本發(fā)明涉及醫(yī)藥，特別是一種小茴香總黃酮在制備治療絕經(jīng)前綜合征藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小茴香為植物的干燥成熟果實(shí)，味辛，性溫。歸肝、腎、脾、胃經(jīng)。有散寒止痛，理氣和胃的功效。鹽小茴香有暖腎散寒止痛的功效。用于寒疝腹痛，睪丸偏墜，痛經(jīng)，少腹冷痛，脘腹脹痛，食少吐瀉。鹽小茴香用于寒疝腹痛，睪丸偏墜，經(jīng)寒腹痛。
絕經(jīng)前綜合征是指婦女絕經(jīng)前出現(xiàn)性激素波動(dòng)或減少所致的一系列軀體及精神心理癥狀。絕經(jīng)(menopause)分為自然絕經(jīng)和人工絕經(jīng)。自然絕經(jīng)指卵巢內(nèi)卵泡生理性耗竭所致的絕經(jīng)；人工絕經(jīng)指兩側(cè)卵巢經(jīng)手術(shù)切除或受放射治療所致的絕經(jīng)。人工絕經(jīng)患者更易發(fā)生絕經(jīng)前綜合征，臨床癥狀表現(xiàn)為：月經(jīng)紊亂，常出現(xiàn)如心悸、眩暈、頭痛、失眠、耳鳴等自主神經(jīng)失調(diào)癥狀，注意力不易集中，并且情緒波動(dòng)大。表現(xiàn)為激動(dòng)易怒、焦慮不安或情緒低落、抑郁、不能自我控制等情緒癥狀，記憶力減退也較常見，影響著患者的身體健康和生活質(zhì)量。
現(xiàn)雖有治療絕經(jīng)前綜合征的多種藥物，但至今未見有從小茴香中提取的小茴香總黃酮在制備治療絕經(jīng)前綜合征藥物中的應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種小茴香總黃酮在制備治療絕經(jīng)前綜合征藥物中的應(yīng)用，可有效解決小茴香總黃酮作為唯一活性成分在制備絕經(jīng)前綜合征藥物中的應(yīng)用問題。
本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，將小茴香粉碎成粗粉，先石油醚回流提取，脫脂；小茴香藥渣揮干石油醚，加乙醇浸泡，回流提取，過濾，減壓回收乙醇至無醇味，加蒸餾水分散，得藥液；藥液上AB-8型大孔吸附樹脂，先用蒸餾水洗脫，棄去水洗脫液；再用質(zhì)量濃度10％乙醇洗脫，棄去洗脫液；再用質(zhì)量濃度80％乙醇洗脫，收集80％乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至無醇味，冷凍干燥，粉碎，得小茴香總黃酮。
本發(fā)明制備的小茴香總黃酮作為唯一活性成分在制備治療絕經(jīng)前綜合征藥物中的應(yīng)用，原料豐富，制備方法簡(jiǎn)單，易操作，生產(chǎn)效率高，有效用于制備治療絕經(jīng)前綜合征的藥物，開拓了小茴香的新用途，是中藥上的創(chuàng)新，有顯著的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體情況對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說明。
本發(fā)明在具體實(shí)施中，小茴香總黃酮作為唯一活性部位(成分)在制備治療絕經(jīng)前綜合征藥物中的應(yīng)用，該小茴香總黃酮是將小茴香粉碎成過20-30目篩的粗粉，先加粗粉10倍重量的石油醚回流提取1h，脫脂，小茴香藥渣揮干石油醚，加粗粉10倍重量、質(zhì)量濃度80％乙醇浸泡0.5h，回流提取1h，過濾，得第一次濾液；藥渣再加粗粉10倍重量、質(zhì)量濃度80％乙醇回流提取1h，過濾，得第二次濾液，合并兩次濾液，減壓回收乙醇至無醇味，加蒸餾水分散至相當(dāng)于含生藥量0.3g/ml，得藥液；藥液上AB-8型大孔吸附樹脂，先用2倍柱體積蒸餾水洗脫，棄去水洗脫液；再用4倍柱體積的質(zhì)量濃度10％乙醇洗脫，棄去洗脫液；再用6倍柱體積的質(zhì)量濃度80％乙醇洗脫，收集80％乙醇洗脫液，減壓回收乙醇至無醇味，冷凍干燥，粉碎，得小茴香總黃酮。
本發(fā)明經(jīng)試驗(yàn)，小茴香總黃酮作為唯一活性成分，可有效用于制備治療絕經(jīng)前綜合征的藥物，有關(guān)試驗(yàn)資料如下：
1實(shí)驗(yàn)材料
1.1藥品試劑
本發(fā)明小茴香總黃酮，含量>56％；更年安膠囊(地黃、熟地黃、澤瀉、麥冬、玄參、牡丹皮、茯苓、珍珠母、仙茅、五味子、磁石、首烏藤、鉤藤、浮小麥、制何首烏)，滋陰潛陽，除煩安神；用于圍絕經(jīng)期潮熱汗出，眩暈耳鳴，煩躁失眠。規(guī)格：每粒裝0.3g；用法用量：口服，一次3粒，一日3次)，山西黃河中藥有限公司。大鼠E2檢測(cè)試劑盒，R&D公司；注射用青霉素鈉，華北制藥股份有限公司，規(guī)格：400萬單位；甲醛溶液(分析純)，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；0.9％氯化鈉注射液，河南科倫藥業(yè)有限公司；水合氯醛：天津市光復(fù)精密化工研究所；酒精：新鄉(xiāng)市三偉消毒制劑有限公司。
1.3實(shí)驗(yàn)儀器
TDZ4-WS臺(tái)式低速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；BIORAD-680酶標(biāo)儀，680Microplate Reader，Bio-Rad Laboratories；BX61電動(dòng)顯微鏡，日本OLYMPUS公司；手動(dòng)移液器，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司，型號(hào)：JZ19600；
HHS-21-8型電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BCD-248T型冰箱，新飛電器有限公司；JM 1000電子秤，余姚記銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司；
AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。
1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
清潔級(jí)小鼠，昆明種，雌性，18－22g，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司,動(dòng)物合格證號(hào)37005400000020；實(shí)驗(yàn)室合格證號(hào)SYXK(豫)2010-001。
2實(shí)驗(yàn)方法
2.1造模與給藥
造模方法：取昆明種小鼠70只，雌性，22～25g，隨機(jī)取60只小鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉50mg/kg麻醉后腹位固定，然后從小鼠背部最末肋骨下，在腋中線和距脊柱外側(cè)約1cm交叉處剪毛，消毒后切開皮膚和背肌約0.5～1cm，切口視野中可見一乳白色發(fā)亮的脂肪團(tuán)，卵巢即包埋其中。用小鑷子輕輕夾住脂肪團(tuán)拉出切口外，分離脂肪團(tuán)，即可見到一團(tuán)細(xì)線狀不規(guī)則呈黃紅色的卵巢。剪取時(shí)先將卵巢下輸卵管(包括脂肪)用細(xì)線結(jié)扎，再摘除卵巢，術(shù)后順勢(shì)將子宮角放回腹腔中，縫合肌肉及皮膚，同法摘除雙側(cè)卵巢。另取10只小鼠為空白對(duì)照組，按上法做手術(shù)，但不切除卵巢。術(shù)后精心飼養(yǎng)，肌肉注射青霉素預(yù)防感染，連續(xù)3d。手術(shù)5d后開始做手術(shù)小鼠逐只進(jìn)行大鼠陰道涂片檢查，每天1次，連續(xù)5d，以確定卵巢是否完全切除。涂片呈現(xiàn)動(dòng)情反應(yīng)的動(dòng)物棄去不用，選擇60只去勢(shì)完全的動(dòng)物隨機(jī)均勻分為5組。分別為模型組，更年安膠囊組，大、小劑量小茴香總黃酮組，單做手術(shù)不切除卵巢的為空白對(duì)照組。
給藥方法：將CMC-Na溶解于煮沸的蒸餾水中，制成0.5％的溶液做為溶媒，將以下各藥物混懸其中。取小茴香總黃酮大、小劑量：20mg·mL-1、10mg·mL-1，按400mg·kg-1、200mg·kg-1灌胃；更年安膠囊：33.75mg·mL-1，按675mg·kg-1灌胃(相當(dāng)于臨床用量的15倍)灌胃；模型組和空白組給予同體積的CMC-Na溶液，給藥體積均為0.2mL/10g，每天1次，連續(xù)3周。
2.2觀察項(xiàng)目及檢測(cè)方法
各組小鼠末次灌胃后2h(禁食15小時(shí))，眶靜脈取血，分離血清，采用放射免疫法測(cè)定血清中E2、LH、FSH的含量；解剖小鼠，摘除胸腺、脾臟、子宮組織，稱量其濕重并計(jì)算臟器指數(shù)(臟器指數(shù)＝臟器濕重mg/大鼠體重g)；將子宮固定于10％福爾馬林溶液中，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察各組的組織形態(tài)學(xué)變化。
雌二醇的測(cè)定方法
測(cè)定原理：本實(shí)驗(yàn)采用放射免疫分析方法。先將校準(zhǔn)品或樣品、標(biāo)記物和抗體按程序規(guī)定依次加入試管中，使標(biāo)記和非標(biāo)記抗原與有限量抗體互相競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，待反應(yīng)平衡后，加入分離劑，離心沉淀，使游離抗原與抗原抗體復(fù)合物分離，測(cè)量沉淀物的放射性強(qiáng)度。隨E2含量增加，其放射性強(qiáng)度則相應(yīng)降低。
校準(zhǔn)試劑：125I-E2，1瓶(紅色液體)；
抗體，1瓶(藍(lán)色液體)；
校準(zhǔn)品，7瓶(液體)，濃度為0、10、50、100、250、750、2000pg/mL；
分離劑，1瓶(懸浮液)用前搖勻；
質(zhì)控血清，2瓶(液體)，含低、高兩個(gè)劑量。
操作程序：將圓底聚苯乙烯試管編號(hào)(按復(fù)管操作)，按下表程序操作
加樣測(cè)定程序表 單位：μL
數(shù)據(jù)處理：以γ計(jì)數(shù)儀預(yù)先編制的程序直接給出有關(guān)參數(shù)、校準(zhǔn)曲線及樣品濃度。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1對(duì)圍絕經(jīng)期模型小鼠臟器指數(shù)的影響
小茴香總黃酮對(duì)圍絕經(jīng)前綜合征模型小鼠胸腺、脾臟、子宮指數(shù)的影響見表1。
表1小茴香總黃酮對(duì)圍絕經(jīng)前綜合征模型小鼠胸腺、脾臟、子宮指數(shù)的影響
注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01
從上表可看出，與空白對(duì)照組比，模型組小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和子宮指數(shù)均顯著降低(P<0.01)，說明摘除卵巢導(dǎo)致圍絕經(jīng)期模型小鼠胸腺、脾臟及子宮的萎縮。與模型組比，小茴香總黃酮大劑量組和更年安膠囊組均可顯著提高模型小鼠胸腺指數(shù)(P<0.01)、小茴香總黃酮小劑量組可明顯提高模型小鼠胸腺指數(shù)(P<0.05)；小茴香總黃酮大、小劑量組和更年安膠囊組均可顯著提高模型小鼠脾臟指數(shù)(P<0.01)；小茴香總黃酮大劑量組和更年安膠囊組可顯著提高模型小鼠子宮指數(shù)(P<0.01)。
3.2對(duì)圍絕經(jīng)期模型小鼠E2水平的影響
小茴香總黃酮對(duì)圍絕經(jīng)前綜合征模型小鼠血清E2水平的影響見表2。
表2小茴香總黃酮對(duì)圍絕經(jīng)前綜合征模型小鼠血清E2水平的影響
注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01
從上表可看出，與空白對(duì)照組比，模型組小鼠血清中E2水平顯著下降(P<0.01)，說明摘除卵巢導(dǎo)致圍絕經(jīng)期模型小鼠血清中的性激素水平紊亂，圍絕經(jīng)期小鼠模型復(fù)制成功。與模型組比，小茴香總黃酮大、小劑量組和更年安膠囊組均可顯著提高模型小鼠血清E2水平(P<0.01)。
3.3對(duì)圍絕經(jīng)期模型小鼠子宮組織形態(tài)的影響
空白組小鼠子宮黏膜層、肌層、漿膜層正常，黏膜層中上皮細(xì)胞、粘膜腺均正常。模型組小鼠子宮黏膜層、肌層、漿膜層明顯萎縮，黏膜層中上皮細(xì)胞、粘膜腺均出現(xiàn)萎縮并減少。更年安膠囊組小鼠子宮黏膜層、肌層、漿膜層得到一定程度的恢復(fù)，黏膜層中上皮細(xì)胞、粘膜腺也得到一定恢復(fù)。小茴香總黃酮大劑量組小鼠子宮黏膜層、肌層及漿膜層明顯得到恢復(fù)，黏膜層中上皮細(xì)胞、粘膜腺明顯恢復(fù)。小茴香總黃酮小劑量組小鼠子宮黏膜層、肌層及漿膜層稍有恢復(fù)，黏膜層中上皮細(xì)胞、粘膜腺稍有恢復(fù)。
采用測(cè)微尺測(cè)定子宮內(nèi)膜和肌層厚度的最寬處及最窄處，求均數(shù)，用計(jì)數(shù)方法，計(jì)算內(nèi)膜中腺體數(shù)量，求均數(shù)，測(cè)的結(jié)果見表3。
表3小茴香總黃酮對(duì)圍絕經(jīng)前綜合征模型小鼠子宮內(nèi)膜、肌層和內(nèi)膜中腺體的影響
注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01
從上表可看出，與空白對(duì)照組比，模型組小鼠子宮內(nèi)膜厚度、肌層厚度顯著減少(P<0.01)，腺體個(gè)數(shù)顯著降低(P<0.01)，說明小鼠造圍絕經(jīng)期模型后子宮萎縮，腺體減少。與模型組比，小茴香總黃酮大劑量組和更年安膠囊組均可顯著增加模型小鼠子宮內(nèi)膜厚度(P<0.01)，可顯著增加模型小鼠子宮肌層厚度(P<0.01)，可顯著增加模型小鼠子宮內(nèi)膜中腺體數(shù)量(P<0.01)。
應(yīng)有本品用于治病治療絕經(jīng)前綜合征的藥物(膠囊)，并經(jīng)臨床診斷確準(zhǔn)的68例輕度絕經(jīng)前綜合征患者臨床應(yīng)用，取得了顯著的臨床效果?；颊呙咳辗?次，每次2-3粒，每粒含小茴香總黃酮0.5g，每月1個(gè)療程，連用2個(gè)療程。除2人外，臨床癥狀消失或臨床癥狀有明顯改善或改善者66人，有效率高達(dá)97.1％。效果之好是未曾料到的，是治療絕經(jīng)前綜合征藥物上的創(chuàng)新，開拓了小茴香的新用途，經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益顯著。