技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及獸用藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于治療奶牛乳腺炎的藥物注入劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

奶牛乳腺炎是由物理、化學(xué)或微生物等因素刺激奶牛乳腺所引發(fā)的一種炎癥反應(yīng)，其中多種病原微生物的感染是引起奶牛乳腺炎的主要病因?？股厥悄膛Ｈ橄傺资走x治療藥物，但存在單一藥物抗菌譜不夠廣、耐藥性、藥物殘留蓄積、腸道菌群失調(diào)的問(wèn)題。從根本上講，抗生素治療失敗的原因主要?dú)w于奶牛乳腺特殊生理結(jié)構(gòu)形成的藥理學(xué)和藥動(dòng)學(xué)機(jī)制。另外，采用抗生素治療選擇的是單純抗菌的思路，只重視了對(duì)微生物的殺滅，而未重視作為乳腺炎過(guò)程中矛盾的另一方面，即奶牛本身的炎癥反應(yīng)和炎癥引起的免疫力下降的問(wèn)題。

中獸醫(yī)稱乳房炎為乳癰，多是陽(yáng)明經(jīng)實(shí)熱、厥陰肝經(jīng)淤滯和沖任二脈失調(diào)，使乳房脈絡(luò)不暢，乳汁積滯發(fā)熱腐敗而造成的炎性反應(yīng)。中獸醫(yī)理論認(rèn)為，乳房炎的防治應(yīng)著眼于肝胃，應(yīng)疏肝氣、散郁結(jié)、清胃熱、消腫毒、通脈絡(luò)。中草藥治療奶牛乳房炎，可避免產(chǎn)生耐藥菌株和乳中殘留抗生素，當(dāng)前對(duì)于中藥防治乳房炎的研究，重點(diǎn)是單味藥物和復(fù)方藥物對(duì)乳房炎的臨床療效。

鑒于奶牛乳腺炎發(fā)病初期，以微生物感染為主要矛盾，而隨著疾病的發(fā)展，乳腺內(nèi)炎癥反應(yīng)加強(qiáng)、感染受到控制，主要矛盾轉(zhuǎn)變?yōu)檠装Y引發(fā)的免疫力低下，抗病力減弱。因此，乳腺免疫系統(tǒng)對(duì)臨床型乳腺炎的進(jìn)程有重要影響，提高免疫系統(tǒng)對(duì)炎區(qū)組織修復(fù)也有著根本意義，應(yīng)改變?cè)械膯渭兛咕乃悸?，把控制炎癥反應(yīng)本身、改善免疫系統(tǒng)作為治療的要點(diǎn)之一。中藥屬于天然藥物，具有抗菌消炎、不易使致病菌產(chǎn)生耐藥性和增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能，提高動(dòng)物抗應(yīng)激、抗疾病能力，改善動(dòng)物生產(chǎn)性能等多種功效，能克服大量使用抗生素帶來(lái)的弊端。中藥具有標(biāo)本兼治的作用，它可直接抑制或殺滅乳腺炎的病原菌，或通過(guò)提高機(jī)體的免疫力而抑制或殺滅病原菌，在治療奶牛乳腺炎方面具有巨大的潛力。

特異性卵黃抗體IgY 是一種良好的免疫球蛋白資源，無(wú)污染，無(wú)殘留，具有高度的穩(wěn)定性，對(duì)熱、酸、堿具有較強(qiáng)的耐受性，可以針對(duì)不同抗原制備特異性抗體，專一性抑制殺滅病原體，近年來(lái)受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注。研究表明，口服特異性卵黃抗體IgY 可成功用于防治動(dòng)物和人類因細(xì)菌、病毒感染引起的消化道疾病，如幽門螺桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、輪狀病毒等引起的胃腸道感染，其效果呈劑量依賴性?？诜禺愋月腰S抗體IgY 在遠(yuǎn)離腸道部位的乳腺亦能夠有效抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，國(guó)外Coleman(1996)用抗無(wú)乳鏈球菌和抗金黃色葡萄球菌的IgY 抗體給泌乳期奶牛服用，結(jié)果牛奶的SCC 值很快降低，乳腺炎病情得到控制。針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明將根據(jù)獸藥類非抗生素生物制劑的發(fā)展方向，在中獸醫(yī)理論的基礎(chǔ)上，以散瘀止痛、退毒下膿、涼血消腫、抗菌消炎為原則，提供一種具有提高奶牛免疫力及抗病力的中藥組合物，從根本達(dá)到標(biāo)本兼治、祛邪固本的治療功效。此外，利用產(chǎn)蛋雞受到外來(lái)抗原（奶牛乳腺炎4種主要致病菌）的刺激會(huì)產(chǎn)業(yè)免疫應(yīng)答，并生成相應(yīng)抗體且抗體主要累計(jì)于卵黃這一特點(diǎn)，以產(chǎn)蛋雞為生物轉(zhuǎn)換器，大量、連續(xù)的生產(chǎn)抗奶牛乳腺炎主要致病菌的特異性卵黃免疫球蛋白IgY（Dominate pathogens of bovine mastitis，抗DP-BM-IgY）。制備的特異性抗DP-BM-IgY卵黃抗體可通過(guò)被動(dòng)免疫途徑防治奶牛乳腺炎，定向殺滅多種奶牛乳腺炎致病菌，尤其是抗生素?zé)o法有效殺滅的L-型耐藥變種菌及其他耐藥菌，而對(duì)奶牛乳房?jī)?nèi)的有益菌無(wú)影響。因此，抗DP-BM-IgY卵黃抗體有助于提高奶牛對(duì)乳腺炎主要致病菌的抗性，對(duì)奶牛多種類型的乳腺炎都有明顯療效，愈后奶牛乳腺炎不再?gòu)?fù)發(fā)，并以其性質(zhì)穩(wěn)定、特異性強(qiáng)、無(wú)殘留、無(wú)抗藥性而倍受關(guān)注。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了一種能夠有效防治奶牛臨床型乳腺炎和隱性乳腺炎的藥物注入劑及其制備方法和應(yīng)用，在兼具退毒下膿、提高奶牛免疫力及抗病能力的同時(shí)，還具有特異性防治奶牛乳腺炎主要致病菌如鏈球菌、葡萄球菌、G^—桿菌的作用。在預(yù)防及治療奶牛乳腺疾病方面具有療效顯著、無(wú)毒副作用、不產(chǎn)生耐藥性、不易復(fù)發(fā)的優(yōu)勢(shì)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：一種用于治療奶牛乳腺炎的藥物注入劑，所述藥物注入劑包含有特異性抗DP-BM-IgY卵黃抗體和中藥組合物提取液，為乳房注入劑。

進(jìn)一步的，上述的一種用于治療奶牛乳腺炎的藥物注入劑，所述藥物注入劑中，按照體積百分比計(jì)特異性抗DP-BM-IgY卵黃抗體：中藥組合物提取液為（5%-15%）：（10%-25%）。

進(jìn)一步的，上述的一種用于治療奶牛乳腺炎的藥物注入劑，所述藥物注入劑中，按照體積百分比計(jì)特異性抗DP-BM-IgY卵黃抗體：中藥組合物提取液為10%：20%。

進(jìn)一步的，上述的一種用于治療奶牛乳腺炎的藥物注入劑，所述中藥組合物由按照重量份計(jì)的以下原料藥組成：漏蘆5-15 份，蒲公英5-15份，紫花地丁5-15 份，連翹5-20 份，地榆5-15 份，瓜蔞5-15 份，當(dāng)歸5-10 份，黃芪10-20 份。

進(jìn)一步的，上述的一種用于治療奶牛乳腺炎的藥物注入劑，所述中藥組合物由按照重量份計(jì)的以下原料藥組成：漏蘆6 份，蒲公英10份，紫花地丁10 份，連翹12份，地榆8 份，瓜蔞10 份，當(dāng)歸7 份，黃芪15份。

進(jìn)一步的，上述的一種用于治療奶牛乳腺炎的藥物注入劑，所述特異性抗DP-BM-IgY卵黃抗體的制備方法包括以下步驟：

a）選取制備多價(jià)菌體蛋白抗原的主要致病菌，無(wú)乳鏈球菌（S.agalactiae，CVCC55901，牛源）、停乳鏈球菌（S.dysgalactiae，CVCC55935 牛源）、金黃色葡萄球菌（S.aurrus，CVCC 8029 牛源）及大腸桿菌（E.coli，O157:K88，CVCC1489 牛源），鑒定得到純種，分別在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物中進(jìn)行體外擴(kuò)大培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物為加有體積百分比5-10 %犢牛血清、質(zhì)量體積百分比1-2 %葡萄糖的LB 營(yíng)養(yǎng)肉湯；將培養(yǎng)好的菌液離心濃縮，采用細(xì)菌裂解液結(jié)合超聲細(xì)胞破碎方法，分別制備單一抗原，單一抗原進(jìn)行等濃度組合即得所需的復(fù)合抗原；將制備的復(fù)合菌體蛋白抗原加入與等量的弗氏完全佐劑混合，充分乳化制得抗原免疫物；采用多次交替的免疫程序，通過(guò)肌肉、皮下多點(diǎn)注射式途徑，免疫接種具有高免應(yīng)答能力的180日齡健康產(chǎn)蛋雞，首免后，收集免疫雞產(chǎn)下的蛋為樣品，即高免雞蛋，備用；

b）采用水稀釋法-冷凍法-聚乙二醇沉淀法分離提純抗DP-BM-IgY，將分離出的卵黃用7-9倍體積磷酸緩沖液稀釋，pH 值調(diào)至5.2，經(jīng)冷凍、解凍、離心去除脂肪沉淀，收集的上清液經(jīng)4 %、12 %的PEG-6000分別去除卵黃磷脂及蛋白沉淀，高速冷凍離心獲得特異性抗DP-BM-IgY 卵黃抗體液，將其濃度調(diào)節(jié)到50 mg/mL，在無(wú)菌條件下采用微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝，-20 ℃保存，備用。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供了上述一種用于治療奶牛乳腺炎的藥物注入劑的制備方法，包括以下步驟：

1）特異性抗DP-BM-IgY卵黃抗體的制備方法：

a）選取制備多價(jià)菌體蛋白抗原的主要致病菌，無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌及大腸桿菌，鑒定得到純種，分別在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物中進(jìn)行體外擴(kuò)大培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物為加有體積百分比5-10 %犢牛血清、質(zhì)量體積百分比1-2 %葡萄糖的LB 營(yíng)養(yǎng)肉湯；將培養(yǎng)好的菌液離心濃縮，采用細(xì)菌裂解液結(jié)合超聲細(xì)胞破碎方法，分別制備單一抗原，單一抗原進(jìn)行等濃度組合即得所需的復(fù)合抗原；將制備的復(fù)合菌體蛋白抗原加入與等量的弗氏完全佐劑混合，充分乳化制得抗原免疫物；采用多次交替的免疫程序，通過(guò)肌肉、皮下多點(diǎn)注射式途徑，免疫接種具有高免應(yīng)答能力的180日齡健康產(chǎn)蛋雞，首免后，收集免疫雞產(chǎn)下的蛋為樣品，即高免雞蛋，備用；

b）采用水稀釋法-冷凍法-聚乙二醇沉淀法分離提純抗DP-BM-IgY，將分離出的卵黃用7-9倍體積磷酸緩沖液稀釋，pH 值調(diào)至5.2，經(jīng)冷凍、解凍、離心去除脂肪沉淀，收集的上清液經(jīng)4 %、12 %的PEG-6000分別去除卵黃磷脂及蛋白沉淀，高速冷凍離心獲得特異性抗DP-BM-IgY 卵黃抗體液，將其濃度調(diào)節(jié)到50 mg/mL，在無(wú)菌條件下采用微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝，-20 ℃保存，備用；

2）中藥組合物提取液的制備方法：

按所述重量份稱取各原料藥，混合、攪拌、粉碎，加水煎煮，合并濾液、濃縮，得到濃縮濾液；之后用乙醇醇提，去乙醇后，在藥液中加注射用水，殺菌，得到本發(fā)明的乳房注入劑中藥提取液；

所述加水煎熬是加入相對(duì)于原料藥質(zhì)量之和5-15倍質(zhì)量的水，煎煮1-4 h，煎煮3 次；

所述乙醇醇提是在濃縮濾液中加入1倍濃縮液質(zhì)量的乙醇，將醇沉液離心，取上清液，上清液去乙醇后再加入乙醇進(jìn)行醇沉，醇沉液過(guò)濾，濾過(guò)液去乙醇，再加入去離子水，得到含生藥量為0.5 g/mL的溶液，過(guò)濾，得濾液，即為該中藥組合物的提取液；

3）乳房注入劑藥物的制備方法：

取所述中藥組合物提取液20 mL，在其中加入0.5 mL吐溫-80和50 mg苯甲醇，混合均勻后，加注射用水至 90mL，氫氧化鈉調(diào)pH 值至7.4，100℃滅菌30 min，冷卻，至溫度降至20℃，無(wú)菌加入抗DP-BM-IgY卵黃抗體10 mL，在無(wú)菌條件下進(jìn)行灌裝得成品乳房注入劑。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供了上述一種用于治療奶牛乳腺炎的藥物注入劑在制備用于防治奶牛乳腺炎的乳房注入劑藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，上述的應(yīng)用，所述乳房注入劑藥物的使用量為每頭奶牛每個(gè)乳區(qū)20-60 mL。

本發(fā)明的有益效果為：

（1）本發(fā)明提供的含有抗DP-BM-IgY卵黃抗體及中藥組合物提取液的乳房注入劑藥物，同時(shí)具有局部和全身作用。用藥后藥物可直接作用于乳腺組織，從而提高生物利用度及藥物療效，對(duì)疾病的治療更加有效、確切，并可降低藥物引起的全身毒副作用，減少藥物不良反應(yīng)，使用方便，順應(yīng)性好，增加了使用的安全性。其次，藥物經(jīng)乳腺組織局部吸收后可產(chǎn)生全身作用，特異性的防治奶牛乳腺炎的主要病原菌（包括對(duì)抗生素及消毒劑產(chǎn)生耐藥性的致病菌），有助于克服多藥耐藥性，恢復(fù)有益菌群，有效降低病牛的感染率和對(duì)抗生素的依賴，是防治奶牛乳腺炎的良好劑型。

（2）本發(fā)明提供的抗DP-BM-IgY乳房注入劑的制備方法，選材方便、提取效率高、成本相對(duì)較低，易于形成規(guī)模化生產(chǎn)。

（3）本發(fā)明公開(kāi)了一種治療奶牛乳腺炎的藥物注入劑的用途，該藥物通過(guò)將抗DP-BM-IgY卵黃抗體與中藥復(fù)方活性成分進(jìn)行偶聯(lián)，可通過(guò)特異性抗DP-BM-IgY卵黃抗體定向捕捉無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌及大腸桿菌，制備出針對(duì)鏈球菌、葡萄球菌、G^—桿菌獸用靶向治療藥物。其次，中藥復(fù)方提取液除具有清熱解毒、退毒下膿、抗菌消炎的優(yōu)點(diǎn)外，還兼具提高奶牛免疫力及抗病能力的特點(diǎn)，而且刺激性小、低毒無(wú)殘留、不易產(chǎn)生耐藥性，因此，對(duì)鏈球菌、葡萄球菌、G^—桿菌引起的奶牛臨床型、隱性乳腺炎具有良好的靶向治療和預(yù)防作用。長(zhǎng)期給奶牛使用不會(huì)產(chǎn)生藥物殘留，無(wú)需停擠乳或棄乳期，能顯著的節(jié)省成本，減少棄奶損失，具有預(yù)防保健和疾病治療的雙重效果，使奶農(nóng)及奶牛養(yǎng)殖企業(yè)獲得良好的經(jīng)濟(jì)效益。

（4）本發(fā)明通過(guò)制備抗DP-BM-IgY卵黃抗體與中藥組合物提取液的乳房注入劑藥物，能夠直接在乳房局部給藥，靶向效果大大提高，可進(jìn)一步提高藥物抗菌抑菌作用及生物利用度，對(duì)疾病的治療更加有效、確切，并可降低藥物引起的全身毒副作用，減少藥物不良反應(yīng)，使用方便，順應(yīng)性好，增加了使用的安全性。

附圖說(shuō)明

圖1為抗DP-BM-IgY卵黃抗體的純度檢測(cè)結(jié)果。

其中： M-蛋白Marker；1-標(biāo)準(zhǔn)雞IgY；2-提取的抗DP-BM-IgY。

具體實(shí)施方式

奶牛乳腺炎是奶牛乳腺組織炎癥，主要由多種非特定的病原微生物引起的，常見(jiàn)主要致病菌為鏈球菌屬、葡萄球菌屬和腸桿菌屬等。另外，環(huán)境因素和飼養(yǎng)管理對(duì)奶牛乳腺炎的發(fā)病率也有很大影響，當(dāng)奶牛生活環(huán)境衛(wèi)生條件差或擠奶不當(dāng)損傷乳管，使得機(jī)體降低和喪失抗感染的能力，奶牛乳房容易遭受病原微生物侵襲而發(fā)生乳腺炎。其次，當(dāng)乳房局部出現(xiàn)血液循環(huán)障礙時(shí)，乳腺黏膜系統(tǒng)受損，免疫能力降低，造成致病菌大量入侵、增殖引發(fā)炎癥。本發(fā)明所述的特異性抗DP-BM-IgY卵黃抗體可通過(guò)被動(dòng)免疫途徑防治奶牛乳腺炎，定向殺滅多種奶牛乳腺炎致病菌，尤其是抗生素?zé)o法有效殺滅的L-型耐藥變種菌及其他耐藥菌，而對(duì)奶牛乳房?jī)?nèi)的有益菌無(wú)影響。因此，抗DP-BM-IgY卵黃抗體有助于提高奶牛對(duì)乳腺炎主要致病菌的抗性，對(duì)奶牛多種類型的乳腺炎都有明顯療效，愈后奶牛乳腺炎不再?gòu)?fù)發(fā)，并以其性質(zhì)穩(wěn)定、特異性強(qiáng)、無(wú)殘留、無(wú)抗藥性而倍受關(guān)注。

另外，傳統(tǒng)中獸醫(yī)理論認(rèn)為，乳腺炎即乳癰，是痰、濕、氣、血瘀結(jié)不散化而為炎。因飼養(yǎng)管理不善，久臥濕熱之地，濕熱毒氣上蒸，侵害乳房?；蛞蛭笩嵊菏?，肝郁氣滯，乳絡(luò)失暢以致乳房氣血凝滯，瘀結(jié)而生癰腫。本發(fā)明所述的中藥組合物根據(jù)中獸醫(yī)藥和現(xiàn)代中醫(yī)藥學(xué)理論，以散瘀止痛、退毒下膿、涼血消腫、免疫增強(qiáng)為原則，按照一定的重量份組方而成的，既能活血化瘀、抗菌消炎，又能提高奶牛的免疫力和抗病力，達(dá)到標(biāo)本兼治、祛邪固本的功效，利于預(yù)防和治療奶牛乳腺炎。

所述中藥組合物的原料藥包括漏蘆、紫花地丁、連翹、地榆、瓜蔞、當(dāng)歸和黃芪。

所述中藥組合物中各原料藥的重量份分別為：漏蘆5-15 份，蒲公英5-15 份，紫花地丁5-15 份，連翹5-20 份，地榆5-15 份，瓜蔞5-15 份，當(dāng)歸5-10 份，黃芪10-20 份。

各原料藥的重量份優(yōu)選為：漏蘆6 份，蒲公英10 份，紫花地丁10 份，連翹12 份，地榆8 份，瓜蔞10 份，當(dāng)歸7 份，黃芪15 份。

各原料藥的藥理作用具體如下：

漏蘆：學(xué)名 Stemmacanthauniflora （L.）Dittrich。性味：苦咸，寒。入胃、大腸經(jīng)。功能主治：清熱解毒，消癰，下乳，舒筋通脈。主要用于乳癰腫痛，癰疽發(fā)背，瘰疬瘡毒，乳汁不通，濕痹拘攣，骨節(jié)疼痛、熱毒血痢、痔瘡出血。

蒲公英：拉丁學(xué)名 Herba Taraxaci。性味：甘，微苦，寒。功能主治：清熱解毒，消腫散結(jié)。

紫花地?。簩W(xué)名 Viola philippica。性味：苦、辛、寒，無(wú)毒。歸心、肺經(jīng)。具有清熱解毒，涼血消腫，清熱利濕的作用，主治疔瘡，癰腫，瘰疬，黃疸，痢疾，腹瀉，目赤，喉痹，毒蛇咬傷。

連翹：拉丁學(xué)名 Forsythia suspensa，英文名稱fructus forsythiae。性味：苦、涼。歸肺、心、小腸經(jīng)。功能主治：清熱解毒，消腫散結(jié)。用于癰疽，瘰癘，乳癰，丹毒，風(fēng)熱感冒，溫病初起，溫?zé)崛霠I(yíng)，高熱煩渴，神昏發(fā)斑，熱淋尿閉。

地榆：學(xué)名Sanguisorba officinalis。性味：苦酸、寒，無(wú)毒。歸肝、肺、腎、大腸經(jīng)。功效：涼血止血，清熱解毒，消腫斂瘡。主治：吐血，咯血，衄血，尿血，便血，痔血，血痢，崩漏，赤白帶下，瘡癰腫痛，濕疹，陰癢，水火燙傷，蛇蟲咬傷。

瓜蔞：拉丁學(xué)名 Fructus Trichosanthis，英文名稱：Snakegourd Fruit。性味：甘苦、寒。歸肺、胃、大腸經(jīng)。功能主治：清熱滌痰，寬胸散結(jié)，潤(rùn)燥滑腸。主要用于肺熱咳嗽，痰濁黃稠，胸痹心痛，結(jié)胸痞滿，乳癰，肺癰，腸癰腫痛，大便秘結(jié)。

當(dāng)歸：學(xué)名 Angelica sinensis。性味：甘、辛、苦，性溫。歸肝、心、脾經(jīng)。功效：補(bǔ)血、活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤(rùn)燥滑腸。主治：血虛諸證、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉、痛經(jīng)、癥瘕結(jié)聚、崩漏、虛寒腹痛、痿痹、肌膚麻木、腸燥便難、赤痢后重、癰疽瘡瘍、跌撲損傷。

黃芪：拉丁學(xué)名 Leguminosae。性味：甘，微溫。歸肺、脾、肝、腎經(jīng)。功效：補(bǔ)氣固表，利尿托毒，排膿，斂瘡生肌。用于氣虛乏力，食少便溏，中氣下陷，久瀉脫肛，便血崩漏，表虛自汗，氣虛水腫，癰疽難潰，久潰不斂，血虛痿黃，內(nèi)熱消渴。

本發(fā)明所用到的各種原料藥都可從醫(yī)藥商店購(gòu)買得到，其規(guī)格符合國(guó)家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)即可。

本發(fā)明所述的中藥組合物可用常規(guī)的中藥制劑方法，制備成適合臨床應(yīng)用的適宜制劑，優(yōu)選為適合局部外用的制劑，最優(yōu)選為乳房灌注方法，采用該方法可使藥物直接作用于患處，在乳腺內(nèi)達(dá)到較高的藥物濃度，更好地達(dá)到散瘀止痛、退毒下膿、涼血消腫、免疫增強(qiáng)的功效。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)說(shuō)明，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：

抗DP-BM-IgY卵黃抗體的制備：

1. 可溶性菌體蛋白抗原復(fù)合物的制備：

（1）選取具有特定抗原的致病性無(wú)乳鏈球菌（S.agalactiae，CVCC55901，牛源）、停乳鏈球菌（S.dysgalactiae，CVCC55935 牛源）、金黃色葡萄球菌（S.aurrus，CVCC 8029 牛源）及大腸桿菌（E.coli，O157:K88，CVCC1489 牛源）。主要致病菌的培養(yǎng)優(yōu)選為均以血瓊脂斜面培養(yǎng)基進(jìn)行傳代，37 ℃培養(yǎng)24 h，染色鏡檢無(wú)雜菌，得到純種。分別將4種主要致病菌接種于LB肉湯培養(yǎng)基（內(nèi)含5-10 %犢牛血清及1-2 %的葡萄糖）中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，置37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中(150-200 r/min)，培養(yǎng)24 h，離心收集細(xì)菌細(xì)胞。

（2）單菌濃縮蛋白抗原的制備：將菌沉淀按照每克濕菌 + 3 mL pH 7.0 的PBS緩沖液的比例，漂洗2-3 次。按每克濕菌 + 5 mL細(xì)胞裂解液的比例，混懸細(xì)菌細(xì)胞，20-37 ℃溫育10-20 min，同時(shí)輕輕搖動(dòng)。細(xì)菌細(xì)胞破碎后的勻漿液用超聲波粉碎儀超聲破碎（超聲時(shí)間 5s，間歇時(shí)間 10 s，超聲 20 min，功率 400 W），10000 rpm冷凍離心10 min，棄去細(xì)菌碎片沉淀，上清即為含有目的蛋白的粗提物。取上清，18300 rpm離心30 min。棄上清，沉淀用0.5 %十二烷基肌氨酸鈉懸浮，4 ℃作用1 h，18300 rpm離心30 min。棄上清，沉淀用雙蒸水混懸，用改良Bradford法測(cè)定目的菌體蛋白濃度，將其濃度調(diào)節(jié)到1.0 mg/mL，分裝后－20 ℃保存，備用。

（3）菌體蛋白抗原復(fù)合物的制備：將相同蛋白濃度的4種單一抗原進(jìn)行等濃度組合即得復(fù)合菌體蛋白抗原。

2. 多價(jià)菌體蛋白抗原免疫物的制備及動(dòng)物免疫方案：

（1）免疫佐劑的選擇：免疫佐劑優(yōu)選為弗氏佐劑，初次免疫選用弗氏完全佐劑（FCA），加強(qiáng)免疫（二免、三免）均選用弗氏不完全佐劑（FIA），兩者在母雞血清及卵黃中誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的量上具有不同的效能。

（2）抗原免疫物的制備：初次免疫，將實(shí)施例 1中制備的10 mL 復(fù)合菌體蛋白抗原與等量弗氏完全佐劑（FCA）混合，采用快速乳化法，冰浴條件下，利用超聲波粉碎儀反復(fù)乳化3-4 次（每次乳化10-15 s，置4 ℃冰箱，間隔1 min），直至完全乳化抗原和佐劑混合物。乳化完全后，冷藏備用。加強(qiáng)免疫均選用弗氏不完全佐劑（FIA），與所述實(shí)施例 1中制備的復(fù)合菌體蛋白抗原等量混合、充分乳化，作為免疫抗原用于免疫產(chǎn)蛋母雞，免疫效果更佳。

（3）免疫方案：制定多次交替的免疫程序，選擇具有高免應(yīng)答能力的健康產(chǎn)蛋雞(180日齡)，采用肌肉、皮下多點(diǎn)注射式途徑，免疫間隔設(shè)定為10日、免疫3次（基礎(chǔ)免疫1次、加強(qiáng)免疫2次）、免疫接種劑量為0.50 mg的免疫方案。首免后，收集免疫雞產(chǎn)下的蛋為樣品，即高免雞蛋，備用。

3. 抗DP-BM-IgY卵黃抗體的分離純化及制備：

采用水稀釋法--冷凍法--聚乙二醇（PEG-6000）沉淀法分離提純抗DP-BM-IgY，分別采用4 %、12 %的PEG-6000進(jìn)行純化，以進(jìn)一步去除卵黃磷脂及蛋白沉淀，脫脂、沉淀蛋白效果好，制備的抗DP-BM-IgY得率平均可達(dá)到50-60 mg/蛋，抗體純度可達(dá)90 %以上。具體地，將高免雞蛋用碘酒和酒精棉球進(jìn)行消毒處理，分離蛋黃和蛋清，刺破蛋黃膜，收集無(wú)膜蛋黃液并計(jì)量體積。取卵黃液 + 去離子水以1: 6-10 的比例混合(v/v，每個(gè)雞蛋的卵黃液平均按15 mL計(jì))，pH 值調(diào)至5.0-6.0，-20 ℃過(guò)夜（約8-10 h），4 ℃解凍，析出的上清液及卵黃沉淀高速冷凍離心，棄去脂肪沉淀。收集上清液，根據(jù)上清液的體積加入4 % 的PEG-6000 (w/v)，輕輕攪拌使其完全溶解，4 ℃靜置2-3 h，高速冷凍離心，以進(jìn)一步去除卵黃中的磷脂（離心后的黃色沉淀主要是蛋黃中的磷脂，蛋白主要存在上清液中）。收集上清液，根據(jù)上清液的體積加入12 % 的PEG-6000 (w/v)，輕輕攪拌使其完全溶解，4 ℃靜置1-2 h，以沉淀其中的蛋白抗體，高速冷凍離心，獲得的抗DP-BM-IgY卵黃抗體沉淀。

用少量0.1M PBS 溶液溶解沉淀，用改良Bradford法測(cè)定其中抗DP-BM-IgY卵黃抗體的蛋白濃度，并將其濃度調(diào)節(jié)到50 mg/mL，4℃保存，備用。

實(shí)施例2：

中藥組合物的制備方法，所述中藥提取液為乳房注入劑，具體為：

中藥提取液1號(hào) 的制備：

1. 按所述重量稱取各原料藥（單位：g）：漏蘆5，蒲公英5，紫花地丁5，連翹5，地榆5，瓜蔞5，當(dāng)歸5，黃芪10。

2. 將各原料藥混合，攪拌、粉碎，加水1000mL, 浸泡0.5 h后，煎煮2 h，煎煮液過(guò)濾；然后濾渣加入500 mL水，第2次煎煮2 h，煎煮液過(guò)濾；濾渣再加入500 mL水，第3次煎煮2 h，煎煮液過(guò)濾。將上述3 次過(guò)濾液合并，70℃水浴濃縮至150 mL，濾過(guò)得濃縮濾液。在濃縮濾液加入濃度為95 %乙醇，使乙醇濃度達(dá)到60 %，將醇沉液離心，取上清液，70℃水浴揮發(fā)去乙醇。再加入濃度95 %乙醇進(jìn)行醇沉，醇沉液經(jīng)濾紙濾過(guò)得濾過(guò)液。濾過(guò)液經(jīng)70℃水浴揮發(fā)去乙醇，加入去離子水，使溶液含生藥量為0.5 g/mL，用0.25 μm微孔濾膜過(guò)濾，得濾液，即為該中藥組合物的提取液。

中藥提取液2號(hào) 的制備：

1. 按所述重量稱取各原料藥（單位：g）：漏蘆15，蒲公英15，紫花地丁15，連翹20，地榆15，瓜蔞15，當(dāng)歸10，黃芪20。

2. 將各原料藥混合，攪拌、粉碎，加水1000mL, 浸泡0.5 h后，煎煮2 h，煎煮液過(guò)濾；然后濾渣加入500 mL水，第2次煎煮2 h，煎煮液過(guò)濾；濾渣再加入500 mL水，第3次煎煮2 h，煎煮液過(guò)濾。將上述3 次過(guò)濾液合并，70℃水浴濃縮至150 mL，濾過(guò)得濃縮濾液。在濃縮濾液加入濃度為95 %乙醇，使乙醇濃度達(dá)到60 %，將醇沉液離心，取上清液，70℃水浴揮發(fā)去乙醇。再加入濃度95 %乙醇進(jìn)行醇沉，醇沉液經(jīng)濾紙濾過(guò)得濾過(guò)液。濾過(guò)液經(jīng)70℃水浴揮發(fā)去乙醇，加入去離子水，使溶液含生藥量為0.5 g/mL，用0.25 μm微孔濾膜過(guò)濾，得濾液，即為該中藥組合物的提取液。

中藥提取液3號(hào) 的制備：

1. 按所述重量稱取各原料藥（單位：g）：漏蘆10，蒲公英12，紫花地丁12，連翹15，地榆10，瓜蔞12，當(dāng)歸8，黃芪18。

2. 將各原料藥混合，攪拌、粉碎，加水1000mL，浸泡0.5 h后，煎煮2 h，煎煮液過(guò)濾；然后濾渣加入500 mL水，第2次煎煮2 h，煎煮液過(guò)濾；濾渣再加入500 mL水，第3次煎煮2 h，煎煮液過(guò)濾。將上述3 次過(guò)濾液合并，70℃水浴濃縮至150 mL，濾過(guò)得濃縮濾液。在濃縮濾液加入濃度為95 %乙醇，使乙醇濃度達(dá)到60 %，將醇沉液離心，取上清液，70℃水浴揮發(fā)去乙醇。再加入濃度95 %乙醇進(jìn)行醇沉，醇沉液經(jīng)濾紙濾過(guò)得濾過(guò)液。濾過(guò)液經(jīng)70℃水浴揮發(fā)去乙醇，加入去離子水，使溶液含生藥量為0.5 g/mL，用0.25 μm微孔濾膜過(guò)濾，得濾液，即為該中藥組合物的提取液。

中藥提取液4號(hào) 的制備：

1. 按所述重量稱取各原料藥（單位：g）：漏蘆6，蒲公英10，紫花地丁10，連翹12，地榆8，瓜蔞10，當(dāng)歸7，黃芪15。

2. 將各原料藥混合，攪拌、粉碎，加水1000mL, 浸泡0.5 h后，煎煮2 h，煎煮液過(guò)濾；然后濾渣加入500 mL水，第2次煎煮2 h，煎煮液過(guò)濾；濾渣再加入500 mL水，第3次煎煮2 h，煎煮液過(guò)濾。將上述3 次過(guò)濾液合并，70℃水浴濃縮至150 mL，濾過(guò)得濃縮濾液。在濃縮濾液加入濃度為95 %乙醇，使乙醇濃度達(dá)到60 %，將醇沉液離心，取上清液，70℃水浴揮發(fā)去乙醇。再加入濃度95 %乙醇進(jìn)行醇沉，醇沉液經(jīng)濾紙濾過(guò)得濾過(guò)液。濾過(guò)液經(jīng)70℃水浴揮發(fā)去乙醇，加入去離子水，使溶液含生藥量為0.5 g/mL，用0.25 μm微孔濾膜過(guò)濾，得濾液，即為該中藥組合物的提取液。

中藥提取液5號(hào) 的制備：

1. 按所述重量稱取各原料藥（單位：g）：漏蘆4，蒲公英8，紫花地丁8，連翹10，地榆5，瓜蔞7，當(dāng)歸5，黃芪10。

2. 將各原料藥混合，攪拌、粉碎，加水1000mL, 浸泡0.5 h后，煎煮2 h，煎煮液過(guò)濾；然后濾渣加入500 mL水，第2次煎煮2 h，煎煮液過(guò)濾；濾渣再加入500 mL水，第3次煎煮2 h，煎煮液過(guò)濾。將上述3 次過(guò)濾液合并，70℃水浴濃縮至150 mL，濾過(guò)得濃縮濾液。在濃縮濾液加入濃度為95 %乙醇，使乙醇濃度達(dá)到60 %，將醇沉液離心，取上清液，70℃水浴揮發(fā)去乙醇。再加入濃度95 %乙醇進(jìn)行醇沉，醇沉液經(jīng)濾紙濾過(guò)得濾過(guò)液。濾過(guò)液經(jīng)70℃水浴揮發(fā)去乙醇，加入去離子水，使溶液含生藥量為0.5 g/mL，用0.25 μm微孔濾膜過(guò)濾，得濾液，即為該中藥組合物的提取液。

實(shí)施例3：

乳房注入劑藥物的制備方法：

取所述中藥提取液20 mL，在其中加入0.5 mL吐溫-80和50 mg苯甲醇，混合均勻后，加注射用水至90 mL，氫氧化鈉調(diào)pH 值至7.4，100℃滅菌30 min，冷卻，至溫度降至20 ℃左右，無(wú)菌加入抗DP-BM-IgY卵黃抗體10 mL，在無(wú)菌條件下進(jìn)行灌裝，得成品乳房注入劑（優(yōu)選為50 mL/支）?？笵P-BM-IgY卵黃抗體：中藥提取液：注射用水的體積比為10：20：70。

進(jìn)一步的，所述中藥提取液優(yōu)選為4號(hào)提取液（溶液含生藥量為0.5 g/mL），所述抗DP-BM-IgY卵黃抗體蛋白濃度50 mg/mL，最終注入劑藥物中生藥含量為0.1 g/mL。

進(jìn)一步的，上述的應(yīng)用，所述注入劑藥物的使用量為每頭奶牛每個(gè)乳區(qū)20-60 mL。

實(shí)施例4：

抗DP-BM-IgY卵黃抗體法純度檢測(cè)：

采用SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)，用于分離蛋白的凝膠選擇為：由7.5 %的分離膠和5.0 % 的濃縮膠組成的凝膠分離系統(tǒng)。電流：11 mA，電壓：220 V，時(shí)間：50 min，Marker 采用低相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，采用考馬斯亮藍(lán)R-250 染色法?？笵P-BM-IgY卵黃抗體的純度檢測(cè)結(jié)果，如圖1所示。

圖1中，提取的抗DP-BM-IgY卵黃抗體蛋白質(zhì)中含有少量41～44 Kda的IgY，而在標(biāo)準(zhǔn)商品化雞IgY中位于45 Kda處的條帶己被徹底除去。經(jīng)軟件Bandscan分析，IgY純度可達(dá)90 %以上。其中： M-蛋白Marker；1-標(biāo)準(zhǔn)雞IgY；2-提取的抗DP-BM-IgY。

實(shí)施例5：

乳房注入劑藥物的急性毒性試驗(yàn)：

（1） 試驗(yàn)動(dòng)物與受試藥物

昆明系清潔級(jí)小鼠60只，小鼠體重20±2 g，雌雄各半，雌性小鼠未產(chǎn)未孕。飼養(yǎng)條件：試驗(yàn)清潔級(jí)顆粒鼠糧（蘇飼審（2008）01008），室內(nèi)溫度22±2 ℃，相對(duì)濕度為30 %～60 %，自由采食與飲水。連續(xù)觀察1周，臨床健康即可用于試驗(yàn)，試驗(yàn)期間按常規(guī)飼養(yǎng)。

受試藥為實(shí)施例3制備獲得的乳房注入劑藥物，其中含抗DP-BM-IgY抗體的濃度為5.0 mg/mL。

（2） 試驗(yàn)方法

將健康小鼠隨機(jī)分成5個(gè)劑量組和1個(gè)對(duì)照組，組間劑量比設(shè)為1:1.4。每組10只，雌雄各半，并對(duì)每只小鼠進(jìn)行稱重。灌胃前8 h、灌胃后4 h禁食，但可自由飲水。

各藥物劑量組根據(jù)小鼠體質(zhì)量，按照1.00、1.40、1.96、2.74、3.84 g/kg的藥物劑量計(jì)算給藥量，以等濃度口服液經(jīng)口灌喂給藥，每日最大灌胃量不超過(guò)1.0 mL/只。對(duì)照組灌服生理鹽水。試驗(yàn)期間所有小鼠自由采食與飲水。

（3） 觀察指標(biāo)

給藥后3 h內(nèi)，每隔30 min觀察1次小鼠的健康狀況、中毒表現(xiàn)及死亡過(guò)程，包括采食飲水、行為及反應(yīng)、自主活動(dòng)、呼吸急促或放緩狀態(tài)、被毛松散度、癥狀起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間、死亡等情況；之后，每隔2 h觀察1次；2 d后，每天觀察6次，連續(xù)觀察7 d，統(tǒng)計(jì)死亡率。

組織病理學(xué)檢查：實(shí)驗(yàn)期間對(duì)死亡小鼠及時(shí)進(jìn)行解剖并記錄病變情況，尤其是其肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、腸道、胃的病理變化，包括各臟器的外觀形態(tài)顏色、大小、質(zhì)地，胃腸發(fā)明是否出現(xiàn)腹部脹氣，并觀察大便性狀和色澤。第8天，對(duì)所剩存活小鼠進(jìn)行稱重、斷頸處死，剖檢觀察、記錄腹腔內(nèi)的液體狀況以及心、肝、脾、肺、腎的病理變化。

（4） 試驗(yàn)結(jié)果與分析

給藥灌胃后，2.74、3.84 g/kg劑量組小鼠出現(xiàn)精神沉郁、活動(dòng)量減少的現(xiàn)象，未見(jiàn)其他明顯的異常反應(yīng)。灌胃后第2～3 d，1.00、1.40、1.96、2.74 g/kg劑量組小鼠飲食、飲水量均有一定程度的增加，活動(dòng)增多，精神狀態(tài)良好，未出現(xiàn)異常反應(yīng)。而3.84 g/kg藥物劑量組小鼠精神欠佳，至試驗(yàn)結(jié)束出現(xiàn)2例死亡小鼠。

試驗(yàn)過(guò)程中小鼠自由采食與飲水，經(jīng)稱重，各藥物組及對(duì)照組小鼠的體質(zhì)量在第7 d試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，體質(zhì)量較初始體重均有一定程度的增加，存活的小鼠體質(zhì)量均在30 g以上，1.00、1.40、1.96、2.74 g/kg劑量組在觀察期間未見(jiàn)死亡，未出現(xiàn)毒性反應(yīng)。小鼠剖檢檢查結(jié)果顯示，各藥物組小鼠的主要組織器官正常，臟器無(wú)實(shí)質(zhì)性異常變化。

急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，采用改良寇氏法計(jì)算注入劑藥物的LD₅₀為5394.0 mg/kg，95 %置信區(qū)間為：3548.4--4010.6 mg/kg，屬于基本無(wú)毒。

實(shí)施例6：

中藥提取液4號(hào)的體外抑菌試驗(yàn)：

（1） 試驗(yàn)菌株：無(wú)乳鏈球菌(S. agalactiae)、乳房鏈球菌(S. uberis) 為本實(shí)驗(yàn)室從乳房炎患牛乳汁中分離鑒定的優(yōu)勢(shì)菌株。停乳鏈球菌(S. dysgalactiae)[ATCC 35666]、金黃色葡萄球菌（S. aureus) [CMCC(B) 26003]、大腸埃希菌（E. coli) [CMCC(B) 44102]、變形桿菌(Proteusbacillus vulgaris) [CMCC(B) 49027]、化膿性鏈球菌 (S. pyogenes) [ATCC 19615]、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa) [CICC 10419]，分別購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心和中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏與管理中心，具有ATCC官方授權(quán)。

（2）試驗(yàn)方法

MIC 的測(cè)定：按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）推薦的常量稀釋法（macrodilution），測(cè)定實(shí)驗(yàn)菌株的最小抑菌濃度MIC值，通過(guò)管碟法觀察其體外抑菌活性。稀釋液為MH 肉湯。

瓊脂稀釋法：

接種菌量的準(zhǔn)備：取各菌（細(xì)菌）的肉湯培養(yǎng)物，按10倍稀釋法，用0.9 %無(wú)菌生理鹽水溶液，制備濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管的供試菌懸液，再用MH 肉湯稀釋至含菌量為1×10⁷ CFU /mL，備用。

含藥瓊脂平板的制備：采用對(duì)倍稀釋法，用MH 肉湯稀釋待測(cè)藥物，6 mL/管，1# 管至10# 管中的藥物濃度依次為500 mg/mL（原藥濃度）、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL、15.625 mg/mL、7.81 mg/mL、2.91 mg/mL、1.95 mg/mL、0.98 mg/mL。11# 管為不含藥物的生長(zhǎng)對(duì)照。取33個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿，分別對(duì)其進(jìn)行標(biāo)注(1#～11#)。制備MH 營(yíng)養(yǎng)瓊脂11瓶，54 mL/瓶，121℃滅菌15 min。待溫度降至50 ℃左右，鏈球菌用平板加入2 %小牛血清，再吸取1#～11# 管內(nèi)不同濃度的待測(cè)藥物6 mL，依次加入54 mL 的MH營(yíng)養(yǎng)瓊脂中(藥物:瓊脂=1：9，v/v)，充分混勻，傾注滅菌平皿，20 mL/皿，瓊脂厚度以4 mm為宜。

接 種：在平板上劃定區(qū)域，移液槍吸取制備好的稀釋菌液1～2 μL，接種瓊脂平板表面，每個(gè)接種點(diǎn)約含10⁴個(gè)菌。接種后形成的菌液圈直徑約5～8 mm。培 養(yǎng)：接種點(diǎn)菌液干后，將平板菌置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育16～24 h。

結(jié)果判斷：菌落生長(zhǎng)被完全抑制的最低藥物濃度即為受試中藥對(duì)檢測(cè)菌的最低抑菌濃度（完全無(wú)菌生長(zhǎng)的平板所對(duì)應(yīng)的藥物濃度作為最低抑菌濃度）。單一菌落生長(zhǎng)可忽略不計(jì)。各菌重復(fù)3次，求平均值。

管碟法：采用牛津杯加注藥液的體外抑菌法。

培養(yǎng)基平板的制備：水解酪蛋白（Mueller-Hinton，MH）瓊脂培養(yǎng)基（pH 7.2-7.4）按商品說(shuō)明書進(jìn)行配制。121 ℃滅菌15 min，待溫度降至50～60℃左右，傾注無(wú)菌平皿，使瓊脂厚度為4 mm。鏈球菌使用含5 %脫纖維綿羊血（v/v）的MH瓊脂平板。MH瓊脂平板使用前應(yīng)置35 ℃孵育30 min，使其表面干燥。

牛津杯加注藥液法：將制備的菌液用滅菌生理鹽水稀釋至最佳涂布濃度，用滅菌棉簽蘸取菌液，將多余的菌液沿管壁擠出，然后均勻涂布至MH瓊脂平板，共3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60°，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周，以取得均勻接種。平板加蓋置放于超凈工作臺(tái)內(nèi)，干燥至少3 min，不超過(guò)15 min。將滅菌牛津杯在酒精燈上微灼，在每個(gè)瓊脂平板表面上等距離放置4只牛津杯，并在每只牛津杯中加入受試藥液原液200 uL。在牛津杯上覆蓋2張滅菌濾紙（以防培養(yǎng)時(shí)水珠掉下影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果），合蓋，平皿平置，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育20～24 h。

結(jié)果觀察：用游標(biāo)卡尺測(cè)量藥物對(duì)各菌的抑菌環(huán)直徑，并評(píng)價(jià)其抑菌效果。試驗(yàn)在相同條件下重復(fù)1次，兩次結(jié)果應(yīng)基本一致，否則不予報(bào)道。結(jié)果判定：抑菌環(huán)直徑小于10 mm，為無(wú)抑菌作用；介于在10～15 mm，為抑菌作用較弱；大于20 mm，為具有較強(qiáng)抑菌作用。

（3）結(jié)果與分析：（見(jiàn)表 1）

表 1 中藥提取液4號(hào)的最小抑菌濃度(MIC)及抗菌活性。

結(jié)果顯示，中藥提取物4號(hào)對(duì)不同奶牛乳房炎常見(jiàn)病原菌表現(xiàn)出不同的抑菌作用，對(duì)鏈球菌屬的抑菌效果較強(qiáng)，MIC值小于31.25 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌和變性桿菌具有一定的抑菌作用，MIC為62.5 mg/mL，而對(duì)常見(jiàn)腸桿菌具有較弱的抑菌作用，MIC值在125 mg/mL左右。其次，中藥提取物4號(hào)的原藥（500 mg/mL）對(duì)試驗(yàn)菌株均有一定抑制作用，但抑菌強(qiáng)度不同。對(duì)鏈球菌屬及金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌效果，抑菌環(huán)直徑介于21-23 mm之間；對(duì)金黃色葡萄球菌及腸桿菌具有較弱的抑菌活性，抑菌環(huán)直徑介于15-18 mm之間，在牛津杯周圍可見(jiàn)明顯的藥物作用圈，作用圈內(nèi)可見(jiàn)少量散在小菌落。

實(shí)施例7：

乳房注入劑藥物的臨床療效觀察試驗(yàn)：

1. 材料與方法：

1.1 試驗(yàn)藥品：

乳房注入劑藥物，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所創(chuàng)新獸藥工程重點(diǎn)研究室制備。對(duì)照藥：注射用氨芐西林鈉（2 g/支，鄭州百瑞動(dòng)物藥業(yè)有限公司）。奶牛乳腺炎診斷液（LMT 診斷液），由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所中獸醫(yī)研究室制備。

1.2 試驗(yàn)方法：

患病奶牛分別來(lái)自甘肅省荷斯坦奶牛繁育示范中心、甘肅秦王川奶牛場(chǎng)試驗(yàn)場(chǎng)，共計(jì)26頭28個(gè)乳區(qū)。奶牛臨床型乳房炎10頭10個(gè)乳區(qū)，奶牛隱性乳房炎16頭18個(gè)乳區(qū)（其中2頭患牛為雙乳區(qū)炎癥癥狀）。

奶牛臨床型乳房炎診斷標(biāo)準(zhǔn)為：奶牛產(chǎn)奶量下降，乳房部分腫脹發(fā)紅，有熱和痛感，牛奶中有薄片、絮狀物、膿塊或血液，牛奶呈稀水樣或擠不下來(lái)。嚴(yán)重時(shí)則表現(xiàn)為乳房突然腫脹、發(fā)熱、變硬、乳區(qū)敏感，甚至表現(xiàn)體溫升高、飲食大減或廢絕、精神萎頓等。根據(jù)臨床癥狀、乳房觸診和乳汁檢查，可確定為臨床型乳腺炎。

奶牛隱性乳房炎的確診：乳房及乳樣無(wú)上述癥狀及表現(xiàn)，LMT診斷液現(xiàn)場(chǎng)診斷呈陽(yáng)性，乳區(qū)乳樣經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)、鑒定，可見(jiàn)常見(jiàn)致病菌生長(zhǎng)。

奶牛乳房炎治愈標(biāo)準(zhǔn)：眼觀為臨床紅腫熱痛癥狀消失，乳汁正常，現(xiàn)場(chǎng)LMT診斷為陰性結(jié)果，乳區(qū)奶樣的細(xì)菌分離培養(yǎng)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。

試驗(yàn)分組：

（1）4頭臨床型乳房炎患牛及4頭隱性乳房炎患牛，為抗生素治療對(duì)照組，采用注射用氨芐西林鈉，按照說(shuō)明書方法使用。

（2）其余18頭患病奶牛為注入劑藥物治療組，乳房注入劑藥物的使用：將患病乳區(qū)乳汁擠干，注入藥物50 mL/乳區(qū)，每日2 次，3 天為1療程。

治愈判定標(biāo)準(zhǔn)：

（1）臨床癥狀消失，乳汁正常；（2） LMT 診斷為陰性。

1.3 奶牛乳腺炎患牛的療效觀察：

藥物治療試驗(yàn)結(jié)果如表 2所示。

表 2

結(jié)果表明，使用乳房注入劑藥物后，患牛乳房部位紅、腫、熱、痛、硬癥狀明顯減輕，消腫快，無(wú)不良反應(yīng)，回奶迅速，肉眼觀察奶樣恢復(fù)正常，奶產(chǎn)量逐漸提高。對(duì)于急性臨床型病例，乳房注入劑的治愈效果低于對(duì)照抗生素藥物，但該藥對(duì)隱性乳房炎具有較好的治療效果，用藥5天后，有10頭12個(gè)乳區(qū)的乳房炎癥狀消失或明顯改善，頭治愈率和乳區(qū)治愈率均高于對(duì)照藥物組。

本發(fā)明制備抗DP-BM-IgY卵黃抗體所使用的菌種購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（CVCC），其中，無(wú)乳鏈球菌（分類命名：S.agalactiae，編號(hào)CVCC55901，牛源）、停乳鏈球菌（分類命名：S.dysgalactiae，編號(hào)CVCC55935 牛源）、金黃色葡萄球菌（分類命名：S.aurrus，編號(hào)CVCC 8029 牛源）及大腸桿菌（分類命名：E.coli，O157：K88，編號(hào)CVCC1489 牛源）。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。