本發(fā)明涉及一種紫菜類菌孢素氨基酸及其制備方法，以及涉及其在防曬化妝品中的具體應(yīng)用，屬于天然物質(zhì)提取和營養(yǎng)學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

近年來，由于臭氧層破環(huán)現(xiàn)象嚴(yán)重，到達(dá)地球表面的紫外線日漸增加，過量的紫外線照射會(huì)加速皮膚的光老化，給人類皮膚健康造成嚴(yán)重威脅。而能夠到達(dá)地球表面的紫外線主要為中波段（280~320nm）和長波段（320~400nm）區(qū)域，因此，國內(nèi)外抵抗紫外線而研發(fā)的防曬類化妝品多針對于對抗中波段（UVB區(qū)）和長波段（UVA區(qū)）紫外線。研究發(fā)現(xiàn)，中波段紫外線透射能力強(qiáng)，作用效果快，可在短時(shí)間內(nèi)破壞皮膚細(xì)胞內(nèi)的核酸及蛋白，導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)紅腫、曬斑、炎癥等現(xiàn)象。因此，對中波段紫外線的防護(hù)已成為防曬產(chǎn)品開發(fā)的重點(diǎn)。然而，長波段（UVA區(qū)）雖然相對中波段作用效果緩慢，但該波段紫外線能夠直接到達(dá)皮膚的真皮層，致使血管損傷及其周圍炎癥細(xì)胞的侵襲，導(dǎo)致皮膚色素沉積，經(jīng)長期積累，導(dǎo)致皮膚不可逆性衰老。

目前，市面上開發(fā)生產(chǎn)的防曬化妝品多存在作用效果單一、預(yù)防波段閾值較窄的特點(diǎn)，而針對于全波段的紫外防護(hù)產(chǎn)品又存在化學(xué)防護(hù)劑添加量超標(biāo)。所以，針對于不同波段紫外線對皮膚損傷的特點(diǎn)，研發(fā)針對于紫外全波段、天然植物中提取UV防護(hù)劑已成為研究的重點(diǎn)。

紫菜中提取得到類菌孢素氨基酸在紫外線吸收方面具有顯著功效，但是在化妝品中如何具體應(yīng)用未見報(bào)道。由于從海藻中提取的類菌孢素氨基酸各組分間分子結(jié)構(gòu)上存在的差異，其特征性波長吸光范圍也有所不同，目前未見對其主要成分的單獨(dú)研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種從紫菜中提取制備得到類菌孢素氨基酸作為天然紫外防護(hù)劑，并將其應(yīng)用于制備防曬化妝品中，進(jìn)行對長波段紫外線的防護(hù)研究，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明選取紫菜這一類菌孢素氨基酸（MAAs）含量較高的海藻為原料，提取并分離純化其中的MAAs化合物及各組分，并結(jié)合不同組分就其自身的吸光特性，比較其防曬作用效果，研究開發(fā)應(yīng)用于防曬化妝品的生產(chǎn)工藝中。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取的具體技術(shù)方案為：

一種紫菜類孢菌素氨基酸，包括shionorine和Porphyra-334，兩者的總體含量為93wt%以上，其中shionorine 55-60wt%，Porphyra-334 33-38wt%。

一種紫菜類菌孢素氨基酸是shionorine。

上述紫菜類菌孢素氨基酸的制備方法包括：紫菜烘干粉碎后過篩處理，加入乙醇液，輔助超聲破碎提??；提取完成后過濾除去濾渣，將得到的提取液減壓蒸餾濃縮處理得濃縮粗提液；再在濃縮粗提液中加入無水乙醇，醇沉除雜，離心去除沉淀后，減壓蒸餾濃縮，即得紫菜類孢菌素氨基酸。

進(jìn)一步的，上述加入乙醇液的濃度優(yōu)選為20%，上述醇沉除雜過程中乙醇液的終濃度為80%。

進(jìn)一步的，在上述乙醇提取過程中保持提取溫度為40-45℃。

進(jìn)一步的，上述制備方法還包括紫菜類菌孢素氨基酸的進(jìn)一步分離純化：將制得的紫菜類菌孢素氨基酸進(jìn)行高效液相色譜分離，根據(jù)色譜峰收集主要峰值附近的洗脫液，分離制得紫菜類菌孢素氨基酸化合物中的主要組分，經(jīng)鑒定為shionorine和Porphyra-334。

進(jìn)一步的，所述高效液相色譜中，液相色譜條件為：色譜儀：Agilent 1200 series高效液相色譜儀；色譜柱：Zorbax SB-C18柱（5 μm packing；250*4 mm I.D）；檢測器：紫外檢測器 330 nm；流動(dòng)相：A相：甲醇；B相：0.2%乙酸溶液，流速為1 mL/min；柱溫：25℃。

進(jìn)一步的，上述鑒定方法采用質(zhì)譜方法。

進(jìn)一步的，上述質(zhì)譜方法具體為：質(zhì)譜（ESI-TOF/MS）檢測條件：正離子電離模式；噴霧氣壓: 45p si；干燥氣：N₂；流速：10.0 L/min；破 碎 電 壓：100 V；全掃描（Scan）質(zhì)荷比（m/z）范圍為：200-800；在該條件下通過對比質(zhì)譜碎片峰及特征性斷裂方式，解析得到從紫菜中提取的類菌孢素氨基酸主要組分為shionorine和Porphyra-334。

上述紫菜類菌孢素氨基酸在抗紫外線方面的應(yīng)用。

上述紫菜類菌孢素氨基酸在制備防曬化妝品中的應(yīng)用。

上述shionorine在制備防曬化妝品中的應(yīng)用。

針對MAAs化合物、shinorine和Porphyra-334組分，在200-400nm波段處進(jìn)行紫外全波長掃描，經(jīng)掃描測試發(fā)現(xiàn)，紫菜類菌孢素氨基酸及shinorine和Porphyra-334組分在該波段內(nèi)具有較強(qiáng)的紫外吸收，并且shinorine的紫外吸收范圍和強(qiáng)度更好。另外，根據(jù)類菌孢素氨基酸的結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)本身存在多位酚羥基，這些多羥基結(jié)構(gòu)可作為H供體，有利于化合物本身發(fā)生氧化反應(yīng)，從而清除自由基；體外抗氧化實(shí)驗(yàn)證明，類菌孢素氨基酸能有效清除超氧陰離子自由基（·O₂^-），羥基自由基（·OH）和DPPH。而利用對自由基的清除作用，可有效抑制紫外線引起的活性氧簇（ROS）的聚集，從而針對基于p38MAPK和核轉(zhuǎn)錄因子kappaB（NF-κB）信號(hào)傳導(dǎo)通路在光老化發(fā)生機(jī)制中的發(fā)生作用。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

1.目前，市售防曬產(chǎn)品一般多采用化學(xué)合成型防曬劑作為主要功效成分，這類產(chǎn)品往往存在著嚴(yán)重的安全性隱患，為達(dá)到相應(yīng)的防曬指數(shù)，往往添加的UV防曬劑量過高，易產(chǎn)生堵塞毛孔、皮膚過敏等炎癥性問題。而從紫菜中提取的類菌孢素氨基酸作為天然的紫外防護(hù)劑，不但防護(hù)劑本身無任何過敏性反應(yīng)，同時(shí)因其本身具有較強(qiáng)的紫外吸收能力，能有效抵御中波段、長波段紫外線帶來的傷害。

2.化學(xué)合成型防曬產(chǎn)品由于防曬劑紫外吸收有效波長范圍較窄，為達(dá)到同時(shí)防御UVA、UVB波段的紫外線，常常需添加多種復(fù)配化學(xué)防護(hù)劑，這很容易導(dǎo)致產(chǎn)品因化學(xué)添加劑量過高導(dǎo)致產(chǎn)品超出安全標(biāo)準(zhǔn)值。而類菌孢素氨基酸本身的紫外吸收范圍廣，能同時(shí)有效抵御UVA、UVB波段紫外線帶來的損傷，非常適合作為天然全波段紫外防護(hù)劑使用。

3.紫菜類菌孢素氨基酸屬于天然多酚類小分子物質(zhì)，自身具有抗氧化防御功能，有效清除超氧陰離子自由基（·O₂^-），羥基自由基（·OH）和DPPH；其也能夠有效清除因紫外線輻射而引起的皮膚機(jī)體內(nèi)活性氧簇，抑制自由基的生成。即從源頭上起到天然抗皮膚老化的功效。尤其是shionorine，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，其抗紫外線效果明顯優(yōu)于Porphyra-334，吸收波段更為廣泛，其在防曬化妝品中有良好的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為shinorine化學(xué)式結(jié)構(gòu)圖。

圖2為Porphyra-334化學(xué)式結(jié)構(gòu)圖。

圖3為紫菜類菌孢素氨基酸及其組分的紫外吸收波長掃描圖。

圖4為實(shí)施例3中小鼠皮膚紫外損傷防護(hù)效果圖。

圖5為實(shí)施例3中小鼠皮膚紫外損傷的病理切片圖。

圖6為實(shí)施例3中小鼠皮膚紫外損傷的電鏡掃描圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1:

紫菜類菌孢素氨基酸的提?。喝l斑紫菜烘箱烘干后粉碎，粉碎后的紫菜粉經(jīng)20目過篩，在濃度為20%的乙醇液中45℃浸提2.5小時(shí)，其中料液比為 1∶40（g/ml），離心取上清液，過濾后收集浸提液，減壓蒸餾，將粗提液加入乙醇溶液，至乙醇濃度為80%，至-20℃冷凍醇沉穩(wěn)定24小時(shí)，除去蛋白及核酸雜質(zhì)，得到MAAs化合物。

實(shí)施例2：

紫菜中類菌孢素氨基酸各組分的分離制備：將得到的紫菜MAAs化合物經(jīng)超純水復(fù)溶，并將溶液過22μm的有機(jī)濾膜處理，得到的濾液應(yīng)用制備柱經(jīng)高效液相色譜分離并制備MAAs化合物中的主要組分。液相色譜條件為：色譜儀：Agilent 1200 series高效液相色譜儀；色譜柱：Zorbax SB-C18柱（5 μm packing；250*4 mm I.D）；檢測器：紫外檢測器 330 nm；流動(dòng)相：A相：甲醇；B相：0.2%乙酸溶液，流速為1 mL/min；柱溫：25℃。在該條件下分離并收集MAAs化合物主要組分的吸收峰，分別收集了保留時(shí)間為6.159 min和6.773 min處兩個(gè)主要吸收峰，收集液蒸餾濃縮后冷凍干燥備用。

將分離得到的紫菜類菌孢素氨基酸組分進(jìn)行鑒定：其中質(zhì)譜（ESI-TOF/MS）檢測條件：正離子電離模式；噴霧氣壓: 45p si；干燥氣：N₂；流速：10.0 L/min；破 碎 電 壓：100 V；全掃描（Scan）質(zhì)荷比（m/z）范圍為：200-800。在該條件下通過對比質(zhì)譜碎片峰及特征性斷裂方式，解析得到從紫菜中提取的類菌孢素氨基酸主要組分為shionorine和Porphyra-334，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式分別見圖1、圖2；并對紫菜類菌孢素氨基酸、shionorine和Porphyra-334進(jìn)行紫外吸收波長掃描，結(jié)果見圖3，可以看出shionorine吸收波段更廣和吸收效果更強(qiáng)。

實(shí)施例3：

以下通過具體的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)說明本發(fā)明中紫菜類菌孢素氨基酸作為天然紫外防護(hù)劑功效成分對防護(hù)紫外線輻射的效果。

1.實(shí)驗(yàn)條件：三級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度：18-22攝氏度，濕度：空調(diào)調(diào)節(jié)。

2.實(shí)驗(yàn)對象：潔凈雄性ICR小鼠60只，體重18~22克，由北京動(dòng)物研究所提供。

3.藥材及儀器：紫菜類菌孢素氨基酸由本實(shí)驗(yàn)室制備，Na₂S，無水乙醇，紫外燈管UVA-340 40W，UVB-313 40W。

4.實(shí)驗(yàn)方法：將ICR小鼠隨機(jī)分為正常組(NC)、模型組(MC)、陽性對照組(MP)、MAAs化合物涂抹組（T-MAAs）、Porphyra-334涂抹組（T- Porphyra-334）、shinorine涂抹組（T-shinorine），每組10只實(shí)驗(yàn)小鼠。各組小鼠每隔一天用6%的Na₂S乙醇溶液（75%）進(jìn)行脫毛處理背部（2 cm *3cm）。其中，NC組小鼠只脫毛不做其他處理，T-MAAs、T- Porphyra-334、T-shinorine 組小鼠分別外涂10 mg/mL的MAAs、Porphyra-334、shinorine水溶液120μL，MP組外1 mg/mL維生素C水溶液120μL，MC組涂抹等量的去離子水。各組小鼠給藥20min后，置于紫外燈箱中照射，使用累加輻照法，從0.5 MED/天至4 MED/天，持續(xù)照射4周。每天拍照記錄小鼠背部皮膚輻照損傷情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，頸椎脫臼處死小鼠，取背部皮膚用4%的甲醛溶液固定，切片并進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察并拍照記錄各組小鼠損傷情況。另取各組小鼠皮膚于2.5%的戊二醛固定液中固定，掃面電鏡下觀察小鼠皮膚膠原纖維的損傷情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如圖4所示，與空白對照組相比，模型組(MC)小鼠裸露背部由早期輕度紅斑形成，逐漸發(fā)展為顏色加深、脫屑、增厚，嚴(yán)重者出現(xiàn)粗糙變硬，失去彈性和光澤；表明輻照造模成功。與模型組(MC)相比，外涂MAAs組大部分小鼠背側(cè)表皮僅有稍許皮膚增厚，略有脫屑，顏色加深。外涂Porphyra-334樣品組小鼠背部粗糙、褶皺顯現(xiàn)得到明顯緩解，外涂shinorine組小鼠皮膚表面紅斑、水泡現(xiàn)象得到明顯改善。

如圖5所示，從病理切片中可以看出，正常組(NC)小鼠表皮細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞分層清晰，細(xì)胞成分和數(shù)量適中，厚度正常，表皮與真皮分界清楚；真皮層可見波浪狀纖維組織，分布均勻，排列有序，疏密有致。與正常組(NC)相比，輻照模型組(MC)小鼠表皮層增厚并伴有角質(zhì)層變厚，分層不清；真皮層纖維組織發(fā)生變性、破壞，纖維排列紊亂，分布不均，真皮層纖維組織出現(xiàn)斷裂、破碎，甚至消失。說明造模成功。與模型組相比，外涂MAAs組、Porphyra-334組、shinorine組小鼠皮膚組織的受損程度得到明顯緩解。其中外涂Porphyra-334組小鼠表皮層稍有增厚，真皮層纖維組織少見斷裂、破碎，色素沉積現(xiàn)象明顯減輕；外涂shinorine組小鼠皮膚組織膠原纖維排布致密、有序，對皮膚組織中膠原及細(xì)胞的損傷程度明顯減輕。說明MAAs化合物及其組分外用能夠有效地改善紫外線造成的皮膚損傷。

如圖6所示，空白對照組小鼠其膠原纖維分布均勻，排列緊密，膠原直徑大小相等，可見膠原周期性橫紋；而經(jīng)紫外輻射模型組膠原纖維排列紊亂，分布不均勻，膠原纖維束邊緣分散 ；與輻射模型組相比，外涂MAAs組、Porphyra-334組、shinorine組小鼠膠原損傷現(xiàn)象得到明顯改善。其中，外涂shinorine組小鼠膠原纖維邊緣離散現(xiàn)象明顯減輕，膠原纖維分布狀況有所改善，膠原束排列較緊密， 作用效果較Porphyra-334組更為明顯。

實(shí)施例4

類孢菌素氨基酸防曬霜的制備

鑒于紫菜類菌孢素氨基酸良好的抗紫外線和防護(hù)效果，將其紫菜類菌孢素氨基酸化合物及單一組分作為天然的全波段紫外防護(hù)劑的功效成分，添加至防曬霜中，制備天然防曬化妝品。采用霜?jiǎng)┗瘖y品的常規(guī)基質(zhì)和工藝制備成防曬霜。其具體配方和制備工藝如下：

配方表：以質(zhì)量百分比計(jì)算（W/%）

制備工藝：首先將以上A相物料按質(zhì)量比例混合后，水浴加熱至80攝氏度，使油相物料充分溶解，再按配方表將B相物料按質(zhì)量比例混合后，蒸汽加熱至80攝氏度。在A相持續(xù)攪拌狀態(tài)下緩慢投入B相，直至霜?jiǎng)┏尚?。繼續(xù)80攝氏度保溫10min后，至室溫冷卻，冷卻至40~50攝氏度以下，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，按不同編號(hào)對比加入的紫外防護(hù)劑，投入C相物料并充分?jǐn)嚢?，投入D相物料調(diào)節(jié)防曬霜pH值至3.5~5，制成防曬霜。

防曬霜的性能測試

防曬系數(shù)的測定：按照配方表，配置5種防曬產(chǎn)品。其中1號(hào)產(chǎn)品為不添加UV-防護(hù)劑的空白霜?jiǎng)?號(hào)產(chǎn)品為添加紫菜類菌孢素氨基酸化合物作為UV-防護(hù)劑的防曬霜，3號(hào)產(chǎn)品為添加Porphyra-334標(biāo)準(zhǔn)品作為UV-防護(hù)劑的防曬霜。4號(hào)產(chǎn)品為添加shinorine標(biāo)準(zhǔn)品作為UV-防護(hù)劑的防曬霜，5號(hào)產(chǎn)品為添加甲氧基肉桂異辛酯作為UV-防護(hù)劑的防曬霜。精確稱取每種防曬霜50 mg，溶于50 ml無水乙醇中，用紫外分光光度計(jì)測定每種防曬霜在280~360 nm處的紫外吸光值。

防曬霜紫外防護(hù)性能的檢測：

各項(xiàng)指標(biāo)的檢測結(jié)果表：