本發(fā)明涉及基因載體領(lǐng)域，具體地，涉及一種靶向缺血心肌的納米化microRNA精準(zhǔn)診療系統(tǒng)及其制造方法。

背景技術(shù)：

近年來，心血管疾病已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一。盡管基因治療已經(jīng)取得了令人滿意的效果，但是安全有效的傳遞載體仍然是瓶頸所在。常用的心肌轉(zhuǎn)運(yùn)載體可分為病毒載體和非病毒載體。由于具有較高的轉(zhuǎn)染效率，病毒載體的應(yīng)用仍然具有絕對優(yōu)勢。但是，由于病毒載體引起的機(jī)體免疫反應(yīng)較強(qiáng)，使其臨床應(yīng)用受到制約。作為病毒載體的有效補(bǔ)充，近年來非病毒載體的研究日益深入。

非病毒載體具備無傳染性，沒有載體容量限制，材料來源廣泛，化學(xué)結(jié)構(gòu)可控制，且易于大量制備，可負(fù)載基因，如：反義寡核苷酸，有著病毒載體不可替代的作用。

但是，目前的非病毒載體往往存在轉(zhuǎn)染效率低，目的基因多數(shù)只能實(shí)現(xiàn)瞬間表達(dá)，其運(yùn)送系統(tǒng)的顆粒較大，容易引發(fā)免疫反應(yīng)和被機(jī)體所清除。

針對該缺陷，在現(xiàn)有的對非病毒載體的基礎(chǔ)研究中，體外轉(zhuǎn)染最常用的載體(媒介)包括陽離子脂質(zhì)體和陽離子聚合物，如：Lipo2000、聚乙烯亞胺PEI25000、PEI18000等，此類產(chǎn)品均是目前公認(rèn)的對多種細(xì)胞具有較高轉(zhuǎn)染效率的商品化轉(zhuǎn)染試劑之一，所以常被用來作為評價(jià)其他siRNA遞送載體有效性的標(biāo)準(zhǔn)。

然而，研究表明，長期使用Lipofectamine 2000^TM系列產(chǎn)品遞送siRNA會增加細(xì)胞的自噬水平，誘發(fā)體內(nèi)炎癥。此外脂質(zhì)體的血漿穩(wěn)定性差，在血液中粒徑、表面電位及脂質(zhì)成分都有改變的趨勢。而PEI系列產(chǎn)品的生物毒性明顯。這些都限制了脂質(zhì)體和PEI在臨床上的應(yīng)用。

因而，目前急需一種轉(zhuǎn)染效果佳，穩(wěn)定性佳，且無毒性或毒性較低的載體。

此外，目前針對心血管疾病的治療產(chǎn)品中，用于負(fù)載基因的載體，往往在治療時(shí)無靶向性，因此，不能解決病變部位富集的情況下的靶向治療的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在克服上述缺陷，提供一種新型的對基因具有保護(hù)作用、轉(zhuǎn)染效果佳、毒性極低、通過在載體上還連接有具有缺血心肌靶向性的多肽AT1來實(shí)現(xiàn)靶向治療效果的納米基因材料。

本發(fā)明提供的納米基因材料，其特征在于：包括具有靶向性的納米基因載體；上述納米基因載體由氨基酸聚合物、修飾性聚乙二醇、血管緊張素Ⅱ的功能序列多肽制備而成；

其中，上述氨基酸聚合物和血管緊張素Ⅱ的功能序列多肽分別與修飾性聚乙二醇兩端的修飾基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)后獲得具有靶向性的納米基因載體。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的納米基因材料，還具有這樣的特點(diǎn)：上述氨基酸聚合物為由賴氨酸、絲氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺中的一種或多種氨基酸形成的聚合物或共聚物中的一種或多種。

優(yōu)選自由賴氨酸制備的聚合物，或包含有質(zhì)量百分比含量為45-80％的賴氨酸的共聚物。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的納米基因材料，還具有這樣的特點(diǎn)：上述修飾性聚乙二醇的結(jié)構(gòu)如下所示：

其中，m為80-500的整數(shù)；

R₁為酰胺基、烯烴基、環(huán)烯烴基、帶有雙鍵的雜環(huán)基；

上述酰胺基的結(jié)構(gòu)式如下所示：

即、修飾性聚乙二醇的結(jié)構(gòu)如下所示：

R₃為烯烴基、環(huán)烯烴基、帶有雙鍵的雜環(huán)基；

上述烯烴基的結(jié)構(gòu)式如下所示：

即、修飾性聚乙二醇的結(jié)構(gòu)如下所示：

n1和n2為0到20的整數(shù)；當(dāng)鏈長越長時(shí)，該材料的表面活性越好。

上述環(huán)烯烴基的結(jié)構(gòu)式如下所示：

上述帶有雙鍵的雜環(huán)基的結(jié)構(gòu)式如下所示：

R₂為酯基；

上述酯基的結(jié)構(gòu)式如下所示：

R₄為烷基、芳基、雜環(huán)基；

上述雜環(huán)基的結(jié)構(gòu)式如下所示：

R_x1-20選自氫、烷基、烷氧基、氨基或C-R_x1-20為羰基；

R_x1-20優(yōu)選氫、甲基、乙基、甲氧基、氨基及C-R_x1-20為羰基；

Y為氮、氧、硫；

n為0-20的整數(shù)，當(dāng)鏈長越長時(shí)，該材料的表面活性越好。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的納米基因材料，還具有這樣的特點(diǎn)：上述氨基酸聚合物的聚合度為50-500；優(yōu)選為80-160；

上述氨基酸聚合物的的分子量為10000-100000；優(yōu)選為15000以上；

上述修飾性聚乙二醇的分子量為1000-10000；優(yōu)選為1500以上。

此外，本發(fā)明還提供了上述納米基因材料的制備方法，其特征在于：

步驟一、配置反應(yīng)物：

將氨基酸聚合物溶解于溶劑中配置成溶液A；

將修飾性聚乙二醇溶解于溶劑中配置成溶液B；

將血管緊張素Ⅱ的功能序列多肽溶解于溶劑中配置成溶液C；

步驟二、將溶液B滴加入溶液A中，于10-50℃的溫度下，反應(yīng)1-5小時(shí)；

步驟三、在保護(hù)氣保護(hù)的條件下，加入溶液C，于10-50℃的溫度下，反應(yīng)8-24小時(shí)；

步驟四、將獲得的溶液透析24-96小時(shí)后，冷凍干燥。

如權(quán)利要求5上述的一種納米基因材料的制備方法，其特征在于：

上述溶劑選自pH為7-8的磷酸緩沖鹽溶液、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、四氫呋喃、醇、醚、酯中的一種或幾種；

上述聚賴氨酸、修飾性的聚乙二醇與血管緊張素Ⅱ的功能序列多肽的摩爾比為1:2-100：1-100；

優(yōu)選地，上述聚賴氨酸、修飾性的聚乙二醇與血管緊張素Ⅱ的功能序列多肽的摩爾比為1:2-10：2-8。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的上述納米基因材料的制備方法，還具有這樣的特點(diǎn)：即、在步驟三和四之間，還設(shè)有中和步驟；

上述中和步驟為：于步驟三的溶液中加入半胱胺等中和用試劑，于10-50℃的溫度下，反應(yīng)1-5小時(shí)；

上述半胱胺的制備方法為：將半胱胺鹽酸鹽溶解于二次水中，加入有機(jī)堿震蕩混合5-20分鐘，冷卻后，采用有機(jī)溶劑萃取后，蒸除溶劑后獲得半胱胺；

上述修飾性聚乙二醇與半胱胺鹽酸鹽的摩爾比為1：50-150；優(yōu)選為1：:80-100；

上述有機(jī)堿與半胱胺鹽酸鹽的摩爾比為1:0.1-10；優(yōu)選為1:1-1.5。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的納米基因材料，還具有這樣的特點(diǎn)：即、上述具有靶向性的納米基因載體在靜電作用下負(fù)載基因；

上述基因可以選自反義寡核苷酸、反義表達(dá)質(zhì)粒、表達(dá)質(zhì)粒等基因；

上述負(fù)載的過程為：將具有靶向性的納米基因載體加入基因中，吹打均勻后于30-40℃的條件下孵育0.5-2小時(shí)；

上述具有靶向性的納米基因載體與基因的質(zhì)量比為1:0.01-15；

上述具有靶向性的納米基因載體與基因的質(zhì)量比優(yōu)選為1:1-10。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的納米基因材料，還具有這樣的特點(diǎn)：即、上述聚氨基酸為聚合度為95-135的樹枝狀聚賴氨酸；

上述修飾性聚乙二醇的分子量為1500-2500，其兩端的修飾基團(tuán)分別為NHS和MAL。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的納米基因材料，還具有這樣的特點(diǎn)：

上述基因?yàn)橛糜谛募∪毖委煹幕颍?/p>

上述基因?yàn)閙iRNA-1的反義寡核苷酸。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的納米基因材料，還具有這樣的特點(diǎn)：上述具有靶向性的納米基因載體在靜電作用下負(fù)載miRNA-1的反義寡核苷酸；

上述負(fù)載的過程為：將具有靶向性的納米基因載體加入miRNA-1的反義寡核苷中，吹打均勻后于30-40℃的條件下孵育0.5-2小時(shí)。

該具有靶向性的納米基因載體與基因的質(zhì)量比為0.01-15:1；優(yōu)選為0.1-10：1；最優(yōu)選為0.5-8：1。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的納米基因材料，還具有這樣的特點(diǎn)：上述納米基因材料為具有缺血心肌靶向性的納米基因載體。

該納米基因材料還可以為未連接有血管緊張素Ⅱ的功能序列多肽的納米基因載體，即、DGL-PEG/AMO-1，其制備方法和原料比例，同于DGL-PEG-AT1/AMO-1。

本發(fā)明的作用和效果:

在本發(fā)明中，提供了一種新型的納米基因載體，該載體具有缺血心肌靶向性的作用，且毒副作用小。

如圖1所示，在本發(fā)明中，氨基酸聚合物和血管緊張素Ⅱ的功能序列多肽分別與修飾性聚乙二醇兩端的修飾基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)后獲得具有靶向性的納米基因載體，其后，通過將該納米基因載體與反義寡核苷酸、反義表達(dá)質(zhì)粒、表達(dá)質(zhì)粒等負(fù)載獲得具有靶向功能的納米基因載體。

具體地，氨基酸作為生物體內(nèi)構(gòu)成蛋白質(zhì)分子的基本單位，與生物的生命活動(dòng)有著密切的關(guān)系。它在基體內(nèi)具有特殊的生理功能，是生物體內(nèi)不可缺少的營養(yǎng)成分之一。而在在本發(fā)明中選用的聚氨基酸，基于氨基酸的基本特性，當(dāng)應(yīng)用于載體后，仍能具有良好的生物相容性等效果，帶有電荷的聚氨基酸在本發(fā)明中為優(yōu)選方案，由于自身帶有的電荷效果，可與其他帶有反向電荷的物質(zhì)發(fā)生分子間的靜電作用力，從而實(shí)現(xiàn)類似于自組裝的效果。

另外，在本發(fā)明中，聚氨基酸選用的最優(yōu)選案例中的DGL(樹枝狀聚賴氨酸)，是一種陽離子聚合物，是由賴氨酸(人體必需氨基酸)聚合而成的，其具有良好生物相容性的同時(shí)、其生物可降解性和壓縮DNA的能力極佳，其表面有大量的氨基，可被修飾，且?guī)в姓?，?dāng)其被其他基團(tuán)修飾后，由于自身帶有的正電荷，可與其他帶有負(fù)電荷的物質(zhì)發(fā)生分子間的靜電作用力，從而實(shí)現(xiàn)負(fù)載因子或反義寡核苷酸的效果。

此外，本發(fā)明中選用聚乙二醇作為反應(yīng)組分之一，由于其本身為一種優(yōu)良的表面活性劑，當(dāng)其與聚氨基酸上的基團(tuán)發(fā)生取代等反應(yīng)后，能實(shí)現(xiàn)在聚氨基酸的表面形成一層水化層的效果，從而能減小聚氨基酸的毒性，降低其在體內(nèi)被巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬的可能性。

另外，在本發(fā)明中，選用的PEG為兩端均設(shè)有修飾基團(tuán)的PEG，從而使其通過該基團(tuán)上的活性基與聚氨基酸等物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)各組分之間的聯(lián)合的同時(shí)，提高產(chǎn)品的表面張力和兼容性。

另外，在本發(fā)明的最優(yōu)選方案中，將其兩端分別連接NHS和MAL基團(tuán)，該NHS基團(tuán)可與聚氨基酸表面的氨基發(fā)生取代等反應(yīng)，將DGL和PEG連接起來；而MAL基團(tuán)可與多肽AT1(血管緊張素Ⅱ的功能序列多肽)上的巰基-HS發(fā)生加成反應(yīng)，從而將多肽AT1與PEG連接起來，進(jìn)而構(gòu)建起DGL和AT1的連接關(guān)系。

此外，在本發(fā)明中使用的AT1，其為：當(dāng)心肌梗死(心肌細(xì)胞缺血缺氧)時(shí)，細(xì)胞表面的血管緊張素Ⅱ受體-1(AT1R)升高。所以在體外化學(xué)合成AT1R的配體中的一段功能序列(稱AT1)連接在納米材料表面，可靶向結(jié)合缺血心肌的AT1R，從而對缺血心肌具有一定的靶向作用。

在本發(fā)明中，體外合成的AT1多肽，其氨基酸序列如下所示：

Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe；

AT1R的配體的功能序列如下所示：

Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe；

其中間的Gly-Gly-Gly-Gly為間隔序列，Cys是中含有巰基-HS，是化學(xué)連接的功能基團(tuán)。

此外，在本發(fā)明中，使用AMO-1(miRNA-1的反義寡核苷酸)作為負(fù)電荷的供電體，與上述合成基材通過靜電實(shí)現(xiàn)組裝的結(jié)果。

miRNA-1在心肌梗死或者細(xì)胞缺血缺氧時(shí)升高，可促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡，是心肌細(xì)胞的損害因子。而AMO-1是指miRNA-1的反義寡核苷酸，是化學(xué)合成的與miRNA互補(bǔ)的單鏈RNA。其在細(xì)胞質(zhì)中可與成熟的miRNA-1發(fā)生互補(bǔ)配對，使得miRNA-1的損害作用減弱，上述各化合物的序列如下所示：

miRNA-1序列：5’-UGGAAUGUAAAGAAGUGUGUAU-3’

AMO-1序列：5’-AUACACACUUCUUUACAUUCCA-3’

在優(yōu)選方案中，AMO-1帶負(fù)電，可以與帶正電DGL-PEG或DGL-PEG-AT1通過靜電作用形成納米顆粒。

附圖說明

附圖1、納米材料形成和材料結(jié)構(gòu)的示意圖；

附圖2、納米材料核磁圖譜；

附圖3、納米材料負(fù)載AM0-1后的粒徑和電位圖；

附圖4、納米材料負(fù)載AM0-1后的透射電鏡圖；

附圖5、納米材料負(fù)載AMO-1凝膠電泳圖

附圖6(a)、納米材料對H9C2細(xì)胞毒性4小時(shí)對比圖；

附圖6(b)、納米材料對H9C2細(xì)胞毒性8小時(shí)對比圖；

附圖7(a1)、激光共聚焦觀察4小時(shí)對比圖；

附圖7(a2)、流式細(xì)胞檢測4小時(shí)對比圖；

附圖7(b1)、激光共聚焦觀察8小時(shí)對比圖；

附圖7(b2)、流式細(xì)胞檢測8小時(shí)對比圖；

附圖8、活死染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果對比圖；

附圖9、原代心肌細(xì)胞免疫熒光染色對比圖；

附圖10、原代心肌細(xì)胞水平治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果，各處理組miRNA-1量的對比圖；

其中，對照組：正常細(xì)胞(normal組)給予DEPC水、缺氧細(xì)胞(control組)給予DEPC水、缺氧細(xì)胞(NC組)給予DGL-PEG-AT1/AMO-1-NC；實(shí)驗(yàn)組：缺氧細(xì)胞(PEI組)給予PEI/AMO-1、缺氧細(xì)胞(DGL-PEG組)給予DGL-PEG/AMO-1、缺氧細(xì)胞(DGL-PEG-AT1組)給予DGL-PEG-AT1/AMO-1；

附圖11、DGL-PEG-AT1細(xì)胞水平靶向性驗(yàn)證圖(紅色：BODIPY，藍(lán)色：DAPI)；

附圖12、DGL-PEG-AT1動(dòng)物水平靶向性圖(A,動(dòng)物水平；B,離體臟器)；

附圖13、DGL-PEG-AT1/AMO-1對小鼠心肌梗死組織中miR-1的下調(diào)作用圖。

具體實(shí)施方式

1、原料和設(shè)備的準(zhǔn)備

1)原料：

樹枝狀聚賴氨酸(Dendrigraftpoly-L-lysines，DGL)；

端馬來酰亞胺端N-羥基琥珀酰亞胺聚乙二醇(α-Malemidyl-ω-N-hydroxysuccinimidyl polyethylene glycol，NHS-PEG₂₀₀₀-MAL)；

AT1(靶向多肽序列：

Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)；

半胱胺鹽酸鹽；二氯甲烷，三乙胺。

2)設(shè)備：

定容瓶(1000mL，2000mL)，燒杯(500mL，2L,5L)，2個(gè)燒瓶(25mL)，磁子，磁力攪拌器(可顯示溫度和轉(zhuǎn)速)，1個(gè)瓶塞，1個(gè)橡皮蓋，2個(gè)針頭(長短)，2條橡皮管，MWCO:8000-14000透析袋。

2、試劑準(zhǔn)備(根據(jù)實(shí)際使用的需要還可配置其他濃度和pH的緩沖溶液)

1)配置1000mL 0.2M的PBS原液(pH＝7.4)

準(zhǔn)備：250mL量筒，500mL燒杯,1000mL的定容瓶，二次水，Na₂HPO₄-12H₂O,NaH₂PO₄-2H₂O具體步驟：

a)分別稱量Na₂HPO₄-12H₂O 58.01868g，NaH₂PO₄-2H₂O 5.92838g，混合放入500mL的燒杯中，加入500mL的二次水，充分?jǐn)嚢枞芙?。b)將燒杯中的溶液倒入1000mL的定容瓶中，加入二次水定容至1000mL。(可將二次水先加入燒杯中沖洗燒杯壁，再加入到定容瓶中，因?yàn)闊勘诳赡苡胁糠秩苜|(zhì)的殘留)

c)用精密pH試紙測pH，確認(rèn)pH值在7.4左右(7.2-7.4)

2)配置500mL的10mM的PBS緩沖液

a)取2.5mL原液，定容到50mL(稀釋20倍)---做反應(yīng)用

b)取100mL原液，定容到2000ml---透析用

(注：后面透析和反應(yīng)用的PBS濃度都是10mM)

實(shí)施例一、DGL-PEG的合成

a)稱量22mg(1μmol)的DGL(MW:25000)溶于5mL PBS緩沖液(10mM；pH＝7.4)(濃

度0.2μmol/mL)(稱量后將固體DGL置于10mLep管中)；

在本實(shí)施例中，還可使用其他分子量的DGL，如：MW＝10000、18000、20000、27000、30000、50000、80000或100000。

b)稱量100mg(50μmol)的NHS-PEG2000-MAL(MW：2000)溶于5mL的DMSO中；

在本實(shí)施例中，還可使用其他分子量的NHS-PEG2000-MAL，如：MW＝1000、1800、2100、2700、3000、4500、6500、8000或10000。

在本實(shí)施例中，針對反應(yīng)條件的科研過程中，還根據(jù)需取代基團(tuán)的不同，對于DGL與NHS-PEG2000-MAL的反應(yīng)比進(jìn)行調(diào)整，如：DGL與NHS-PEG2000-MAL的摩爾比為1:2、1:5、1:10、1:15、1:25、1:30、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:80、1:100不等。

在本實(shí)施例中，針對反應(yīng)條件的科研過程中，還根據(jù)反應(yīng)的需要，對反應(yīng)液的濃度進(jìn)行調(diào)整，如：濃度為1μmol/ml、10μmol/ml、50μmol/ml、100μmol/ml、120μmol/ml、150μmol/ml、210μmol/ml、650μmol/ml、1000μmol/ml、1200μmol/ml、1500μmol/ml不等。一般來說，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較多(多于20的取代)的情況下，采用100μmol/ml以上的濃度進(jìn)行反應(yīng)，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較少(少于20的取代)的情況下，采用100μmol/ml以下的濃度進(jìn)行反應(yīng)；

c)將b)緩慢滴加入a)中(500-1000轉(zhuǎn)/分的混合條件下)，55℃反應(yīng)3h；

在本實(shí)施例中，針對反應(yīng)條件的科研過程中，還根據(jù)需取代數(shù)量的不同，其反應(yīng)溫度可以調(diào)整為10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、40℃、45℃不等，其反應(yīng)時(shí)間為0.5小時(shí)、1小時(shí)、1.5小時(shí)、2小時(shí)、2.5小時(shí)不等。一般來說，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較多(多于20的取代)的情況下，反應(yīng)時(shí)間大于2小時(shí)，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較少(少于20的取代)的情況下，反應(yīng)時(shí)間小于2小時(shí)，進(jìn)行反應(yīng)；

d)稱量90.88mg(800μmol)半胱胺鹽酸鹽(MW:113.61)于20mL的ep管中，加入15mL

二次水，分兩次進(jìn)行超聲溶解；

在本實(shí)施例中，針對反應(yīng)條件的科研過程中，根據(jù)需取代基團(tuán)、取代數(shù)量的不同，對于NHS-PEG-MAL：半胱胺鹽酸鹽的反應(yīng)比可進(jìn)行調(diào)整，NHS-PEG-MAL：半胱胺鹽酸鹽的摩爾比為1:50、1:60、1:70、1:80、1:85、1:95、1:110、1:120、1:130、1:140、1:150不等。一般來說，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較多(多于20的取代)的情況下，摩爾比采用少于1:85的比例，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較少(少于20的取代)的情況下，摩爾比采用多于1:85的比例；

e)待完全溶解后，加入三乙胺(MW:101.19；密度：0.726g/mL)65.8μL，充分震蕩5min(用手搖晃即可，ep管會有些發(fā)熱)。

在本實(shí)施例中，針對反應(yīng)條件的科研過程中，半胱胺鹽酸鹽：三乙胺的摩爾比可以調(diào)整為1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.5、1:1.9、1:2、1:5、1:10。

f)待反應(yīng)完全后，加入10mL二氯甲烷，多次萃取，將獲得的萃取液減壓蒸除后獲得固體；

將得到的固體溶于5mLPBS(10mM，pH＝7.4)中，加入c的產(chǎn)物中,于55℃反應(yīng)3h。

在本實(shí)施例中，針對反應(yīng)條件的科研過程中，還根據(jù)需取代數(shù)量的不同，其反應(yīng)溫度可以調(diào)整為10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、40℃、45℃不等，其反應(yīng)時(shí)間為0.5小時(shí)、1小時(shí)、1.5小時(shí)、2小時(shí)、2.5、3小時(shí)、4小時(shí)、4.5小時(shí)、5小時(shí)不等。一般來說，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較多(多于20的取代)的情況下，反應(yīng)時(shí)間大于2小時(shí)，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較少(少于20的取代)的情況下，反應(yīng)時(shí)間小于2小時(shí)，進(jìn)行反應(yīng)；

g)將d)中最終的溶液加入MWCO＝8000-14000Da的透析袋中在一次水中透析48h。

在本實(shí)施例中，針對反應(yīng)條件的科研過程中，還根據(jù)反應(yīng)的需要，透析的時(shí)間可以為12小時(shí)、36小時(shí)、56小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)不等；

h)凍干。

實(shí)施例二、DGL-PEG-AT1的合成

反應(yīng)方程式如下所示：

a)稱量22mg(1μmol)的DGL(MW:25000)溶于5mL PBS緩沖液(10mM；pH＝7.4)(濃

度0.2μmol/mL)(稱量后將固體DGL置于10mLep管中)；

在本實(shí)施例中，還可使用其他分子量的DGL，如：MW＝10000、18000、20000、27000、30000、50000、80000或100000。

b)稱量100mg(50μmol)的NHS-PEG2000-MAL(MW：2000)溶于5mL的DMSO中；

在本實(shí)施例中，還可使用其他分子量的NHS-PEG2000-MAL，如：MW＝1000、1800、2100、2700、3000、4500、6500、8000或10000。

在本實(shí)施例中，針對反應(yīng)條件的科研過程中，還根據(jù)需取代基團(tuán)的不同，對于DGL與NHS-PEG2000-MAL的反應(yīng)比進(jìn)行調(diào)整，如：DGL與NHS-PEG2000-MAL的摩爾比為1:2、1:5、1:10、1:15、1:25、1:30、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:80、1:100不等。

在本實(shí)施例中，針對反應(yīng)條件的科研過程中，還根據(jù)反應(yīng)的需要，對反應(yīng)液的濃度進(jìn)行調(diào)整，如：濃度為1μmol/ml、10μmol/ml、50μmol/ml、100μmol/ml、120μmol/ml、150μmol/ml、210μmol/ml、650μmol/ml、1000μmol/ml、1200μmol/ml、1500μmol/ml不等。一般來說，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較多(多于20的取代)的情況下，采用100μmol/ml以上的濃度進(jìn)行反應(yīng)，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較少(少于20的取代)的情況下，采用100μmol/ml以下的濃度進(jìn)行反應(yīng)；

c)將b)緩慢滴加入a)中(500-1000轉(zhuǎn)/分的混合條件下)，55℃反應(yīng)3h；

在本實(shí)施例中，，針對反應(yīng)條件的科研過程中，還根據(jù)需取代數(shù)量的不同，其反應(yīng)溫度可以調(diào)整為10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、40℃、45℃不等，其反應(yīng)時(shí)間為0.5小時(shí)、1小時(shí)、1.5小時(shí)、2小時(shí)、2.5小時(shí)不等。一般來說，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較多(多于20的取代)的情況下，反應(yīng)時(shí)間大于2小時(shí)，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較少(少于20的取代)的情況下，反應(yīng)時(shí)間小于2小時(shí)，進(jìn)行反應(yīng)；

d)稱量35.88mg(25μmol)AT₁(MW:1377.55，純度96％)溶于500μL DMSO中；

在本實(shí)施例中，針對反應(yīng)條件的科研過程中，還根據(jù)需取代基團(tuán)的不同，對于DGL與AT1的反應(yīng)比進(jìn)行調(diào)整，如：DGL與AT1的摩爾比為1:1、1:5、1:10、1:15、1:25、1:30、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:80、1:100不等。

在本實(shí)施例中，針對反應(yīng)條件的科研過程中，還根據(jù)反應(yīng)的需要，對反應(yīng)液的濃度進(jìn)行調(diào)整，如：濃度為1μmol/ml、10μmol/ml、50μmol/ml、100μmol/ml、120μmol/ml、150μmol/ml、210μmol/ml、650μmol/ml、1000μmol/ml、1200μmol/ml、1500μmol/ml不等。一般來說，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較多(多于20的取代)的情況下，采用100μmol/ml以上的濃度進(jìn)行反應(yīng)，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較少(少于20的取代)的情況下，采用100μmol/ml以下的濃度進(jìn)行反應(yīng)；

e)將d)加入c)中，氮?dú)?或氦氣、氬氣等)保護(hù)，室溫反應(yīng)20h。

在本實(shí)施例中，針對反應(yīng)條件的科研過程中，還根據(jù)反應(yīng)的需要對其反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行調(diào)整，其反應(yīng)時(shí)間還可以為8小時(shí)、10小時(shí)、15小時(shí)、20小時(shí)、24小時(shí)不等。一般來說，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較多(多于20的取代)的情況下，反應(yīng)時(shí)間大于15小時(shí)，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較少(少于20的取代)的情況下，反應(yīng)時(shí)間小于15小時(shí)，進(jìn)行反應(yīng)；

f)稱量90.88mg(800μmol)半胱胺鹽酸鹽(MW:113.61)于20mL的ep管中，加入15mL

二次水，分兩次進(jìn)行超聲溶解；

在本實(shí)施例中，針對反應(yīng)條件的科研過程中，根據(jù)需取代基團(tuán)、取代數(shù)量的不同，對于NHS-PEG-MAL：半胱胺鹽酸鹽的反應(yīng)比可進(jìn)行調(diào)整，NHS-PEG-MAL：半胱胺鹽酸鹽的摩爾比為1:50、1:60、1:70、1:80、1:85、1:95、1:110、1:120、1:130、1:140、1:150不等。一般來說，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較多(多于20的取代)的情況下，摩爾比采用少于1:85的比例，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較少(少于20的取代)的情況下，摩爾比采用多于1:85的比例；

g)待完全溶解后，加入三乙胺(MW:101.19；密度：0.726g/mL)65.8μL，充分震蕩5min

(用手搖晃即可，ep管會有些發(fā)熱)。

在本實(shí)施例中，針對反應(yīng)條件的科研過程中，半胱胺鹽酸鹽：三乙胺的摩爾比可以調(diào)整為1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.5、1:1.9、1:2、1:5、1:10。

h)待反應(yīng)完全后，加入10mL二氯甲烷，多次萃取，將獲得的萃取液減壓蒸除后獲得固體；

將得到的固體溶于5mLPBS(10mM，pH＝7.4)中，加入e的產(chǎn)物中,于55℃反應(yīng)3h。

在本實(shí)施例中，，針對反應(yīng)條件的科研過程中，還根據(jù)需取代數(shù)量的不同，其反應(yīng)溫度可以調(diào)整為10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、40℃、45℃不等，其反應(yīng)時(shí)間為0.5小時(shí)、1小時(shí)、1.5小時(shí)、2小時(shí)、2.5、3小時(shí)、4小時(shí)、4.5小時(shí)、5小時(shí)不等。一般來說，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較多(多于20的取代)的情況下，反應(yīng)時(shí)間大于2小時(shí)，當(dāng)取代反應(yīng)發(fā)生的反應(yīng)位較少(少于20的取代)的情況下，反應(yīng)時(shí)間小于2小時(shí)，進(jìn)行反應(yīng)；

i)將f)中最終的溶液加入MWCO＝8000-14000Da的透析袋中在PBS中透析48h，再在一次

水中透析48小時(shí)。

在本實(shí)施例中，針對反應(yīng)條件的科研過程中，還根據(jù)反應(yīng)的需要，兩次透析的時(shí)間可以為12小時(shí)、36小時(shí)、56小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、120小時(shí)不等；

f)凍干

注：一次水中透析后，會產(chǎn)生少許沉淀，離心后取上清，凍干，沉淀?xiàng)壍簟?/p>

實(shí)施例三、負(fù)載反義寡核苷酸

在本實(shí)施例中，選用AMO-1，納米材料(NHS-PEG或NHS-PEG-MAL)和AMO-1按照質(zhì)量比(20:1)負(fù)載。將納米材料和AMO-1溶于DEPC水，在200μL的ep管中先加入AMO-1,再加入材料，吹打混勻，渦旋30s后置于47℃溫箱中孵育1小時(shí)。(原理：靜電作用；DGL帶正電，AMO-1帶負(fù)電)

(注1：miRNA-1在心肌細(xì)胞缺氧時(shí)升高，對促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡，是心肌細(xì)胞的損害因子。AMO-1是指miRNA-1的反義寡核苷酸，是化學(xué)合成的與miRNA互補(bǔ)的單鏈RNA。其在細(xì)胞質(zhì)中可與成熟的miRNA-1發(fā)生互補(bǔ)配對，使得miRNA-1的損害作用減弱。)

(注2:miRNA-1序列：5’-UGGAAUGUAAAGAAGUGUGUAU-3’

AMO-1序列：5’-AUACACACUUCUUUACAUUCCA-3’)

在本實(shí)施例中，針對反應(yīng)條件的科研過程中，根據(jù)需求的不同，對于納米材料：AMO-1的反應(yīng)比可進(jìn)行調(diào)整，AMO-1：納米材料的質(zhì)量比為1:1、1:5、1:8、1:10、1:15、1:25、1：30、1:40、1:50、1:60、1:65、1:70、1:80、1:90、1:100不等。

實(shí)施例四、理化分析和表征

本表征的產(chǎn)品為采用實(shí)施例一的方法和實(shí)施例二的方法獲得的載體。

其中，DGL-PEG為選用聚賴氨酸、修飾性的聚乙二醇的摩爾比為1:5的產(chǎn)物；

DGL-PEG-AT1為選用聚賴氨酸、修飾性的聚乙二醇與血管緊張素Ⅱ的功能序列多肽的摩爾比為1:5：2.5的產(chǎn)物；

(1)¹HNMR檢測圖譜

如圖2所示,a(δ＝1-1.8ppm)為賴氨酸上的3個(gè)CH₂上的H，是DGL的特征峰。b(δ＝3.6ppm)為PEG的重復(fù)序列O-CH₂-CH₂-O，d為(δ＝6.8ppm)為MAL上的H，e(δ＝2.6ppm)為NHS上的H，均為MAL-PEG-NHS的特征峰。C為AT1苯環(huán)上的H，是AT1的特征峰。DGL-PEG中a，b峰存在，說明PEG和DGL連接，e峰消失，說明NHS發(fā)生反應(yīng)；d峰消失，說明半胱胺鹽酸鹽與MAL發(fā)生反應(yīng)。DGL-PEG-AT1中出現(xiàn)了c峰，說明AT1成功連接在DGL-PEG-MAL上。由此推斷，DGL,NHS-PEG-MAL,AT1成功連接在一起。

(2)粒徑和電位

將合成的DGL-PEG-AT1在DEPC水中負(fù)載AMO-1后(納米材料/AMO-1的質(zhì)量比為8:1)，如圖3所示，用粒度儀檢測其粒徑約150nm，電位約+3mv。

(3)電鏡

如圖4所示，電鏡結(jié)果顯示：DGL-PEG-AT1/AMO-1(質(zhì)量比為8:1)非水合粒徑為50nm。

(4)材料負(fù)載能力的測定

DGL-PEG-AT1/AMO-1分別以質(zhì)量比為0，0.5，1，2，4，6，8負(fù)載在一起。3％瓊脂糖凝膠電泳跑膠，用SYBRⅡ染色。(原理：裸的AMO-1帶負(fù)電，在凝膠電泳中可跑出，可被SYBRⅡ染色；當(dāng)DGL-PEG-AT1包裹AMO-1時(shí)，AMO-1表面負(fù)電減少，在電泳中跑出的減少，若是完全被包裹，AMO-1不能跑出加樣孔中。)

如圖5所示：裸的AMO-1跑出了加樣孔(白色條帶)，當(dāng)DGL-PEG-AT1/AMO-1質(zhì)量比為2:1時(shí)，出現(xiàn)了拖帶現(xiàn)象，說明AMO-1被材料包裹，但是還沒有完全包裹，當(dāng)DGL-PEG-AT1/AMO-1質(zhì)量比為8:1時(shí)，未看到AMO-1跑出加樣孔，加樣孔中也未見白色條帶，說明AMO-1被完全包裹。當(dāng)凝膠電泳跑15min時(shí)，可見裸AMO-1組的條帶基本消失(可能AMO-1已經(jīng)降解)，但2:1的孔仍可看到拖帶的白色條帶，說明材料對AMO-1有一定保護(hù)作用，可一定程度減少AMO-1的降解。

(5)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將枝化PEI(bPEI)，DGL，DGL-PEG,DGL-PEG-AT1分別配置成6個(gè)濃度：1mg/mL，500ug/mL，200ug/mL，100ug/mL，50ug/mL，20ug/mL，將其作用于H9C2細(xì)胞，4h或者8h后，用MTT法檢測其對細(xì)胞增值的影響(細(xì)胞毒性)。

如圖6(a)和6(b)所示：隨著材料濃度和作用時(shí)間的增加，細(xì)胞活性逐漸降低。bPEI的毒性明顯大于DGL，DGL-PEG-MAL,DGL-PEG-AT1。材料濃度小于100ug/mL時(shí)，DGL-PEG-MAL,DGL-PEG-AT1作用的細(xì)胞活性均大于80％(毒性較小)，材料濃度大于100ug/mL時(shí)，對細(xì)胞毒性明顯增加?？蛇x擇100ug/mL作為后續(xù)治療量。

(6)細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)

驗(yàn)證H9C2細(xì)胞對PEI(3.9ug/2mL),DGL-PEG(24ug/2mL),DGL-PEG-AT1(24ug/2mL)負(fù)載AMO-1-FAM(3ug/2mL)的吞噬效果。

如圖7(a1)、7(b1)、7(a2)和7(a2)所示：A1,B1中藍(lán)色為細(xì)胞核(DAPI染色)，綠色為AMO-1-FAM，位于細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞核位置。激光共聚焦顯示，作用8h時(shí)，PEI,DGL-PEG,DGL-PEG-AT1負(fù)載AMO-1-FAM組的H9C2細(xì)胞中，綠色熒光均比4h時(shí)明顯增強(qiáng)。

8h時(shí)DGL-PEG和DGL-PEG-AT1組的綠色熒光較PEI組強(qiáng)。流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示結(jié)果與之相符。

說明，H9C2細(xì)胞對DGL-PEG,DGL-PEG-AT1負(fù)載的AMO-1吞噬效果較PEI強(qiáng)，即DGL-PEG,DGL-PEG-AT1組較PEI組進(jìn)入細(xì)胞的AMO-1多。

(7)活死染色實(shí)驗(yàn)

如圖8所示：紅色為死細(xì)胞(Ethidium homodimer-1染色)，綠色為活細(xì)胞(Calcein AM染色)。(由于圖8中顯示，細(xì)胞8h時(shí)H9C2細(xì)胞對DGL-PEG,DGL-PEG-AT1負(fù)載的AMO-1吞噬效果較PEI強(qiáng)，再根據(jù)圖7的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PEI毒性大，推測，細(xì)胞對PEI負(fù)載的AMO-1吞噬作用弱可能是由于PEI毒性大，為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一假設(shè)，用和材料圖8中同樣的條件下，做活死染色。)結(jié)果顯示，PEI組與DGL-PEG,DGL-PEG-AT1相比，細(xì)胞稀疏，并且紅色熒光較綠色熒光多，據(jù)此推斷可能細(xì)胞對PEI負(fù)載的AMO-1吞噬作用弱的原因是PEI對細(xì)胞毒性大。

(8)心肌原代細(xì)胞免疫熒光染色

當(dāng)心肌梗死(心肌細(xì)胞缺血缺氧)時(shí)，細(xì)胞表面的血管緊張素Ⅱ受體(AT1R)升高。所以在體外化學(xué)合成AT1R的配體中的一段功能序列連接在納米材料表面，可靶向結(jié)合缺血心肌的AT1R，從而對缺血心肌具有一定的靶向作用。

為驗(yàn)證SD大鼠原代心肌細(xì)胞缺血缺氧時(shí)AT1R是否升高，將原代心肌細(xì)胞做缺氧處理后，進(jìn)行免疫熒光染色。

如圖9所示：紅色代表AT1R，位于細(xì)胞膜表面，藍(lán)色代表細(xì)胞核。缺氧細(xì)胞表面的紅色熒光明顯增加，由此可進(jìn)一步證實(shí)缺氧的SD大鼠原代心肌細(xì)胞的AT1R升高。

(9)原代心肌細(xì)胞水平治療實(shí)驗(yàn)

用PEI(3.9ug/2mL),DGL-PEG(24ug/2mL),DGL-PEG-AT1(24ug/2mL)負(fù)載AMO-1(3ug/2mL)與缺氧的SD大鼠原代心肌細(xì)胞(1％O₂,24h，低糖DMEM)共培養(yǎng)4h后，在正常條件下(21％O₂，低糖DMEM)培養(yǎng)24h，提取總RNA,用Real-time PCR檢測其miRNA-1的變化。

如圖10所示：*代表P﹤0.05，n＝3，如圖，缺氧細(xì)胞(control)組未治療時(shí)，miRNA-1較正常細(xì)胞(normal)組明顯升高；DGL-PEG,DGL-PEG-AT1組的miRNA-1較缺氧細(xì)胞(control)組明顯下降(達(dá)到了治療作用)，且DGL-PEG-AT1組較DGL-PEG組miRNA-1降低更明顯(可能由于AT1對缺氧細(xì)胞的靶向性作用，使得DGL-PEG-AT1負(fù)載AMO-1后，被心肌細(xì)胞攝取的更多，治療作用更明顯)。然而，PEI組不僅沒有下調(diào)miRNA-1，使細(xì)胞中miRNA-1較缺氧細(xì)胞(control)組增加(可能由于其細(xì)胞毒性作用引起)。

(10)DGL-PEG-AT1細(xì)胞水平靶向性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

如圖11所示，將用BODIPY標(biāo)記的DGL-PEG和DGL-PEG-AT1分別與SD乳鼠的原代心肌細(xì)胞在缺氧環(huán)境下(1％O₂,5％CO₂,and 95％N₂)孵育4h后，清洗，固定，DAPI染核，在激光共聚焦顯微鏡下觀察紅色熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，DGL-PEG-AT1組的紅色熒光明顯強(qiáng)于DGL-PEG組，提示DGL-PEG-AT1可與缺氧的心肌細(xì)胞膜升高的血管緊張素Ⅱ受體(AT1R)結(jié)合，具有心肌靶向性。

(11)DGL-PEG-AT1動(dòng)物水平靶向性實(shí)驗(yàn)

如圖12所示，建立C57BL/6小鼠的心肌梗死模型24h后，分別尾部靜脈注射PBS，BODIPY標(biāo)記DGL-PEG,BODIPY標(biāo)記DGL-PEG-AT1,作用1h時(shí)進(jìn)行活體成像。活體成像結(jié)束后，取小鼠的重要臟器進(jìn)行離體成像。(A)活體水平和(B)離體水平(從上到下：心臟，肝臟，脾臟，肺臟和腎臟)結(jié)果均顯示，與DGL-PEG組相比，DGL-PEG-AT1組心臟聚集的熒光強(qiáng)度更大。這表明DGL-PEG-AT1對缺血心臟具有靶向性。

(12)DGL-PEG-AT1/AMO-1對小鼠心肌梗死組織中miR-1的下調(diào)作用

如圖13所示，實(shí)驗(yàn)分組為：Control(正常小鼠)；MI(心肌梗死+PBS)；DGL-PEG/AMO-1(心肌梗死+DGL-PEG/AMO-1)；DGL-PEG-AT1/AMO-1(心肌梗死+DGL-PEG-AT1/AMO-1)，DGL-PEG-AT1/NC(心肌梗死+DGL-PEG-AT1/NC)。建立C57BL/6小鼠的心肌梗死模型24h后，尾部靜脈給藥。給藥24h后，取出心肌梗死及周圍1mm范圍內(nèi)的心肌組織，提取RNA,并熒光定量PCR定量miRNA-1。(已知，AMO-1可下調(diào)心肌中的miRNA-1)

結(jié)果顯示，與MI組和DGL-PEG/AMO-1組相比，DGL-PEG-AT1/AMO-1組的miRNA-1水平均明顯下降(P〈0.001；P〈0.01；n＝3)。分析可能是DGL-PEG-AT1/AMO-1對缺血心肌的靶向作用，使得AMO-1在缺血心肌中作用增強(qiáng)。

上述實(shí)施例的變形例：

在上述實(shí)施例中，以聚合度為123的聚賴氨酸DGL、聚乙二醇兩端修飾基為NHS和MAL為原料進(jìn)行了基因載體的制備。

在實(shí)際研發(fā)的過程中，還對上述兩種原料分別進(jìn)行了替換的實(shí)驗(yàn)，基于其合成的方法與實(shí)施例二至三中的方法雷同，此處不再做具體論述，具體實(shí)驗(yàn)組合如下表所示：

負(fù)載能力指納米基材與AMO-1的質(zhì)量比；

毒性評分為0-10分，以PEI為10分，DGL-PEG-AT1為1分；

細(xì)胞吞噬評分為0-10分，以PEI為1分，DGL-PEG-AT1為10分；

治療效果評分為0-10分，以PEI為1分，DGL-PEG-AT1為10分；

從上述實(shí)施例可以看出，該靶向納米基因載體可為心肌缺血或者心肌梗死患者的基因治療提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。該載體可負(fù)載AMO-1，也可負(fù)載用于心肌缺血治療的其它基因。