本發(fā)明涉及一種淫羊藿總黃酮酶解產(chǎn)物，該產(chǎn)物是將淫羊藿總黃酮通過固定化蝸牛酶酶解產(chǎn)生的。本發(fā)明還涉及該酶解產(chǎn)物的制備方法和在抗腫瘤方面的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

淫羊藿作為傳統(tǒng)的補(bǔ)腎中藥，在民間沿用已有千年歷史，具有補(bǔ)腎陽，強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的作用，臨床常用于治療陽痿遺精，筋骨萎軟，風(fēng)濕痹痛等癥。

淫羊藿主要含有黃酮類成分，主要有淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B，朝藿定C和寶藿苷I等黃酮苷(結(jié)構(gòu)見圖1)?，F(xiàn)代藥理研究表明，淫羊藿黃酮苷具有很好的生物活性，除具有抗骨質(zhì)疏松活性外，還具有很好的抗腫瘤作用。文獻(xiàn)報(bào)道淫羊藿黃酮類成分對呼吸道系統(tǒng)肺癌腫瘤、對消化系統(tǒng)肝癌和胃癌、對血液系統(tǒng)白血病細(xì)胞具有一定的殺傷能力，能夠控制腫瘤細(xì)胞的生長，促使腫瘤細(xì)胞的死亡，抑制腫瘤血管形成、并可以有效地調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)特異、非特異的免疫細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，從而起到抗腫瘤作用。

本課題組前期研究表明，口服淫羊藿黃酮苷，原型吸收較少，需要經(jīng)過腸道酶腸道菌的水解，以次級苷或苷元的形式被吸收而發(fā)揮療效。因此在體外尋找將淫羊藿黃酮苷適宜酶解的方法，獲得活性較高且易于吸收的次級苷，對進(jìn)一步研發(fā)具有較好抗腫瘤作用的新藥應(yīng)用于臨床具有重要意義。目前，已有較多關(guān)于體外酶解淫羊藿黃酮原型苷的研究，但這些方法多是利用游離酶酶解淫羊藿苷，如利用β-葡萄糖苷酶、纖維素酶、蝸牛酶或曲霉屬霉菌產(chǎn)生的誘導(dǎo)酶轉(zhuǎn)化淫羊藿苷的研究。但游離酶對反應(yīng)體系的微環(huán)境十分敏感，任何pH、溫度的改變均會(huì)使其活性受到影響，并且難于循環(huán)使用、花費(fèi)代價(jià)高，不利于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。由于淫羊藿中除了含有淫羊藿苷成分外，還含有另外三種含量較多的黃酮類成分：朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C。因此，單純從淫羊藿藥材中提取淫羊藿苷再進(jìn)行酶解，不僅需要繁瑣的分離提純步驟，而淫羊藿藥材中的有效成分不能充分利用，不利于中藥資源的合理化應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種淫羊藿總黃酮酶解產(chǎn)物，該產(chǎn)物是將淫羊藿總黃酮通過固定化蝸牛酶酶解產(chǎn)生的，該酶解產(chǎn)物具有比淫羊藿總黃酮原型及游離酶酶解產(chǎn)物更好的抗腫瘤活性，且具有較好的口服吸收性，提高了對淫羊藿有效成分的利用率，實(shí)現(xiàn)了藥材資源的綜合利用，并且產(chǎn)物制備所用的固定化酶能夠循環(huán)使用，可節(jié)約資源，實(shí)現(xiàn)綠色生產(chǎn)。

針對上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

一種淫羊藿總黃酮酶解產(chǎn)物，所述酶解產(chǎn)物通過固定化蝸牛酶酶解淫羊藿總黃酮獲取，所述蝸牛酶由氨基介孔硅固定。

其中，所述淫羊藿總黃酮的制備方式為：將淫羊藿用6～40(m/v)倍量40％～90％乙醇采用熱回流提取后濃縮，經(jīng)大孔吸附樹脂法進(jìn)一步純化，得到質(zhì)量含量不低于60％的淫羊藿總黃酮。其中，淫羊藿總黃酮中淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和寶藿苷Ⅰ的總質(zhì)量含量不低于30％(HPLC測得)。

一種優(yōu)選的氨基介孔硅的制備方法為：將二氧化硅浸入溶有3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯中，磁力攪拌800r·min^-1，在90℃高溫下，反應(yīng)12h；取出反應(yīng)物，在甲苯中超聲洗滌10min，在60℃下真空干燥2h。

進(jìn)一步的，所述蝸牛酶的固定方法為：將蝸牛酶和氨基介孔硅載體置于pH 5.0磷酸緩沖鹽溶液中反應(yīng)，室溫下磁力攪拌反應(yīng)；之后蒸餾水洗滌后干燥保存。

其中，所述蝸牛酶與氨基介孔硅載體用量為質(zhì)量比1：1～1：4，優(yōu)選1：1。蝸牛酶與氨基介孔硅的結(jié)合效率在質(zhì)量比1：1～1：4間遞增，質(zhì)量比1：4時(shí)蝸牛酶與介孔硅的結(jié)合效率達(dá)到最大，可達(dá)到90％以上，但考慮制備成本，最終選擇蝸牛酶與介孔硅的質(zhì)量比為1：1，既減少了介孔硅載體的用量，也可保持有效的結(jié)合效率，在此條件下，蝸牛酶與氨基介孔硅的結(jié)合效率可達(dá)到89.63％。

進(jìn)一步的，酶解條件優(yōu)選為：氨基介孔硅固定化蝸牛酶和淫羊藿總黃酮加入含有40％體積分?jǐn)?shù)DMSO的緩沖鹽溶液中，緩沖鹽溶液pH 5.0，氨基介孔硅固定化蝸牛酶和淫羊藿總黃酮質(zhì)量比為1：1，在50℃溫度條件下反應(yīng)，反應(yīng)2h。

本發(fā)明所述酶解產(chǎn)物中幾乎沒有淫羊藿苷元，其酶解產(chǎn)物主要由箭藿苷A；箭藿苷B；鼠李糖基淫羊藿次苷II；寶藿苷I組成；其組成比例約為箭藿苷A：箭藿苷B：鼠李糖基淫羊藿次苷II：寶藿苷I為1.5：2.0：1.0：5.8。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種淫羊藿總黃酮酶解方法，具體技術(shù)方案為，采用固定化蝸牛酶酶解淫羊藿總黃酮，其中所述蝸牛酶的固定載體選用氨基介孔硅。

采用本發(fā)明所述的固定化蝸牛酶方法酶解淫羊藿總黃酮，蝸牛酶和載體的結(jié)合效率高，反應(yīng)的適宜pH范圍增寬，對反應(yīng)溫度也具有更好的適應(yīng)性，穩(wěn)定性好，并且酶解轉(zhuǎn)化率高。

此外，本發(fā)明進(jìn)一步要求保護(hù)上述淫羊藿總黃酮酶解產(chǎn)物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的固定化蝸牛酶對淫羊藿總黃酮酶解產(chǎn)物，比淫羊藿總黃酮原型及游離酶酶解產(chǎn)物具有更好的抗腫瘤活性，且具有較好的口服吸收性。

采用本發(fā)明所述氨基介孔硅固定化蝸牛酶方法酶解淫羊藿總黃酮，固定化酶不僅保留了游離酶的優(yōu)點(diǎn)，還具有易于與底物分離，便于回收重復(fù)再利用，適宜的反應(yīng)條件范圍寬，可降低生產(chǎn)成本、適宜工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)勢。并且蝸牛酶和氨基介孔硅載體的結(jié)合效率高，穩(wěn)定性好，并且酶解轉(zhuǎn)化率高。另外，本發(fā)明還實(shí)現(xiàn)了對淫羊藿中除淫羊藿苷以外的黃酮類成分的有效利用，提取淫羊藿中的總黃酮成分進(jìn)行酶解，提高了淫羊藿藥材有效成分利用率，實(shí)現(xiàn)了藥材資源的綜合利用。更重要的是，淫羊藿總黃酮經(jīng)氨基介孔硅固定蝸牛酶酶解產(chǎn)物比原型化合物及經(jīng)游離酶酶解的產(chǎn)物具有更好的抗腫瘤活性，以此為原料研發(fā)抗腫瘤新藥具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為淫羊藿總黃酮所含主要黃酮及酶解產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為氨基介孔硅固定化蝸牛酶的SEM表征示意圖(放大倍數(shù)為8.1mm×50.0k)；

圖3為氨基介孔硅固定化蝸牛酶相對酶活和轉(zhuǎn)化率隨溫度變化示意圖；其中，A為相對酶活，B為轉(zhuǎn)化率，(n＝3，^*P<0.05，^**P<0.01)；

圖4為氨基介孔硅固定化蝸牛酶相對酶活和轉(zhuǎn)化效率隨貯藏時(shí)間變化示意圖；其中A為相對酶活；B為轉(zhuǎn)化率(n＝3)；

圖5為氨基介孔硅固定化蝸牛酶酶解淫羊藿總黃酮最適反應(yīng)條件考察示意圖；其中，A為以酶活為指標(biāo)的最適反應(yīng)pH；B為以轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)的最適反應(yīng)pH；C為以酶活為指標(biāo)的最適反應(yīng)溫度；D為以轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)的最適反應(yīng)溫度；E為以酶活為指標(biāo)的最適酶與底物質(zhì)量比；F為以轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)的最適酶與底物質(zhì)量比；

圖6為淫羊藿總黃酮及其酶解產(chǎn)物的HPLC圖譜；其中，A為混合對照品溶液；B為淫羊藿總黃酮酶解產(chǎn)物，其中1為游離蝸牛酶酶解總黃酮產(chǎn)物，2為氨基介孔硅固定化蝸牛酶酶解總黃酮產(chǎn)物；a.朝藿定A；b.朝藿定B；c.朝藿定C；d.淫羊藿苷；e.箭藿苷A；f.箭藿苷B；g.鼠李糖基淫羊藿次苷II；h.寶藿苷I；i.淫羊藿苷元；

圖7為淫羊藿總黃酮及其固定化酶酶解產(chǎn)物對A549、HepG2、MCF-7、Hela細(xì)胞作用48h的抑制率比較示意圖；其中，A為A549細(xì)胞；B為HepG2細(xì)胞；C為MCF-7細(xì)胞；D為Hela細(xì)胞；(n＝6，^*P<0.05，^**P<0.01)；

圖8為游離酶和固定化酶酶解淫羊藿總黃酮的產(chǎn)物對A549、HepG2、MCF-7、Hela細(xì)胞作用48h的抑制率比較示意圖；其中，A為MCF-7細(xì)胞；B為Hela細(xì)胞；C為HepG2細(xì)胞；D為A549細(xì)胞；(n＝6，^*P<0.05，^**P<0.01)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的范圍并不受這些實(shí)例的任何限制。

本發(fā)明實(shí)施例中所選用的水解酶信息：蝸牛酶(>300U/mg，上海源葉生物科技有限公司)，除特殊說明外，本發(fā)明所用的各種原料/制劑均為市售的已知產(chǎn)品。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供一種采用本發(fā)明方法酶解淫羊藿總黃酮的優(yōu)選方式，對本發(fā)明酶解方法做進(jìn)一步具體描述。

1.淫羊藿總黃酮的制備

將淫羊藿用6～40(m/v)倍量40％～90％乙醇采用熱回流提取后濃縮，經(jīng)大孔吸附樹脂法進(jìn)一步純化，得到質(zhì)量含量不低于60％的淫羊藿總黃酮。

淫羊藿總黃酮主要成分為淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和寶藿苷I，并且淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和寶藿苷I總質(zhì)量含量不低于30％。

2.氨基介孔硅載體的制備及表征

將二氧化硅浸入溶有3-氨丙基三乙氧基硅烷(C＝50mM)的甲苯中，磁力攪拌800r·min^-1，在90℃高溫下，反應(yīng)12h。取出反應(yīng)物，在甲苯中，超聲洗滌10min，在60℃下，真空干燥2h，即得氨基介孔硅樣品，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

采用Hitachi S-3400掃描電子顯微鏡(SEM)觀察氨基介孔硅固定化酶的表面結(jié)構(gòu)。取氨基介孔硅樣品粉末用固體導(dǎo)電膠帶固定，鍍金后，工作電壓15kV，于真空條件下進(jìn)行表征，見圖2。制備所得的氨基介孔硅肉眼觀察，外觀為白色均一粉末。(SEM)觀察制備的氨基介孔硅外觀圓整，表面具有較多的空隙結(jié)構(gòu)，氨基介孔硅的多孔結(jié)構(gòu)孔徑較為均一，利于提高酶的固定效率。

3.氨基介孔硅固定化蝸牛酶的制備

按照1：1的質(zhì)量比稱取蝸牛酶與氨基介孔硅載體適量置于錐形瓶中，于pH 5.0磷酸緩沖鹽溶液中反應(yīng)，室溫下磁力攪拌500r·min^-1，反應(yīng)10h。然后蒸餾水洗滌3～5次，于37℃條件下真空干燥，即得氨基介孔硅固定化蝸牛酶，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

4.氨基介孔硅固定化蝸牛酶酶學(xué)性質(zhì)的測定

(1)氨基介孔硅固定化蝸牛酶熱穩(wěn)定性的測定

稱取適量游離及氨基介孔硅固定化蝸牛酶置于不同溫度(50、60、70、80、90、100℃)條件下放置1h后，然后在溫度為50℃和pH為5.0的條件下，底物濃度0.5mg·mL^-1，酶與底物質(zhì)量比均為1：1，酶解淫羊藿總黃酮，反應(yīng)1h后取樣，加入甲醇終止反應(yīng)，HPLC測定，結(jié)果見圖3。氨基介孔硅固定化酶的酶活均高于游離酶，在極端溫度條件下，二者有顯著性差異，氨基介孔硅固定化蝸牛酶的熱穩(wěn)定性高于游離蝸牛酶。

(2)氨基介孔硅固定化蝸牛酶重復(fù)利用性的測定

稱取適量氨基介孔硅固定化蝸牛酶在溫度為50℃和pH為5.0的條件下，底物濃度0.5mg·mL^-1，酶與底物質(zhì)量比均為1：1，酶解淫羊藿總黃酮，反應(yīng)1h后取樣，加入甲醇終止反應(yīng)，HPLC測定。將上述氨基介孔硅固定化蝸牛酶從酶解體系中分離，蒸餾水充分洗滌3次后，在相同的條件下反應(yīng)，HPLC測定，重復(fù)上述步驟，考察使用次數(shù)對氨基介孔硅固定化蝸牛酶酶活的影響。在重復(fù)利用氨基介孔硅固定化蝸牛酶5次后，其酶活力依舊可保持在60％以上；與游離酶相比，氨基介孔硅固定化酶具有較好的可重復(fù)利用性，降低了生產(chǎn)成本。

(3)氨基介孔硅固定化蝸牛酶貯藏穩(wěn)定性的測定

將氨基介孔硅固定化蝸牛酶置于4℃條件下保存，每周取樣1次，按照上述條件轉(zhuǎn)化淫羊藿總黃酮，HPLC測定，計(jì)算固定化蝸牛酶的酶活，連續(xù)測定6周，考察氨基介孔硅固定化蝸牛酶的貯藏穩(wěn)定性，結(jié)果見圖4。氨基介孔硅固定化蝸牛酶在4℃條件下保存6周后，酶活力仍可保留約80％，具有較好的貯藏穩(wěn)定性。

5.氨基介孔硅固定化蝸牛酶酶解淫羊藿總黃酮

(1)最適反應(yīng)pH考察

稱取適量游離及氨基介孔硅固定化蝸牛酶，在50℃溫度條件下，分別于不同pH值(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)條件的磷酸鹽緩沖液中酶解淫羊藿總黃酮，底物濃度為0.5mg·mL^-1，酶與底物質(zhì)量比為1：1，反應(yīng)1h后取樣，均加入甲醇終止反應(yīng)，HPLC測定，結(jié)果見圖5(A，B)。游離和氨基介孔硅固定化蝸牛酶的酶活及酶解效率均隨pH的增大而變化，呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢；游離蝸牛酶酶解淫羊藿總黃酮提取物的最適反應(yīng)pH為6.0，此時(shí)其酶活及酶解淫羊藿總黃酮提取物的效率均最大；氨基介孔硅固定化蝸牛酶酶解淫羊藿總黃酮提取物的最適反應(yīng)pH為5.0，此時(shí)其酶活及酶解淫羊藿總黃酮提取物的效率均最大。另外，在極端pH條件下，氨基介孔硅固定化蝸牛酶的酶活及酶解效率均明顯的高于游離蝸牛酶，表明蝸牛酶經(jīng)固定化后，酶反應(yīng)的適宜pH值范圍變寬。

(2)最適反應(yīng)溫度考察

稱取適量游離及氨基介孔硅固定化蝸牛酶，在pH值為5.0的磷酸鹽緩沖液中，分別于4、25、37、50、60、70℃溫度條件下酶解淫羊藿總黃酮，底物濃度為0.5mg·mL^-1，酶與底物質(zhì)量比均為1:1，反應(yīng)1h后取樣，均加入甲醇終止反應(yīng)，HPLC測定，結(jié)果見圖5(C，D)。游離和氨基介孔硅固定化蝸牛酶的酶活及酶解效率均隨溫度的增大而變化，呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢；游離和氨基介孔硅固定化蝸牛酶在50℃條件下酶解淫羊藿總黃酮提取物時(shí)，二者的酶活及酶解效率均最高，因此，二者酶解淫羊藿總黃酮提取物的最適反應(yīng)溫度均為50℃。與游離蝸牛酶相比，氨基介孔硅固定化蝸牛酶在不同反應(yīng)溫度下酶活及酶解效率變化較小，在25、37、60、70℃條件下，其酶活和酶解效率均明顯高于游離蝸牛酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蝸牛酶經(jīng)固定化后更適合用于不同溫度條件下的各種酶解轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

(3)最適底物比考察

稱取適量游離及氨基介孔硅固定化蝸牛酶，在最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH值條件下酶解淫羊藿總黃酮，底物濃度為0.5mg·mL^-1，酶與底物質(zhì)量比分別為1：2，1：1，2：1，3：1，4：1，反應(yīng)1h后取樣，均加入甲醇終止反應(yīng)，HPLC檢測，結(jié)果見圖5(E，F(xiàn))。游離蝸牛酶在與淫羊藿總黃酮質(zhì)量比為1：2時(shí)，酶活及酶解效率均最高，隨著酶與淫羊藿總黃酮質(zhì)量比的增加，其酶活及酶解效率逐漸降低；氨基介孔硅固定化蝸牛酶在與淫羊藿總黃酮質(zhì)量比為1：1時(shí)，酶活及酶解效率最高。因此，游離蝸牛酶酶解淫羊藿總黃酮的最適酶與底物質(zhì)量比為1：2，氨基介孔硅固定化蝸牛酶酶解淫羊藿總黃酮提取物的最適酶與底物質(zhì)量比為1：1。

6.氨基介孔硅固定化蝸牛酶在不同反應(yīng)體系中酶解淫羊藿總黃酮

由于淫羊藿總黃酮在水相反應(yīng)體系中的溶解度較差，反應(yīng)體系中析出的淫羊藿總黃酮不利于轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進(jìn)行，因此，我們利用氨基介孔硅固定化蝸牛酶在由DMSO(有機(jī)相)和pH5.0的磷酸緩沖鹽水溶液(水相)組成的雙相體系中酶解淫羊藿總黃酮提取物。不同的體系中DMSO的體積分?jǐn)?shù)為0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，將淫羊藿總黃酮提取物溶于上述體系中至飽和，考察不同體系中淫羊藿總黃酮提取物溶解的最大量和不同體系中氨基介孔硅固定化蝸牛酶轉(zhuǎn)化淫羊藿總黃酮的情況。結(jié)果見表1(n＝3)，氨基介孔硅固定化蝸牛酶轉(zhuǎn)化淫羊藿總黃酮的最適雙相體系為40％的DMSO(有機(jī)相)和60％的pH 5.0磷酸鹽緩沖溶液(水相)。在此最適雙相體系中，淫羊藿總黃酮在體系中的濃度比單純水相明顯增大，同時(shí)，氨基介孔硅固定化蝸牛酶可以保持有效的酶活力為87.86±3.09％。

表1氨基介孔硅固定化蝸牛酶雙相反應(yīng)體系的優(yōu)化

7.氨基介孔硅固定化蝸牛酶在雙相體系中酶解淫羊藿總黃酮的穩(wěn)定性

氨基介孔硅固定化蝸牛酶和淫羊藿總黃酮提取物加入由40％DMSO和60％pH 5.0的緩沖鹽溶液組成的雙相反應(yīng)體系中，二者質(zhì)量比為1:1。在50℃溫度條件下反應(yīng)，分別于反應(yīng)1h和2h取樣測定，重復(fù)三次，測定反應(yīng)穩(wěn)定性。反應(yīng)1h后，淫羊藿總黃酮酶解產(chǎn)物的生成率為54.71±0.62％(n＝3)，反應(yīng)2h后，淫羊藿總黃酮酶解產(chǎn)物的生成率為84.30±0.98％(n＝3)。測定結(jié)果穩(wěn)定可靠，氨基介孔硅固定化蝸牛酶在最適雙相體系中的反應(yīng)穩(wěn)定性良好。

8.淫羊藿總黃酮酶解產(chǎn)物的HPLC測定

稱取適量游離及氨基介孔硅固定化蝸牛酶，在50℃溫度條件下，分別于pH 6.0和5.0的磷酸鹽緩沖液中酶解淫羊藿總黃酮，底物濃度為0.5mg·mL^-1，酶與底物質(zhì)量比分別為1：2和1：1，反應(yīng)2h后加入甲醇終止反應(yīng)，渦旋后離心取上清液，濾過，即得供試品溶液，HPLC測定圖譜見圖6。結(jié)果表明，游離蝸牛酶和氨基介孔硅固定化蝸牛酶酶解淫羊藿總黃酮所得產(chǎn)物的組成和比例存在顯著差異，其中，轉(zhuǎn)化生成的箭藿苷A、箭藿苷B和鼠李糖基淫羊藿次苷II無明顯差異，二者轉(zhuǎn)化主要不同之處為寶藿苷和淫羊藿苷元的比例。游離蝸牛酶的淫羊藿總黃酮酶解產(chǎn)物主要由箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷II、寶藿苷I和淫羊藿苷元組成，其比例為1.2：2.1：1.0：2.6：3.0；而氨基介孔硅固定化蝸牛酶的淫羊藿總黃酮酶解產(chǎn)物沒有淫羊藿苷元，主要由箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷II和寶藿苷I組成，其比例為1.5：2.0：1.0：5.8。

實(shí)施例2

本實(shí)施例說明采用其他固定載體酶解淫羊藿總黃酮的酶解效果。

本實(shí)施例對比了采用海藻酸鋇、微球和實(shí)施例1的氨基介孔硅固定化酶酶解淫羊藿總黃酮的酶解效果。結(jié)果如表2所示：

表2不同酶固定技術(shù)制備的固定化蝸牛酶比較

可見，采用氨基介孔硅固定化蝸牛酶相比其他固定載體具有更高的結(jié)合效率、更好的穩(wěn)定性和更高的轉(zhuǎn)化率。

實(shí)施例3

本實(shí)施例說明本發(fā)明酶解產(chǎn)物的抗腫瘤活性。

精密稱取淫羊藿總黃酮及采用實(shí)施例1的方法獲取的游離酶酶解產(chǎn)物和固定化酶酶解產(chǎn)物各2.65mg，分別溶于25μL DMSO中，制備成母液。再將母液用RPMI-1640不完全培養(yǎng)基溶液稀釋100倍，然后再等倍稀釋至不同給藥濃度：4.0、17.0、66.0、265.0、1060.0μg·mL^-1。取對數(shù)生長期的MCF-7、A549、HepG2和Hela細(xì)胞分別接種于96孔板，培養(yǎng)24h后加入20μL待測藥液，藥液的終濃度分別0.4、1.7、6.6、26.5、106.0μg·mL^-1。每個(gè)樣品設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置不含藥物的不完全培養(yǎng)基空白組，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入MTT溶液(5.0mg·mL^-1)20μL，培養(yǎng)4h后輕輕吸棄孔中上清液，然后每孔加入150μL的DMSO，微型振蕩器振蕩5～10min，采用酶標(biāo)儀在測定波長490nm處，測定每孔的吸光度值A(chǔ)(OD值)。計(jì)算各藥液的細(xì)胞生長抑制率(Inhibiton rate)，利用Graphpad軟件處理數(shù)據(jù)，并計(jì)算各化合物IC₅₀，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)記錄。抑制率(Inhibiton rate)計(jì)算公式：

淫羊藿總黃酮及其酶解產(chǎn)物作用于MCF-7、A549、HepG2和Hela細(xì)胞48h的抑制率結(jié)果分別見表3-6(n＝6，)。

表3淫羊藿總黃酮及其酶解產(chǎn)物對MCF-7細(xì)胞作用48h的抑制率

表4淫羊藿總黃酮及其酶解產(chǎn)物對A549細(xì)胞作用48h的抑制率

表5淫羊藿總黃酮及其酶解產(chǎn)物對HepG2細(xì)胞作用48h的抑制率

表6淫羊藿總黃酮及其酶解產(chǎn)物對Hela細(xì)胞作用48h的抑制率

IC₅₀的計(jì)算結(jié)果見表7(n＝6，)。

表7淫羊藿總黃酮及其酶解產(chǎn)物對A549、HepG2、MCF-7、Hela細(xì)胞的IC₅₀

抑制率對給藥濃度作圖結(jié)果見圖7和圖8。淫羊藿總黃酮及其酶解產(chǎn)物對MCF-7、A549、HepG2和Hela細(xì)胞的抑制率均呈現(xiàn)一定的濃度依賴性；淫羊藿總黃酮酶解產(chǎn)物的細(xì)胞毒作用明顯強(qiáng)于淫羊藿總黃酮原型苷，固定化酶酶解產(chǎn)物的細(xì)胞毒作用明顯強(qiáng)于游離酶酶解產(chǎn)物；淫羊藿總黃酮及其酶解產(chǎn)物對MCF-7細(xì)胞的作用最強(qiáng)，Hela、HepG2次之，A549最弱。