鈦納米管（d）。圖3是接觸角檢測(cè)：除第0層的TiO2納米管、第1層辛伐他汀外，奇數(shù)層為明膠，偶數(shù)層為殼聚糖（n=3）。圖4是辛伐他汀分別從負(fù)載辛伐他汀的二氧化鈦納米管，負(fù)載辛伐他汀并被殼聚糖/明膠多層膜覆蓋的二氧化鈦納米管中釋放的曲線。圖5是成骨細(xì)胞在經(jīng)過(guò)不同處理的鈦材表面的堿性磷酸酶含量，其中*表示兩組間p<0.05，**表示兩組間p<0.01。圖6是破骨細(xì)胞在經(jīng)過(guò)不同處理的鈦材表面的酸性磷酸酶含量，其中*表示兩組間p<0.05，**表示兩組間p<0.01。具體實(shí)施方式實(shí)施例1.兼具促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收作用二氧化鈦納米管的制備a、將鈦材剪切成1cm×1cm的鈦片，依次利用丙酮、無(wú)水乙醇和雙蒸水超聲清洗20min，并于37℃烘箱中烘干備用；b、以步驟a所準(zhǔn)備的鈦片為陽(yáng)極，鉑片為陰極，以體積分?jǐn)?shù)為50%的丙三醇溶液配制的0.27mol/L的氟化銨溶液為電解質(zhì)，在15V的恒定電壓下電解1h，將氧化后的鈦片超聲清洗2min，干燥，最后放置于馬弗爐中400℃條件下加熱2h，制得管徑為70nm的二氧化鈦納米管；c、以體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液配制10mmol/L的辛伐他汀溶液，利用滴加法在步驟b所制得的1cm×1cm鈦片表面的二氧化鈦納米管上滴加4μL辛伐他汀溶液；d、以體積分?jǐn)?shù)為0.3%的醋酸溶液配制10mg/mL的殼聚糖，常溫?cái)嚢璨⑷芙?；以三蒸水配?0mg/mL的明膠溶液，50℃水浴加熱使其溶解；用旋轉(zhuǎn)涂布法在步驟c所制得的負(fù)載辛伐他汀的二氧化鈦納米管表面構(gòu)建殼聚糖/明膠多層膜，共6個(gè)循環(huán)，旋轉(zhuǎn)速度為3000rpm，每層旋轉(zhuǎn)時(shí)間為30s。實(shí)施例2.兼具促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收作用二氧化鈦納米管的制備a、將鈦材剪切成1cm×1cm的鈦片，依次利用丙酮、無(wú)水乙醇和雙蒸水超聲清洗20min，并于37℃烘箱中烘干備用；b、以步驟a所準(zhǔn)備的鈦片為陽(yáng)極，鉑片為陰極，以體積分?jǐn)?shù)為50%的丙三醇溶液配制的0.27mol/L的氟化銨溶液為電解質(zhì)，在20V的恒定電壓下電解1h，將氧化后的鈦片超聲清洗2min，干燥，最后放置于馬弗爐中400℃條件下加熱2h，制得管徑為70nm的二氧化鈦納米管；c、以體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液配制10mmol/L的辛伐他汀溶液，利用滴加法在步驟b所制得的1cm×1cm鈦片表面的二氧化鈦納米管上滴加4μL辛伐他汀溶液；d、以體積分?jǐn)?shù)為0.3%的醋酸溶液配制10mg/mL的殼聚糖，常溫?cái)嚢璨⑷芙?；以三蒸水配?0mg/mL的明膠溶液，50℃水浴加熱使其溶解；用旋轉(zhuǎn)涂布法在步驟c所制得的負(fù)載辛伐他汀的二氧化鈦納米管表面構(gòu)建殼聚糖/明膠多層膜，共6個(gè)循環(huán)，旋轉(zhuǎn)速度為3000rpm，每層旋轉(zhuǎn)時(shí)間為30s。結(jié)果如表1所示，對(duì)其表面化學(xué)元素進(jìn)行XPS分析，C元素的逐步提高，Ti元素的消失，說(shuō)明已成功將負(fù)載辛伐他汀并覆蓋殼聚糖/明膠多層膜在二氧化鈦納米管表面。表1、各組樣品表面化學(xué)元素組成（按質(zhì)量百分含量計(jì)算）底物C%O%N%Ti%二氧化鈦納米管16.5058.75024.75負(fù)載辛伐他汀的二氧化鈦納米管19.4856.11024.40負(fù)載辛伐他汀并被殼聚糖/明膠多層膜覆蓋的二氧化鈦納米管64.7021.9213.380由圖1結(jié)果可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)陽(yáng)極氧化在鈦材表面形成了直徑為70nm的二氧化鈦納米管，通過(guò)直接滴加法負(fù)載辛伐他汀后，表面納米管結(jié)構(gòu)仍清晰可見(jiàn)，表明藥物已進(jìn)入納米管，最后通過(guò)旋轉(zhuǎn)涂布?xì)ぞ厶?明膠多層膜后，納米管狀結(jié)構(gòu)被完全覆蓋。由圖2結(jié)果可見(jiàn)，負(fù)載辛伐他汀后，表面仍可觀察到山谷樣結(jié)構(gòu)，這與二氧化鈦納米管結(jié)構(gòu)相關(guān)。相反，多層膜覆蓋后在表面變得較平整。由圖3結(jié)果可見(jiàn)，二氧化鈦納米管接觸角為小于15°，說(shuō)明其具有很強(qiáng)的親水性。當(dāng)負(fù)載辛伐他汀藥物后，接觸角升高至大于40°小于50°。第二層殼聚糖沉積后，接觸角變?yōu)?0-35°。從第七層開(kāi)始，接觸角在30°與45°的之間產(chǎn)生規(guī)律性的波動(dòng)，說(shuō)明從第六層開(kāi)始在TiO2納米管表面已經(jīng)形成單層、全覆蓋的殼聚糖和明膠層。由圖4結(jié)果可見(jiàn)，為了證實(shí)殼聚糖/明膠多層膜可控制辛伐他汀緩慢釋放，在不同時(shí)間點(diǎn)收集0.5mLPBS檢測(cè)辛伐他汀活性，從未鋪膜的二氧化鈦納米管中釋放出的辛伐他汀，24h內(nèi)釋放很快，在48h基本達(dá)到最高值，24h到48h間釋放速率有一定緩解，說(shuō)明納米管一定的緩釋作用，但這種作用維持時(shí)間有限。經(jīng)過(guò)殼聚糖/明膠多層膜修飾后，藥物釋放緩慢，直到120h達(dá)到最高。說(shuō)明殼聚糖/明膠多層膜起到了控制辛伐他汀緩慢釋放的作用。實(shí)施例3.兼具促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收作用二氧化鈦納米管的制備a、將鈦材剪切成1cm×1cm的鈦片，依次利用丙酮、無(wú)水乙醇和雙蒸水超聲清洗20min，并于37℃烘箱中烘干備用；b、以步驟a所準(zhǔn)備的鈦片為陽(yáng)極，鉑片為陰極，以體積分?jǐn)?shù)為50%的丙三醇溶液配制的0.27mol/L的氟化銨溶液為電解質(zhì)，在30V的恒定電壓下電解1h，將氧化后的鈦片超聲清洗2min，干燥，最后放置于馬弗爐中400℃條件下加熱2h，制得管徑為70nm的二氧化鈦納米管；c、以體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液配制10mmol/L的辛伐他汀溶液，利用滴加法在步驟b所制得的1cm×1cm鈦片表面的二氧化鈦納米管上滴加4μL辛伐他汀溶液；d、以體積分?jǐn)?shù)為0.3%的醋酸溶液配制10mg/mL的殼聚糖，常溫?cái)嚢璨⑷芙猓灰匀羲渲?0mg/mL的明膠溶液，50℃水浴加熱使其溶解；用旋轉(zhuǎn)涂布法在步驟c所制得的負(fù)載辛伐他汀的二氧化鈦納米管表面構(gòu)建殼聚糖/明膠多層膜，共6個(gè)循環(huán)，旋轉(zhuǎn)速度為3000rpm，每層旋轉(zhuǎn)時(shí)間為30s。實(shí)驗(yàn)例1．兼具促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收作用的二氧化鈦納米管對(duì)成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)能力取實(shí)施例2經(jīng)過(guò)不同處理后得到的“二氧化鈦納米管”、“二氧化鈦納米管-辛伐他汀”和“二氧化鈦納米管-辛伐他汀-殼聚糖/明膠多層膜”材料以及未處理純鈦（簡(jiǎn)稱為“鈦材”），在不同材料表面接種新生大鼠頭蓋骨的成骨細(xì)胞，接種密度為1×104/cm2，用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2天進(jìn)行換液。分別培養(yǎng)4天和7天后，用200μL1%的TritonX-100溶液收集細(xì)胞，2500轉(zhuǎn)離心5min，利用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中的堿性磷酸酶和蛋白質(zhì)含量，最后用酶標(biāo)儀分別于波長(zhǎng)520nm和562nm處測(cè)定吸光度。結(jié)果如圖5所示，不論在第4天還是7天，與其他組相比，在負(fù)載辛伐他汀并被殼聚糖/明膠多層膜覆蓋的二氧化鈦納米管上生長(zhǎng)的成骨細(xì)胞表達(dá)最高的堿性磷酸酶含量（p<0.05或p<0.01），說(shuō)明辛伐他汀的不斷釋放促進(jìn)成骨細(xì)胞早期分化。實(shí)驗(yàn)例2．兼具促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收作用的二氧化鈦納米管對(duì)破骨細(xì)胞形成的抑制能力取實(shí)施例2經(jīng)過(guò)不同處理后得到的“二氧化鈦納米管”、“二氧化鈦納米管-辛伐他汀”和“二氧化鈦納米管-辛伐他汀-殼聚糖/明膠多層膜”材料以及未處理純鈦（簡(jiǎn)稱為“鈦材”），在不同材料表面接種RAW264.7細(xì)胞，接種密度為6×104/cm2，用含有10%胎牛血清，20ng/mL巨噬細(xì)胞集落刺激因子(m-CSF)及50ng/mL重組核轉(zhuǎn)錄因子kappa-B的配體（RANKL）的條件培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。每隔2天換液。培養(yǎng)7天后，用200μL1%的TritonX-100溶液收集細(xì)胞，2500轉(zhuǎn)離心5min，利用試劑盒對(duì)上清液中的抗酒石酸酸性磷酸酶的活性進(jìn)行檢測(cè)。最后用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)405nm處測(cè)定吸光度。結(jié)果如圖6所示，與未處理鈦與二氧化碳納米管組相比，在負(fù)載辛伐他汀的二氧化鈦納米管和負(fù)載辛伐他汀并被殼聚糖/明膠多層膜覆蓋的二氧化鈦納米管上生長(zhǎng)的破骨細(xì)胞表達(dá)較低的抗酒石酸酸性磷酸酶的活性（p<0.05或p<0.01），說(shuō)明辛伐他汀的不斷釋放抑制破骨細(xì)胞形成。經(jīng)過(guò)上述實(shí)驗(yàn)步驟，可以獲得一種藥物緩釋系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用二氧化鈦納米管的管狀結(jié)構(gòu)裝載辛伐他汀，進(jìn)而在其表面構(gòu)建多層膜，隨著多層膜結(jié)構(gòu)的物理降解控制二氧化鈦納米管中辛伐他汀藥物釋放性能。此外，該系統(tǒng)能有效促進(jìn)成骨分化，抑制破骨細(xì)胞形成。上述實(shí)施方案中需要注意的問(wèn)題是：所有與細(xì)胞接觸的實(shí)驗(yàn)用具和試劑都必須是無(wú)菌的。最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制。盡管通過(guò)上述實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明做了較為詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員仍可以根據(jù)
發(fā)明內(nèi)容和實(shí)施例部分所描述的技術(shù)內(nèi)容，在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書(shū)所限定的本發(fā)明的精神和范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3