本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，具體地涉及一種大黃酸酰胺類衍生物納米混懸劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

大黃來源于蓼科多年生草本植物掌葉大黃(Rheum palmatum L.)、唐古特大黃(R.tanguticum Maxim.ex Balf.)或藥用大黃(Rheum officinale Baill.)的干燥根及根莖。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性味苦寒，歸脾、胃、大腸、肝、心經(jīng)，具有逐癖痛經(jīng)，泄熱通腸，涼血解毒的功效。臨床常用于膽囊炎、肝炎、糖尿病、腎病、慢性腎功能衰竭以及便秘等疾病的治療。大黃的主要藥理成分是蒽醌衍生物(含量約占3％～5％)和少量二蒽酮類衍生物。其中，游離型蒽醌為大黃的主要抗菌成分，結(jié)合型蒽醌則為大黃的主要瀉下成分。現(xiàn)代研究表明，游離型蒽醌類化合物具有抗腫瘤活性。

大黃酸(Rhein，RH)作為中藥大黃、中藥蘆薈等的主要有效成分，屬單蒽核類1,8-二羥基蒽醌衍生物，大量的藥理學研究結(jié)果表明，大黃酸在降糖調(diào)脂、抗腫瘤、抗病毒、抗纖維化、抗菌、保肝等多方面具有廣泛的藥理活性，特別是在治療骨關(guān)節(jié)炎、糖尿病、腎病及協(xié)同抗腫瘤方面有突出的治療作用，是近年來研究熱點之一。但是由于其水溶性低，生物利用度差，極大地限制了大黃酸的開發(fā)和臨床應(yīng)用?，F(xiàn)有技術(shù)中均只是對大黃酸進行了結(jié)構(gòu)改造，而沒有相關(guān)制劑的深入研究。

納米混懸劑是20世紀末發(fā)展起來的一種新型納米給藥系統(tǒng)，由于不使用添加劑，納米混懸劑可以避免由添加劑在體內(nèi)消除和聚集引起的毒性問題。與傳統(tǒng)小分子抗腫瘤藥物相比，納米混懸劑具有如下突出優(yōu)點：1)可使藥物具有控釋效果，能夠延長藥物在體內(nèi)的半衰期；2)可使藥物具有靶向輸送的效果，納米混懸劑通過其高通透性和滯留效應(yīng)(EPR)，能夠?qū)⑺幬锇邢蜉斔椭聊[瘤部位，從而降低其對正常組織的毒副作用，提高藥物的生物利用度；3)可通過化學鍵鍵和、表面吸附或者物理增溶等方式提高疏水性抗癌藥物的溶解性，有效改善其給藥方式；4)可以通過胞吞方式進入腫瘤細胞，并解決有效克服上皮和內(nèi)皮運輸障礙的問題；5)可同時輸送多種藥物，實現(xiàn)聯(lián)合給藥，增強藥物抗腫瘤等作用；6)可通過包載或與顯像劑連接，使藥物輸送可視化，便于實時跟蹤研究藥物在體內(nèi)的輸送和釋放過程。

因此，為了進一步提高原化合物的生物利用度，同時具有緩釋作用，開發(fā)大黃酸酰胺類衍生物的新劑型，具有重要的作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是，提供一種更加簡單、快速、高產(chǎn)率的大黃酸酰胺類衍生物混懸劑的制備方法。

本發(fā)明的目的之二是，提供大黃酸酰胺類衍生物納米混懸劑在臨床上的應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種大黃酸酰胺類衍生物納米混懸劑，制備方法包括如下步驟：

1)將大黃酸酰胺類衍生物溶于有機溶劑中，作為油相；將穩(wěn)定劑溶于水中，作為水相；

2)將水相置于冰水浴中，攪拌下，逐滴加入油相，分散完全后繼續(xù)攪拌30-40min，旋蒸除去有機溶劑，在20000rpm條件下，用高速剪切機連續(xù)剪切，靜置，消泡后，得到粗混懸劑；

3)將粗混懸劑經(jīng)超聲法和/或高壓均質(zhì)法處理，得大黃酸酰胺類衍生物納米混懸劑。

上述的一種大黃酸酰胺類衍生物納米混懸劑，所述的大黃酸酰胺類衍生物具有通式(Ⅰ)的結(jié)構(gòu)，

其中，R為L-丙氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-甘氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸。優(yōu)選的，R為L-異亮氨酸或L-苯丙氨酸。

上述的一種大黃酸酰胺類衍生物納米混懸劑，按重量比，大黃酸酰胺類衍生物：穩(wěn)定劑＝1：0.3-1。優(yōu)選的，大黃酸酰胺類衍生物：穩(wěn)定劑＝1：1。

上述的一種大黃酸酰胺類衍生物納米混懸劑，所述的有機溶劑選自甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、DMSO或DMF中的一種或二種以上的混合。優(yōu)選的，有機溶劑是甲醇，其用量控制在，2～8mL/50毫克大黃酸酰胺類衍生物，更優(yōu)選的，甲醇用量為4mL。

上述的一種大黃酸酰胺類衍生物納米混懸劑，所述的穩(wěn)定劑選自泊洛沙姆188(F68)、卵磷脂(LC)、聚維酮(PVP)或羥丙基纖維素(HPC)中的一種或二種以上的混合。優(yōu)選的，穩(wěn)定劑是，按重量比，泊洛沙姆188：卵磷脂＝1：1的混合。

上述的一種大黃酸酰胺類衍生物納米混懸劑，將油相勻速逐滴加入水相中，勻速是指0.5～2.0mL/min，優(yōu)選1.0mL/min。

上述的凍干保護劑選自甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、麥芽糖中的一種或幾種的組合，優(yōu)選甘露醇。其用量控制在1～10％，優(yōu)選5％。

上述的一種大黃酸酰胺類衍生物納米混懸劑，所述的超聲法是：將粗混懸劑轉(zhuǎn)移至超聲波細胞粉碎機中，于超聲功率135～360W下，探頭超聲時間控制在2～8min。優(yōu)選的，超聲功率為315W，探頭超聲時間控制在4min

上述的一種大黃酸酰胺類衍生物納米混懸劑，所述的高壓均質(zhì)法是：將粗混懸劑轉(zhuǎn)移至高壓微射流機中，4660psi均質(zhì)3次后，于6990～16310psi壓力下均質(zhì)5～25次。優(yōu)選的，4660psi均質(zhì)3次后，于11650psi壓力下均質(zhì)20次。

本發(fā)明在對粗混懸劑進行處理時，可以單一的選擇超聲法或高壓均質(zhì)法，也可以兩者同時使用。

為了方便長期儲存及動物試驗，上述的一種大黃酸酰胺類衍生物納米混懸劑，包括凍干步驟，所述的凍干步驟是：于大黃酸酰胺類衍生物納米混懸劑中，加入凍干保護劑，完全溶解后，在-80℃條件下預凍48h后取出，放入冷凍干燥機中凍干，得納米混懸劑凍干粉。此凍干粉可進一步加工制備成膠囊劑、片劑、注射劑等。

上述的一種大黃酸酰胺類衍生物納米混懸劑，所述的凍干保護劑選自甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、麥芽糖中的一種或二種以上的組合。

本發(fā)明提供的大黃酸酰胺類衍生物納米混懸劑在制備治療抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的大黃酸酰胺類衍生物的合成方法如下：

1)大黃酰氨基酸甲酯的合成：稱取大黃酸(RH)于茄形瓶中，加入過量羧基保護的氨基酸甲酯鹽酸鹽(或二乙酯鹽酸鹽)，RH與羧基保護的氨基酸甲酯鹽酸鹽(或二乙酯鹽酸鹽)摩爾比控制在1:1～1:5之間，置于磁力攪拌上，繼續(xù)加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)，1-羥基苯并三氮唑(HOBt)，沿壁加入三乙胺，加入二氯甲烷。室溫攪拌反應(yīng)，TLC(氯仿做展開劑)監(jiān)測反應(yīng)進程。6h反應(yīng)完畢，將上述反應(yīng)液倒入分液漏斗中，緩慢加入18％鹽酸溶液萃取三次，收集二氯甲烷層液體，二氯甲烷相用飽和NaHCO₃水溶液反復萃取至上層無色，二氯甲烷相無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓蒸發(fā)濃縮，即得大黃酰氨基酸甲酯。

2)大黃酸酰胺類衍生物的合成：向上述大黃酰氨基酸甲酯中加入適量1M NaOH溶液，超聲溶解后，45℃攪拌反應(yīng)，TLC(氯仿做展開劑)監(jiān)測反應(yīng)，1h水解完全，過濾，收集濾液。將反應(yīng)液置于0℃冰水浴中，攪拌下逐滴加入10％鹽酸溶液，調(diào)節(jié)pH 1～2，靜置過夜，析出固體，抽濾，收集濾餅，干燥，即得大黃酸酰胺類衍生物。

本發(fā)明采用高效液相(HPLC)法測定了各化合物在不同有機溶劑和不同pH緩沖液中的溶解度(見表1、表2)，以及不同pH緩沖液中的油水分配系數(shù)(見表3)，結(jié)果表明有部分化合物的水溶性及脂溶性較RH均有明顯提高，油水分配系數(shù)也有所提高；采用MTT法(見表4)初步測定各化合物體外活性，結(jié)果證明部分化合物對肝癌HepG2細胞有明顯的抑制增殖作用；體內(nèi)藥代動力學研究(見圖1)結(jié)果表明部分衍生物的血藥濃度較同摩爾量的RH有明顯提高。綜合比較各化合物以上指標，優(yōu)選出兩種最優(yōu)化合物大黃酰異亮氨酸(Rhein-isoleucine，RH-Ile)和大黃酰苯丙氨酸(Rhein-phenylalanine，RH-Phe)，進行深入研究。

表1部分化合物在不同溶劑中的平衡溶解度(Mean±SD，n＝3)

表2部分化合物在不同pH緩沖液中的平衡溶解度(Mean±SD，n＝3)

表3部分化合物在不同溶劑中的表觀油水分配系數(shù)(Mean±SD，n＝3)

表4部分化合物對肝癌HepG2細胞的增殖抑制作用

注：“—”表示低濃度促進，高濃度抑制，有明顯地促進增殖作用。

本發(fā)明的優(yōu)點是：本發(fā)明，制備了一系列大黃酸酰胺類衍生物納米混懸劑，制備方法簡單可行，產(chǎn)物產(chǎn)率和純度較高。本發(fā)明，對制備方法進行了選擇比較，并對影響制備工藝的重要因素進行了考察，以粒徑、Zeta電位和多分散系數(shù)(PDI)為指標確定最優(yōu)的處方工藝，通過比較制劑和原化合物的藥動學參數(shù)，結(jié)果表明，制備成制劑后，RH-Ile和RH-Phe的生物利用度分別提高了2倍和3.5倍左右，半衰期分別延長了3.45h和6.37h，具有緩釋效果。本發(fā)明首次將大黃酸的結(jié)構(gòu)改造產(chǎn)物制備成了納米混懸劑，并探討了制備成制劑后的體內(nèi)藥代動力學，為大黃酸類結(jié)構(gòu)改造產(chǎn)物的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1：大鼠口服給予RH及大黃酸酰胺類衍生物后平均血藥濃度-時間曲線(n＝6)。

圖2：粒徑及Zeta電位圖。

其中，A：RH-Ile-NS粒徑圖；B：RH-Ile-NS的Zeta電位圖；C：RH-Ile-NS凍干粉粒徑圖；D：RH-Ile-NS凍干粉Zeta電位圖。

圖3：粒徑及Zeta電位圖。

其中，A：RH-Phe-NS粒徑圖；B：RH-Phe-NS的Zeta電位圖；C：RH-Phe-NS凍干粉粒徑圖；D：RH-Phe-NS凍干粉Zeta電位圖。

圖4：納米混懸劑凍干粉TEM圖。

其中，A：RH-Ile-NS；B：RH-Phe-NS。

圖5：差示量熱掃描圖譜結(jié)果。

圖6：大鼠口服給予RH-Ile-NS后平均血藥濃度-時間曲線(n＝6)。

圖7：大鼠口服給予RH-Phe-NS后平均血藥濃度-時間曲線(n＝6)。

具體實施方式

大黃酰苯丙氨酸(Rhein-phenylalanine，RH-Phe)的制備：稱取RH 1.76mmol于100mL茄形瓶中，加入3.52mmol L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽，置于磁力攪拌上，繼續(xù)加入EDC·HCl 2.50mmol，HOBt 1.85mmol，沿壁加入三乙胺1mL，加入二氯甲烷10～20mL。室溫攪拌反應(yīng)，TLC(氯仿做展開劑)監(jiān)測反應(yīng)進程。6h反應(yīng)完畢，將上述反應(yīng)液倒入分液漏斗中，緩慢加入18％鹽酸溶液萃取三次，收集二氯甲烷層液體，二氯甲烷相用飽和NaHCO₃水溶液反復萃取至上層無色，二氯甲烷相無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓蒸發(fā)濃縮，即得大黃酰苯丙氨酸甲酯。向上述大黃酰苯丙氨酸甲酯中加入適量1M NaOH溶液，超聲溶解后，45℃攪拌反應(yīng)，TLC(氯仿做展開劑)監(jiān)測反應(yīng)，1h水解完全，過濾，收集濾液。將反應(yīng)液置于0℃冰水浴中，攪拌下逐滴加入10％鹽酸溶液，調(diào)節(jié)pH 1～2，靜置過夜，析出固體，抽濾，收集濾餅，干燥，即得大黃酰苯丙氨酸。

RH-Phe，C₂₄H₁₇NO₇，黃棕色粉末狀固體，產(chǎn)率76％。¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆/TMS)：δ11.98(2H,d,J＝4.9Hz,1-OH和8-OH)，9.20(1H,d,J＝8.2Hz,2’-H)，8.06(1H,s,4-H)，7.77-7.67(3H,m,5,6,7-H)，7.36-7.27(5H,m,7’,8’,9’,10’,11’-H)，7.18(1H,d,J＝7.2Hz,2-H)，4.71-4.64(1H,s,3’-H)，3.26-3.11(2H,m,5’-H)。IR(KBr)：3304.06(締合OH)，1728.22(s，COOH)，1676.14(酰胺羰基)，1635.64(醌羰基)，1610.56，1564.27，1475.54，1452.40，1373.32，1298.09，1261.45，1201.65，1157.29，748.38，717.52，704.02(苯環(huán))cm^-1。MS(ESI)m/z(％)：432.1[M+H]⁺，454.0[M+Na]⁺，表明化合物分子量為431，與RH-Phe分子量相符。

大黃酰異亮氨酸(Rhein-isoleucine，RH-Ile)的制備：稱取RH 1.76mmol于100mL茄形瓶中，加入3.52mmol L-異亮氨酸甲酯鹽酸鹽，置于磁力攪拌上，繼續(xù)加入EDC·HCl2.50mmol，HOBt 1.85mmol，沿壁加入三乙胺1mL，加入二氯甲烷10～20mL。室溫攪拌反應(yīng)，TLC(氯仿做展開劑)監(jiān)測反應(yīng)進程。6h反應(yīng)完畢，將上述反應(yīng)液倒入分液漏斗中，緩慢加入18％鹽酸溶液萃取三次，收集二氯甲烷層液體，二氯甲烷相用飽和NaHCO₃水溶液反復萃取至上層無色，二氯甲烷相無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓蒸發(fā)濃縮，即得大黃酰異亮氨酸甲酯。向上述大黃酰異亮氨酸甲酯中加入適量1M NaOH溶液，超聲溶解后，45℃攪拌反應(yīng)，TLC(氯仿做展開劑)監(jiān)測反應(yīng)，1h水解完全，過濾，收集濾液。將反應(yīng)液置于0℃冰水浴中，攪拌下逐滴加入10％鹽酸溶液，調(diào)節(jié)pH 1～2，靜置過夜，析出固體，抽濾，收集濾餅，干燥，即得大黃酰異亮氨酸。

RH-Ile，C₂₁H₁₉NO₇，黃色粉末狀固體，產(chǎn)率78％。¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆/TMS)：δ12.72(1H,s,4’-COOH)，11.94(2H,s,1-OH和8-OH)，9.00(1H,d,J＝7.9Hz,2’-H)，8.16(1H,s,4-H)，7.85-7.77(3H,m,5,6,7-H)，7.43(1H,d,J＝9.4Hz,2-H)，4.36(1H,t,J＝7.5Hz,3’-H)，1.99(1H,s,5’-H)，1.58-1.24(2H,m,7’-H)，1.03-0.79(6H,m,6’-H和8’-H)。IR(KBr)：3421.72(寬，w)，3288.63(締合OH)，1718.58(s，COOH)，1674.21(酰胺羰基)，1645.28(醌羰基)，1629.85，1533.41，1477.47，1454.33，1379.10，1276.88，1201.65，1157.29，752.24，704.02(苯環(huán))cm^-1。MS(ESI)m/z(％)：398.1[M+H]⁺，420.1[M+Na]⁺，表明化合物分子量為397，與RH-Ile分子量相符。

實施例1超聲法和高壓均質(zhì)法對納米混懸劑的影響

(一)大黃酰異亮氨酸納米混懸劑(RH-Ile-NS)

1)沉淀-超聲法(Precipitation-ultrasonic method，PU method)：稱取RH-Ile 50mg，用甲醇4mL溶解作為油相備用。稱取泊洛沙姆188(Poloxamer，F(xiàn)68)25mg，卵磷脂(Lecithin，LC)25mg于100mL燒杯中，加入純凈水40mL，超聲溶解作為水相。將水相置于冰水浴中，邊攪拌邊勻速(1.0mL/min)逐滴加入油相，分散完全后繼續(xù)攪拌30min，旋蒸除去甲醇。在20000rpm條件下，用高速剪切機剪切3min，靜置10min，消泡后，轉(zhuǎn)移至超聲波細胞粉碎機中，在超聲功率315W條件下，探頭超聲4min(脈沖開2s停2s)，即得。

2)沉淀-高壓均質(zhì)法(High pressure homogenization method，HPH method)：稱取RH-Ile50mg，用甲醇4mL溶解作為油相備用。稱取F68 25mg，LC 25mg于100mL燒杯中，加入純凈水40mL，超聲溶解作為水相。將水相置于冰水浴中，邊攪拌邊勻速(1.0mL/min)逐滴加入油相，分散完全后繼續(xù)攪拌30min，旋蒸除去甲醇。在20000rpm條件下，用高速剪切機剪切3min，靜置10min，消泡后，轉(zhuǎn)移至高壓微射流機中，4660psi均質(zhì)3次，11650psi均質(zhì)20次，即得。

(二)大黃酰苯丙氨酸納米混懸劑(RH-Phe-NS)

1)沉淀-超聲法(Precipitation-ultrasonic method，PU method)：方法同大黃酰異亮氨酸納米混懸劑的沉淀-超聲法。

2)沉淀-高壓均質(zhì)法(High pressure homogenization method，HPH method)：方法同大黃酰異亮氨酸納米混懸劑的沉淀-高壓均質(zhì)法。

(三)測定粒徑和Zeta電位

采用激光粒度儀測定RH-Ile-NS和RH-Phe-NS的粒徑和Zeta電位分布，結(jié)果如表5。

表5超聲法和高壓均質(zhì)法對粒徑、Zeta電位和PDI的影響(Mean±SD，n＝3)

由表5可見，沉淀-高壓均質(zhì)法制備的納米混懸劑粒徑更小且較穩(wěn)定、均一，因此優(yōu)選高壓均質(zhì)法。

實施例2均質(zhì)壓力對納米混懸劑的影響

分別稱取RH-Ile和RH-Phe 50mg，用甲醇4mL溶解作為油相備用。稱取F68 25mg，LC 25mg于100mL燒杯中，加入純凈水40mL，超聲溶解作為水相。將水相置于冰水浴中，邊攪拌邊勻速逐滴加入油相，分散完全后繼續(xù)攪拌30min，旋蒸除去甲醇。在20000rpm條件下，用高速剪切機剪切3min，靜置10min，消泡后，轉(zhuǎn)移至高壓微射流機中，4660psi均質(zhì)3次后，分別于6990psi、9320psi、11650psi、13980psi、16310psi條件下均質(zhì)20次，分別得到RH-Ile-NS和RH-Phe-NS。測定粒徑和Zeta電位，結(jié)果如表6和表7。

表6均質(zhì)壓力對RH-Ile-NS粒徑、Zeta電位和PDI的影響(Mean±SD，n＝3)

表7均質(zhì)壓力對RH-Phe-NS粒徑、Zeta電位和PDI的影響(Mean±SD，n＝3)

由表6和表7可見，對于RH-Ile-NS，隨著均質(zhì)壓力的增大，Zeta電位幾乎沒有變化，說明Zeta電位與均質(zhì)壓力無關(guān)，而粒徑和PDI則表現(xiàn)出遞減趨勢，在13980psi時粒徑最小，當壓力繼續(xù)增加時，粒徑反而變大。當PDI<0.3時，認為粒徑相對比較均一，當均質(zhì)壓力≥11650psi時，PDI均符合要求，其中，均質(zhì)壓力在16310psi時，PDI最小，而研究發(fā)現(xiàn)均質(zhì)壓力在11650psi和13980psi時粒徑相差不大，考慮到儀器的損耗，優(yōu)選，均質(zhì)壓力11650psi。對于RH-Phe-NS，隨著均質(zhì)壓力增大，Zeta電位同樣沒有明顯變化，粒徑表現(xiàn)出遞減趨勢，均質(zhì)壓力16310psi時粒徑最小，但研究發(fā)現(xiàn)PDI只有在均質(zhì)壓力11650psi時符合要求，這可能是由于均質(zhì)壓力過大時，會導致體系中小粒徑部分變得更小，因此PDI變大，體系粒徑差異較大，綜合以上原因，最終選擇均質(zhì)壓力11650psi。

實施例3均質(zhì)次數(shù)對混懸劑的影響

分別稱取RH-Ile和RH-Phe 50mg，用甲醇4mL溶解作為油相備用。另稱取F68 25mg，LC 25mg于100mL燒杯中，加入純凈水40mL，超聲溶解作為水相。將水相置于冰水浴中，邊攪拌邊勻速逐滴加入油相，分散完全后繼續(xù)攪拌30min，旋蒸除去甲醇。在20000rpm條件下，用高速剪切機剪切3min，靜置10min消泡后，轉(zhuǎn)移至高壓微射流中，4660psi均質(zhì)3次后，于11650psi壓力下分別均質(zhì)5次、10次、15次、20次、25次，分別得到RH-Ile-NS和RH-Phe-NS。測定粒徑和Zeta電位，結(jié)果如表8和表9。

表8均質(zhì)次數(shù)對RH-Ile-NS粒徑、Zeta電位和PDI的影響(Mean±SD，n＝3)

表9均質(zhì)次數(shù)對RH-Phe-NS粒徑、Zeta電位和PDI的影響(Mean±SD，n＝3)

由表8和表9可見，對于RH-Ile-NS，隨著均質(zhì)次數(shù)的增加，制劑的粒徑表現(xiàn)出先減小后增大的趨勢，在均質(zhì)20次時粒徑最小，Zeta電位同樣沒有明顯變化，PDI則呈現(xiàn)出遞減趨勢，均質(zhì)25次時PDI最小，但在均質(zhì)次數(shù)≥20次時PDI均小于0.3，綜合考慮，優(yōu)選均質(zhì)20次。對于RH-Phe-NS，隨著均質(zhì)次數(shù)增加，粒徑同樣呈現(xiàn)出先減小后增大的趨勢，在20次時粒徑最小，Zeta電位沒有明顯變化，但總體比RH-Ile-NS的Zeta電位更小，表明RH-Phe-NS的體系可能更穩(wěn)定。PDI隨著均質(zhì)次數(shù)增加先減小后增大，在均質(zhì)20次時達到最小值，綜合考慮，優(yōu)選選擇均質(zhì)20次。

實施例4穩(wěn)定劑對混懸劑的影響

分別稱取RH-Ile和RH-Phe 50mg，用甲醇4mL溶解作為油相備用。按表10和表11稱取穩(wěn)定劑50mg(兩種穩(wěn)定劑則各25mg)于100mL燒杯中，加入純凈水40mL，超聲溶解作為水相。將水相置于冰水浴中，邊攪拌邊勻速逐滴加入油相，分散完全后繼續(xù)攪拌30min，旋蒸除去甲醇。在20000rpm條件下，用高速剪切機剪切3min，靜置10min消泡后，轉(zhuǎn)移至高壓微射流機中，4660psi均質(zhì)3次后，于11650psi壓力下分別均質(zhì)20次，即得RH-Ile-NS和RH-Phe-NS。測定粒徑和Zeta電位，結(jié)果如表10和表11。

表10 RH-Ile-NS處方考察(Mean±SD，n＝3)

表11 RH-Phe-NS處方考察(Mean±SD，n＝3)

由表10和表11可見，采用兩種穩(wěn)定劑混合制得的納米混懸劑粒徑相對更小，更穩(wěn)定一些。對于RH-Ile-NS，同時選用F68和LC作為穩(wěn)定劑時，得到的納米混懸劑粒徑最小，Zeta電位相對穩(wěn)定，PDI<0.3，符合要求；對于RH-Phe-NS，粒徑整體相對于RH-Ile-NS更小，同時選用F68和LC時粒徑同樣表現(xiàn)出最小，Zeta電位絕對值相比于RH-Ile-NS更大，表示體系更穩(wěn)定些，PDI同樣符合要求，因此選用F68和LC作為穩(wěn)定劑。

實施例5 F68和LC的比例對混懸劑的影響

分別稱取RH-Ile和RH-Phe 50mg，用甲醇4mL溶解作為油相備用。按表12和表13稱取F68和LC于100mL燒杯中，加入純凈水40mL，超聲溶解作為水相。將水相置于冰水浴中，邊攪拌邊勻速逐滴加入油相，分散完全后繼續(xù)攪拌30min，旋蒸除去甲醇。在20000rpm條件下，用高速剪切機剪切3min，靜置10min消泡后，轉(zhuǎn)移至高壓微射流中，4660psi均質(zhì)3次后，于11650psi壓力下分別均質(zhì)20次，即得RH-Ile-NS和RH-Phe-NS。測定粒徑和Zeta電位，結(jié)果如12和表13。

表12 RH-Ile-NS處方考察(Mean±SD，n＝3)

表13 RH-Phe-NS處方考察(Mean±SD，n＝3)

由表12和表13可見，分別考察了穩(wěn)定劑F68和LC在15～30mg范圍內(nèi)的用量及二者的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LC的用量比F68的用量對粒徑的影響更大一些，這可能是因為LC的穩(wěn)定作用更強，可以使化合物粒子分散地更均勻穩(wěn)定一些。研究表明，當Zeta電位的絕對值大于20mV時，納米混懸劑具有較好的穩(wěn)定性。當F68和LC都為25mg時，粒徑最小，Zeta電位符合要求，且PDI也均小于0.3，因此最終選擇F68 25mg和LC 25mg作為穩(wěn)定劑。

實施例6大黃酰異亮氨酸納米混懸劑凍干粉和大黃酰苯丙氨酸納米混懸劑凍干粉的制備

稱取適量甘露醇于西林瓶中，分別加入2mL RH-Ile-NS和RH-Phe-NS，輕晃至甘露醇完全溶解后，放入超低溫冰箱，在-80℃條件下預凍48h后取出，放入冷凍干燥機中凍干，通過考察凍干粉的外觀、再分散性以及粒徑確定最終處方，凍干粉復溶后粒徑變化情況見表14。

表14凍干保護劑對粒徑的影響(Mean±SD，n＝3)

表14表明，不添加凍干保護劑直接凍干后，制劑緊貼在西林瓶壁上，加入純凈水超聲復溶，不能夠完全分散，粒徑也最大；添加2.5％甘露醇凍干后，樣品外觀有萎縮，部分結(jié)塊，加入純凈水超聲復溶，能夠分散均勻，但粒徑變化較大；加入5％甘露醇凍干后，樣品質(zhì)地疏松，顏色均一，加入純凈水后超聲片刻即可分散均勻，測定復溶后粒徑變化較小，穩(wěn)定性也較好，因此選擇加入5％甘露醇作為凍干保護劑制備凍干粉。

采用激光粒度儀測定RH-Ile-NS和RH-Phe-NS的凍干前后粒徑及Zeta電位分布，測定結(jié)果如圖2和圖3，結(jié)果顯示，凍干后二者粒徑均增加20～30nm，Zeta電位則無明顯變化。

采用透射電鏡(TEM)測定RH-Ile-NS凍干粉和RH-Phe-NS凍干粉復溶后粒徑，結(jié)果如圖4，二者粒徑均在200nm左右，相差不大，粒子呈球形，彼此之間無黏連，制劑穩(wěn)定性良好。

采用差示量熱掃描儀(DSC)分別測定F68、LC、甘露醇、RH-Ile、RH-Phe、RH-Ile-NS凍干粉、RH-Phe-NS凍干粉以及二者各自的物理混合物，設(shè)定溫度以10℃/min的速度從25℃升到300℃，測定結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，輔料LC不出峰，F(xiàn)68在55.67℃處有吸熱峰，凍干保護劑甘露醇在169.5℃處出現(xiàn)吸熱峰，RH-Ile的吸熱峰在201.33℃，同樣在其物理混合物和RH-Ile-NS中均能夠看到RH-Ile的吸熱峰，以及甘露醇和F68的吸熱峰。在RH-Phe中存在一個184℃的放熱峰和232.33℃的吸熱峰，在其物理混合物和制劑中也同樣能夠看到，說明RH-Ile和RH-Phe制備成納米混懸劑后晶型沒有發(fā)生改變，均為結(jié)晶形。

實施例7 RH-Ile-NS和RH-Phe-NS的體內(nèi)藥動學情況

選取SD大鼠為模型動物，分別灌胃給藥，分析藥時曲線(見圖6、圖7)和藥動學參數(shù)，與RH-Ile混懸液和RH-Phe混懸液的大鼠體內(nèi)藥動學參數(shù)(見表15)進行比較，從而研究制備成納米混懸劑后對原料藥的口服吸收的促進作用。結(jié)果表明，將RH-Ile和RH-Phe制備成納米混懸劑之后，達到了預期的進一步提高生物利用度的目的，并具有緩釋效果，增強了藥效。

表15大鼠口服給予大黃酸酰胺類衍生物和制劑后的藥動學參數(shù)(Mean±SD，n＝6)

Note：*P<0.05 compared with rhein-isoleucine(rhein-phenylalanine)suspensions

**P<0.01compared with rhein-isoleucine(rhein-phenylalanine)suspensions。