本發(fā)明屬于藥物成分提取領域，尤其涉及一種響應面法優(yōu)化秦嶺龍膽總黃酮提取工藝的方法。

背景技術：

秦嶺龍膽又名茱苓草，屬龍膽科植物。由于產(chǎn)自秦嶺太白山，故名秦嶺龍膽，以干燥的帶花全草入藥。性味“苦、平”，民間常用其治療消化道疾病及婦科疾病。查閱相關資料，從秦嶺龍膽中已經(jīng)分離的化學成分有：黃酮類、三萜類、裂環(huán)環(huán)烯醚萜類、環(huán)烯醚萜類、多糖類等。根據(jù)海內(nèi)外相關文獻報道，黃酮類化合物具有抗炎、擴張血管的作用外，還可降三高及止咳、祛痰平喘等。

目前，提取工藝的優(yōu)化方法多為正交設計法和均勻設計法，此類方法的缺點是不能考察各因素之間的相互作用，同時也很難考察多個響應值與因素之間的交互作用關系。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種響應面法優(yōu)化秦嶺龍膽總黃酮提取工藝的方法，旨在解決目前的提取工藝的優(yōu)化方法多為正交設計法和均勻設計法，此類方法不能考察各因素之間的相互作用，同時也很難考察多個響應值與因素之間的交互作用關系的問題。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種響應面法優(yōu)化秦嶺龍膽總黃酮提取工藝的方法以秦嶺龍膽總黃酮的提取率為指標優(yōu)化秦嶺龍膽總黃酮提取工藝，通過對提取時間、料液比、乙醇濃度三因素的多元回歸和二項擬合建立回歸方程，得到秦嶺龍膽總黃酮提取率為響應面值的響應曲面圖，再通過對試驗結(jié)果的分析，確定秦嶺龍膽總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)。

進一步，各因素對于秦嶺龍膽總黃酮提取率影響的排序為：料液比>乙醇濃度)>提取時間。

進一步，料液比最佳范圍為1：35～1:45，乙醇濃度最佳范圍為55％～65％，最佳提取時間范圍為25～35min。

進一步，最佳提取時間為30min，最佳料液比為1:40，最佳乙醇濃度為60％。

進一步，所述響應面法優(yōu)化秦嶺龍膽總黃酮提取工藝的方法先用對照品蘆丁繪制標準曲線，計算出回歸方程，再將測得的吸光度值代入回歸方程計算總黃酮含量，即可求出樣品溶液中總黃酮含量C,代入下式計算秦嶺龍膽總黃酮提取率：

式中：V為定容體積，單位為mL，M為稱取的秦嶺龍膽藥材粉末的質(zhì)量，單位為g，C為樣品溶液中總黃酮的含量，單位為mg/mL。

本發(fā)明以秦嶺龍膽總黃酮的提取率為指標，來優(yōu)化秦嶺龍膽總黃酮提取工藝，通過對提取時間、料液比、乙醇濃度三因素的多元回歸和二項擬合建立回歸方程，得到秦嶺龍膽總黃酮提取率為響應面值的響應曲面圖，再通過對試驗結(jié)果的分析，確定了秦嶺龍膽總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)，因為此方法擬合度較高，能夠為實際生產(chǎn)提供可靠地參考。響應面優(yōu)化法，考慮了試驗隨機誤差；同時，響應面法將復雜的未知的函數(shù)關系在小區(qū)域內(nèi)用簡單的一次或二次多項式模型來擬合，計算比較簡便，是解決實際問題的有效手段。所獲得的預測模型是連續(xù)的，與正交實驗相比，其優(yōu)勢是：在實驗條件尋優(yōu)過程中，可以連續(xù)的對實驗的各個水平進行分析，而正交實驗只能對一個個孤立的實驗點進行分析。本發(fā)明使用單因素實驗，確定合理的響應面優(yōu)化法實驗的各因素與水平。響應面優(yōu)化之前先按照實驗設計安排實驗，得出實驗數(shù)據(jù)，下一步即是對實驗數(shù)據(jù)進行響應面分析。響應面分析主要采用的是非線性擬合的方法，以得到擬合方程。最為常用的擬合方法是采用多項式法，簡單因素關系可以采用一次多項式，含有交互相作用的可以采用二次多項式，更為復雜的因素間相互作用可以使用三次或更高次數(shù)的多項式。一般，使用的是二次多項式。根據(jù)得到的擬合方程，可采用繪制出響應面圖的方法獲得最優(yōu)值；也可采用方程求解的方法，獲得最優(yōu)值。另外，使用一些數(shù)據(jù)處理軟件，可以方便的得到最優(yōu)化結(jié)果。響應面分析得到的優(yōu)化結(jié)果是一個預測結(jié)果，需要做實驗加以驗證。如果根據(jù)預測的實驗條件，能夠得到相應的預測結(jié)果一致的實驗結(jié)果，則說明進行響應面優(yōu)化分析是成功的；如果不能夠得到與預測結(jié)果一致的實驗結(jié)果，則需要改變響應面方程，或是重新選擇合理的實驗因素與水平。本發(fā)明得到了基金項目的權利支持，包括：陜西省科技廳項目(編號：2016SF-378)。名稱：秦嶺龍膽揮發(fā)油提取-純化及其藥理活性研究；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(編號：2015131238219)；陜西省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(編號：2508)。名稱：秦嶺龍膽總黃酮提取工藝研究。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例提供的料液比和乙醇濃度對總黃酮提取率的響應面圖與等高線圖；

圖2是本發(fā)明實施例提供的料液比和提取時間比對總黃酮提取率的響應面圖與等高線圖；

圖3是本發(fā)明實施例提供的提取時間和乙醇濃度對總黃酮提取率的響應面圖與等高線圖。

具體實施方式

為能進一步了解本發(fā)明的發(fā)明內(nèi)容、特點及功效，茲例舉以下實施例，并配合附圖詳細說明如下。

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應用原理作詳細的描述。

請參閱圖1至圖3：

本發(fā)明實施例在單因素實驗的前提下，以中心組合實驗的設計原理，以料液比A、乙醇濃度B、超聲時間C為秦嶺龍膽總黃酮提取工藝的影響因素，以總黃酮提取率為響應值，使用Design-Expert 8.0.6Trial軟件進行分析。該響應曲面設計的實驗條件和實驗結(jié)果見表1。

表1 Box-Behnken設計方案及試驗結(jié)果

根據(jù)響應曲面法Box-Benhnken對秦嶺龍膽總黃酮的提取工藝進行優(yōu)化，結(jié)果共設計出17組試驗點進行試驗。實驗結(jié)果使用Design-Expert 8.0.6Trial軟件進行數(shù)據(jù)分析，得到多元二次回歸模型方程式：

Y＝-0.69675+6.10000E－003A+0.022025B+8.32500E-003C+7.50000E－005AB+7.50000E-005AC－5.00000E-005BC－1.70000E-004A²－1.95000E-004B²－1.45000E-004C²

其中：Y為秦嶺龍膽總黃酮提取率，A、B、C為3因素的編碼值。

回歸方差分析見表2，從回歸方程方差分析表中可看出，P模型﹤0.0001，F(xiàn)模型＝26.25﹥0.05，表明了本實施例選用的二次回歸方程模型非常顯著。秦嶺龍膽總黃酮提取率F失擬＝0.83﹥0.05，P失擬＝0.5413﹥0.05，表明失擬項不顯著。從以上分析可以看出，該模型可以表示出響應值和自變量之間的關系。表中調(diào)整確定系數(shù)R²_Adj＝0.9342，說明93.42％的響應值的變化可用此模型解釋。此外，從表1中可以明顯看出，料液比、乙醇濃度對秦嶺龍膽總黃酮的提取率產(chǎn)生顯著的影響，提取時間的影響不太顯著。AB、AC、BC交互項影響顯著，說明料液比和乙醇濃度、料液比和超聲時間及乙醇濃度和超聲時間之間具有影響。二次項都比較明顯。由此可以發(fā)現(xiàn)提取率和各因素不是單純的線性關系。由P值的大小可以得出各因素對于秦嶺龍膽總黃酮提取率影響的排序為：A(料液比)>B(乙醇濃度)>C(超聲時間)。

表2回歸方程方差分析表

注：P值＜0.001為極顯著，P值＜0.05為顯著

使用Design-Expert 8.0.6Trial軟件繪制而成的響應曲面圖如圖1-圖3所示，從這些響應曲面圖上可以看到3因素的最佳參數(shù)和各因素之間的交互作用。

圖1可以確定料液比和乙醇濃度兩因素對秦嶺龍膽總黃酮提取率的交互作用。料液比最佳范圍為1：35～1:45，乙醇濃度最佳范圍為55％～65％。

圖2可以反應出料液比和提取時間兩個因素對秦嶺龍膽總黃酮提取率的影響，從圖中可以看出最佳料液比范圍為1：35～1:45，最佳提取時間范圍為25～35min。

圖3可以確定乙醇濃度和提取時間這兩因素對秦嶺龍膽總黃酮提取率的交互作用，圖中可顯著看出乙醇濃度的最佳范圍為55％～65％，最佳提取時間范圍為25～35min。

根據(jù)Design-Expert 8.0.6Trial軟件對模型方程計算整理?？梢缘贸銮貛X龍膽總黃酮的最佳提取工藝為：超聲時間為29.28分鐘，料液比為37.36，乙醇濃度為60.80％。在此工藝條件下秦嶺龍膽草總黃酮的提取率可以達到0.194982。為了實際操作生產(chǎn)中更為方便快捷，所以將模型所給最佳工藝參數(shù)修正為：提取時間為30min，料液比為1:40，乙醇濃度為60％。在此工藝條件下平行實驗3次，平均提取率為0.193％，相比模型的提取率只降低了約0.1％左右。

本發(fā)明以秦嶺龍膽總黃酮的提取率為指標，來優(yōu)化秦嶺龍膽總黃酮提取工藝，通過對提取時間、料液比、乙醇濃度三因素的多元回歸和二項擬合建立回歸方程，得到秦嶺龍膽總黃酮提取率為響應面值的響應曲面圖，再通過對試驗結(jié)果的分析，確定了秦嶺龍膽總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)，因為此方法擬合度較高，能夠為實際生產(chǎn)提供可靠地參考。

以上所述僅是對本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術實質(zhì)對以上實施例所做的任何簡單修改，等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術方案的范圍內(nèi)。