本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，涉及疫苗的制劑技術(shù)，具體涉及用于豬支原體肺炎活疫苗的耐熱保護(hù)劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬支原體肺炎又稱豬氣喘病，是由豬肺炎支原體引起的一種接觸性慢性呼吸道傳染病，廣泛存在于世界各地。豬只感染后除導(dǎo)致飼料轉(zhuǎn)化率降低、生長發(fā)育不良外，且易繼發(fā)病毒或細(xì)菌感染，造成豬死亡率升高，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失慘重。疫苗免疫是預(yù)防本病最重要的手段。
使用疫苗是預(yù)防豬支原體肺炎的主要手段，目前已經(jīng)上市的豬支原體肺炎活疫苗(168株)、豬支原體肺炎活疫苗(RM48株)和豬支原體肺炎活疫苗(Z株)3種疫苗，均在現(xiàn)場使用中取得了良好的效果。但是，以上3種活疫苗常用的保護(hù)劑主要是蔗糖、牛奶、明膠等，組方簡單，保護(hù)性能差。如果在2℃～8℃條件下，保存期只有3～6個(gè)月，多需要在-15℃以下保存，使這類活疫苗的長期保存和長途運(yùn)輸受到很大限制，加上基層防疫部門缺乏必要的冷凍和冷藏設(shè)施，容易因免疫失效而造成疫病流行。所以，豬支原體肺炎活疫苗耐熱保護(hù)劑的研究非常急需，發(fā)達(dá)國家在20世紀(jì)80年代就已開始進(jìn)行耐熱保護(hù)劑的研究，目前已經(jīng)基本采用耐熱凍干保護(hù)劑生產(chǎn)凍干疫苗，但由于保護(hù)劑的研究和應(yīng)用屬于保密資料，本領(lǐng)域技術(shù)人員無法獲知準(zhǔn)確的配方。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
解決的技術(shù)問題：本發(fā)明提供用于豬支原體肺炎活疫苗耐熱保護(hù)劑及其制備方法和應(yīng)用，所生產(chǎn)豬支原體肺炎活疫苗，受熱后疫苗滴度下降少，疫苗的效力更加穩(wěn)定，且凍干效率高，耗費(fèi)成本低。
技術(shù)方案：用于豬支原體肺炎活疫苗耐熱保護(hù)劑，由以下組分中的至少兩種按重量百分比計(jì)酵母提取物1-5％、水解乳蛋白0.5-3％、β-環(huán)糊精1-3％、明膠1-3％、蔗糖2-15％、聚乙烯吡咯烷酮1-8％和海藻糖1-6％，其余為磷酸鹽緩沖液組成。
優(yōu)選的，以整體計(jì)，每100mL耐熱保護(hù)劑中，按重量百分比各組分的含量為配方1：明膠1％，蔗糖4％，水解乳蛋白2％，酵母提取物2％，其余為磷酸鹽緩沖液組成；
或，配方2：明膠1.2％，蔗糖2％，海藻糖2％，水解乳蛋白2％，酵母提取物2％，其余為磷酸鹽緩沖液組成；
或，配方3：明膠1.5％，海藻糖4％，水解乳蛋白2％，酵母提取物2％，聚乙烯吡咯烷酮1％，其余為磷酸鹽緩沖液組成；
或，配方4：β-環(huán)糊精1.2％，蔗糖2％，海藻糖2％，水解乳蛋白2％，酵母提取物2％，其余為磷酸鹽緩沖液組成。
上述用于豬支原體肺炎活疫苗耐熱保護(hù)劑的制備方法，包括：按照所述比例稱取各組分，混合均勻，高壓滅菌而得。
上述用于豬支原體肺炎活疫苗耐熱保護(hù)劑的應(yīng)用，所述疫苗為豬支原體肺炎活疫苗168株、豬支原體肺炎活疫苗RM48株或豬支原體肺炎活疫苗Z株。
上述應(yīng)用包括以下步驟：將豬支原體肺炎菌液與豬支原體肺炎活疫苗耐熱保護(hù)劑混合均勻，冷凍干燥而到。
上述豬支原體肺炎菌液與豬支原體肺炎活疫苗耐熱保護(hù)劑按照體積比1:0.1-9混合。
優(yōu)選的，豬支原體肺炎菌液與豬支原體肺炎活疫苗耐熱保護(hù)劑按照體積比為1:1混合。
上述冷凍干燥的方式為：-40℃預(yù)凍4h，一期升華-40℃～-15℃，28h，干燥-15℃～28℃，17h；或者，-40℃預(yù)凍4h，一期升華-40℃～-15℃，18h，干燥-15℃～28℃，14h；-40℃預(yù)凍4h，一期升華-40℃～-15℃，14h，干燥-15℃～28℃，6h。
優(yōu)選的，上述冷凍干燥的方式為-40℃預(yù)凍3h；程序控溫設(shè)定：-50℃30min；-8℃15h；13℃1h10min；28℃6h50min。
有益效果：本發(fā)明制備優(yōu)化了得到的具有優(yōu)異性能的耐熱保護(hù)劑，尤其適用于豬支原體肺炎活疫苗(168株)，用其制備的豬支原體性肺炎耐熱保護(hù)劑活疫苗(168株)安全有效、穩(wěn)定性高，抗原凍干損失率低，耐熱性能良好，保存期長。針對該耐熱保護(hù)劑匹配了適宜的凍干操作條件，進(jìn)一步促進(jìn)了其對抗原的保護(hù)效果，并提升了凍干效率。所制備的豬支原體肺炎活疫苗(168株)在37℃放置10日后，抗原含量不下降超過1個(gè)滴度；在2～8℃保存30個(gè)月后，仍保存凍干后的外形，抗原含量仍≥106CCU每頭份；其真空度、剩余水分等各項(xiàng)檢驗(yàn)均合格。
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不限制發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改和替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1(豬支原體肺炎耐熱保護(hù)劑活疫苗(168株)的制備及檢驗(yàn))
1.實(shí)驗(yàn)材料
1.1毒株：豬支原體肺炎活疫苗(168株)由貴州福斯特生物科技有限公司提供。
1.2材料：KM2培養(yǎng)基及相關(guān)實(shí)驗(yàn)耗材由貴州福斯特生物科技有限公司提供。
1.3試劑：β-環(huán)糊精、明膠、蔗糖、水解乳蛋白、酵母提取物、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖，磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等均為分析純，購自試劑公司。
1.4耐熱保護(hù)劑的配制
按照以下配方組成配制保護(hù)劑，具體如下：
配方1耐熱保護(hù)劑(重量百分比：％)，各組分的含量為明膠1％，蔗糖4％，水解乳蛋白2％，酵母提取物2％，其余為磷酸鹽緩沖液組成。
配方2耐熱保護(hù)劑(重量百分比：％)，各組分的含量為明膠1.2％，蔗糖2％，海藻糖2％，水解乳蛋白2％，酵母提取物2％，其余為磷酸鹽緩沖液組成。
配方3耐熱保護(hù)劑(重量百分比：％)，各組分的含量為明膠1.5％，海藻糖4％，水解乳蛋白2％，酵母提取物2％，聚乙烯吡咯烷酮1％，其余為磷酸鹽緩沖液組成。
配方4耐熱保護(hù)劑(重量百分比：％)，各組分的含量為β-環(huán)糊精1.2％，蔗糖2％，海藻糖2％，水解乳蛋白2％，酵母提取物2％，其余為磷酸鹽緩沖液組成。
對照組配方常規(guī)保護(hù)劑(根據(jù)現(xiàn)行版《中國獸藥典》附錄配制)，各組分的含量明膠1.5％，蔗糖12.5％，其余為純水。
根據(jù)配方設(shè)計(jì)，將各組分完全溶解混合均勻后，于121℃滅菌15分鐘，即得。
2.疫苗的制備
2.1配苗與分裝
上述5個(gè)配方的耐熱保護(hù)劑的應(yīng)用，是將配制好的耐熱保護(hù)劑與豬支原體肺炎活疫苗(168株)菌液半成品(細(xì)菌含量≥108CCU/mL)按照1:1比例相混合，分裝至西林瓶中，每瓶分裝量2mL，疫苗規(guī)格10頭份/瓶。
2.2疫苗的凍干
將分裝好的疫苗按照如下程序進(jìn)行凍干：-40℃預(yù)凍3h；程序控溫設(shè)定：-50℃30min；-8℃15h；13℃1h10min；28℃6h50min。
3.疫苗的檢驗(yàn)
3.1安全性檢驗(yàn)以下二者均符合才能合格
(1)小鼠安檢
每個(gè)配方疫苗任取5瓶加生理鹽水10倍稀釋混合后，接種18～22g清潔級小鼠5只，每只皮下接種5頭份，觀察10日，應(yīng)全部健活。如個(gè)別死亡，可重檢一次。重檢應(yīng)全部健活。
(2)豬安檢
用5～15日齡健康易感豬3頭，各右側(cè)肺內(nèi)注射疫苗10頭份，觀察25日。記錄如下重要的癥狀：咳嗽、呼吸困難、俯臥、嘔吐、食欲不振、震顫和死亡，注射后第1～25日的每日上午檢測直腸溫度。根據(jù)豬安檢實(shí)驗(yàn)臨床癥狀評判標(biāo)準(zhǔn)，豬安檢實(shí)驗(yàn)全部累計(jì)總分不大于2判為安全，累計(jì)總分大于5判為不安全，累計(jì)總分2～5分，可重檢1次。重檢累計(jì)總分不大于2判為安全。
豬安檢試驗(yàn)臨床癥狀判定標(biāo)準(zhǔn)如下：
記錄如下癥狀：咳嗽、呼吸困難、俯臥、嘔吐、食欲不振、震顫、死亡和直腸溫度等。發(fā)病豬臨床癥狀評判標(biāo)準(zhǔn)見表1。
豬安檢試驗(yàn)中，每頭試驗(yàn)豬癥狀全部累計(jì)，總分不大于2判為安全，累計(jì)總分大于5判為不安全，累計(jì)總分2～5，可重檢1次，重檢累計(jì)總分大于2判為安全。
表1豬支原體肺炎發(fā)病豬臨床評判標(biāo)準(zhǔn)
3.2耐熱性能的檢驗(yàn)
分別將凍干的豬支原體肺炎耐熱保護(hù)劑活苗(168株)5個(gè)組別分別置于37℃放置不同時(shí)間10日后，取出后分別進(jìn)行耐熱前后疫苗物理性狀、剩余水分、純粹檢驗(yàn)、鑒別檢驗(yàn)、真空度測定和效率檢驗(yàn)。
(1)物理性狀、純粹檢驗(yàn)、鑒別檢驗(yàn)、剩余水分和真空度測定按照現(xiàn)行版《中國獸藥典》進(jìn)行，結(jié)果均應(yīng)符合規(guī)定。
(2)效力檢驗(yàn)采用CCU含量測定方法將豬肺炎支原體待測培養(yǎng)物用KM2培養(yǎng)基進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋，即1.8mLKM2培養(yǎng)基接種0.2mL樣品，依次1：10遞減連續(xù)稀釋成10-1、10-2……10-8、10-9、10-10、10-11、10-12，另設(shè)KM2培養(yǎng)基對照3管，共15管，同批作3個(gè)重復(fù)，置37℃培養(yǎng)，每日觀察記錄培養(yǎng)基顏色變化和混濁度的變化直至第10日，并對培養(yǎng)物涂片，染色，鏡檢，檢查有無典型豬肺炎支原體菌體形態(tài)。稀釋培養(yǎng)后，菌體生長、變色的最高稀釋度為待檢培養(yǎng)物CCU含量。
3.3保存期試驗(yàn)
按照耐熱保護(hù)劑配方1～5，試制的疫苗放置在2℃～8℃保存6、12、18、24和30個(gè)月后月測定CCU，觀察疫苗保存期內(nèi)的穩(wěn)定性。
4.結(jié)果與分析
4.1安全性檢驗(yàn)及物理性狀、剩余水分、純粹檢驗(yàn)、鑒別檢驗(yàn)、和真空度測定的差異，按照不同配方1～4和對照組試制的疫苗按照現(xiàn)行版《中國獸藥典》見表1
表1不同配方的安全性檢驗(yàn)及物理性狀、剩余水分、純粹檢驗(yàn)、鑒別檢驗(yàn)、和真空度測定
4.2耐熱凍干保護(hù)劑的篩選根據(jù)豬支原體肺炎活疫苗(168株)的特點(diǎn)，選擇不同的保護(hù)劑基質(zhì)設(shè)計(jì)5組耐熱凍干保護(hù)劑，各組保護(hù)劑的配比配方1～4和對照組。在抗原含量相同的情況下，與設(shè)定好的保護(hù)劑進(jìn)行混合后凍干，比較凍干前后的效價(jià)差異及耐老化試驗(yàn)后及保存期效力含量上的差異。結(jié)果如表2。
表2不同配方的凍干前后效力檢驗(yàn)、耐老化實(shí)驗(yàn)及保存期測定
從表1、表2的結(jié)果顯示，不同耐熱保護(hù)劑配方1～5生產(chǎn)的豬支原體肺炎活疫苗(168株)在安全性檢驗(yàn)及物理性狀、剩余水分、純粹檢驗(yàn)、鑒別檢驗(yàn)、和真空度測定上沒有明顯差異，符合現(xiàn)行版《中國獸藥典》的要求。在耐熱性能上配方3要優(yōu)于其他配方，在保存期的效價(jià)上，配方3要優(yōu)于其他配方組，能夠在2℃～8℃維持107CCU每頭份高效價(jià)。同時(shí)，配方1～4要在耐熱性能及保存期上要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于對照組常規(guī)配方，效力檢驗(yàn)上能夠達(dá)到現(xiàn)行版《中國獸藥典》的要求。
實(shí)施例2(合格產(chǎn)品凍干保護(hù)劑凍干曲線的優(yōu)化)
1、實(shí)驗(yàn)方法
根據(jù)所用凍干機(jī)器(型號：LY0-05；生產(chǎn)廠家：東富龍科技股份有限公司)的性能特點(diǎn)、實(shí)施例1所篩選的耐熱保護(hù)劑配方3及凍干的生物學(xué)特性及生化指標(biāo)等因素，初步設(shè)定了3組凍干曲線，以最佳的適宜生產(chǎn)的凍干曲線；按照實(shí)施例1制備豬支原體肺炎耐熱保護(hù)劑活疫苗(168株)，凍干曲線分別為：
(1)-40℃預(yù)凍4h，一期升華-40℃～-15℃，28h，干燥-15℃～28℃，17h；
(2)-40℃預(yù)凍4h，一期升華-40℃～-15℃，18h，干燥-15℃～28℃，14h；
(3)-40℃預(yù)凍4h，一期升華-40℃～-15℃，14h，干燥-15℃～28℃，6h。
2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
保護(hù)劑配方3凍干曲線優(yōu)化結(jié)果見表3。
表3優(yōu)化后保護(hù)劑配方凍干曲線優(yōu)化結(jié)果
從表3可以看出，第3組凍干曲線制備的活疫苗在37℃耐熱后的CCU含量不下降，比其他2組凍干曲線制備的疫苗更有優(yōu)勢。
綜上，本發(fā)明耐熱保護(hù)劑及使用該保護(hù)劑的豬支原體肺炎活疫苗(168株)的制備可用于大規(guī)模生產(chǎn)，并且能夠在37℃耐熱保存10天抗原含量不下降，同時(shí)在2℃～8℃保存不同30個(gè)月，效價(jià)不降低，并且安全，穩(wěn)定性高。