本申請(qǐng)涉及多孔材料領(lǐng)域，特別是涉及一種PLL-DBM多孔復(fù)合骨移植材料、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

自體紅骨髓經(jīng)皮注射治療骨不連和骨缺損已取得一定成功，但應(yīng)用直接注入的方法，局部干細(xì)胞密度低、容易流失，影響療效。骨髓干細(xì)胞富集技術(shù)用于修復(fù)骨缺損和脊柱融合術(shù)，可獲得與自體骨移植相當(dāng)?shù)男Ч?，已成為骨修?fù)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。其核心在適用于選擇性細(xì)胞滯留技術(shù)的支架材料及其成骨效果的研究。

鑒于此，提高骨髓細(xì)胞的選擇性滯留率成為本領(lǐng)域亟待解決的技術(shù)問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本申請(qǐng)主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種PLL-DBM多孔復(fù)合骨移植材料，能夠提高骨髓細(xì)胞的選擇性滯留率，適合作為骨髓干細(xì)胞富集材料,可滿足創(chuàng)傷、骨病及急診骨缺損對(duì)骨修復(fù)治療技術(shù)和骨移植物的應(yīng)用需求。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明實(shí)施例采用的一個(gè)技術(shù)方案是：提供一種PLL-DBM多孔復(fù)合骨移植材料，與現(xiàn)有技術(shù)相比，其不同之處在于，該材料包括：

具有三維多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的礦物基材；和

設(shè)于礦物基材表面的生物聚合物修飾層，所述生物聚合物分布在所述三維多孔網(wǎng)絡(luò)的至少一部分內(nèi)；

其中，所述礦物基材為脫鈣骨基質(zhì)，所述生物聚合物為多聚左旋賴氨酸。

優(yōu)選地，該材料通過(guò)用生物聚合物對(duì)具有三維多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的礦物基材進(jìn)行表面修飾而形成。

優(yōu)選地，位于礦物基材孔隙中的生物聚合物修飾層具有二級(jí)多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選地，所述脫鈣骨基質(zhì)與所述多聚左旋賴氨酸的質(zhì)量比為1000：(0.05～1)。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明實(shí)施例采用的另一個(gè)技術(shù)方案是：提供一種PLL-DBM多孔復(fù)合骨移植材料的制備方法，包括如下步驟：

于水介質(zhì)中，將礦物基材和生物聚合物混合形成浸泡液，使礦物基材和生物聚合物充分接觸；

將所得浸泡液放置足夠時(shí)間以實(shí)現(xiàn)生物聚合物對(duì)礦物基材的表面修飾；

于溫度-42℃～-47℃、負(fù)壓20～28Pa下，將所得浸泡液進(jìn)行冷卻；

將冷卻的浸泡液進(jìn)行冷凍干燥；

其中，所述礦物基材為脫鈣骨基質(zhì)，所述生物聚合物為多聚左旋賴氨酸。

優(yōu)選地，在冷卻步驟之前還包括對(duì)浸泡液進(jìn)行負(fù)壓抽濾的步驟。

優(yōu)選地，包括如下步驟：

對(duì)脫鈣骨基質(zhì)進(jìn)行超聲清洗；

將多聚左旋賴氨酸用雙蒸水配制成濃度為0.01～0.2mg/ml的多聚左旋賴氨酸溶液，再將脫鈣骨基質(zhì)置于多聚左旋賴氨酸溶液中，形成浸泡液，其中，脫鈣骨基質(zhì)與多聚左旋賴氨酸溶液的比例為1g：5ml；

將所得浸泡液放置足夠時(shí)間以實(shí)現(xiàn)多聚左旋賴氨酸對(duì)脫鈣骨基質(zhì)的表面修飾；

將盛裝有浸泡液的容器放置于分別連接負(fù)壓抽濾瓶和負(fù)壓抽濾機(jī)的無(wú)菌干燥皿中，密封好接頭與無(wú)菌干燥皿蓋口，于18℃～22℃下負(fù)壓抽濾4～8小時(shí)，直至未見(jiàn)氣泡從孔隙溢出；

于溫度-42℃～-47℃、負(fù)壓20～28Pa下，將所得浸泡液進(jìn)行冷卻；

將冷卻的浸泡液進(jìn)行冷凍干燥。

本發(fā)明還提供了上述的PLL-DBM多孔復(fù)合骨移植材料作為用于骨和/或軟骨再生的材料的應(yīng)用。

本申請(qǐng)實(shí)施例的有益效果是：區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的情況，本發(fā)明實(shí)施例的多孔復(fù)合骨移植材料通過(guò)用生物聚合物對(duì)具有三維多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的礦物基材進(jìn)行表面修飾而形成，對(duì)骨髓細(xì)胞的選擇性滯留率高，與骨髓干細(xì)胞快速構(gòu)建的骨移植材料具有良好的生物相容性和成骨活性，可滿足作為用于創(chuàng)傷、骨病及急診骨缺損對(duì)骨修復(fù)高成骨活性骨移植材料的應(yīng)用需求。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本申請(qǐng)實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)本申請(qǐng)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。顯而易見(jiàn)地，下面所描述的附圖僅僅是本申請(qǐng)的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的材料的外觀圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1的材料的三維視頻顯微鏡觀察圖。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例1的材料的掃描電鏡圖(×600倍)。

具體實(shí)施方式

為了使本申請(qǐng)的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本申請(qǐng)進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本申請(qǐng)，并不用于限定本申請(qǐng)。

本發(fā)明實(shí)施例的PLL-DBM多孔復(fù)合骨移植材料，包括：具有三維多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的礦物基材；和設(shè)于礦物基材表面的生物聚合物修飾層，所述生物聚合物分布在所述三維多孔網(wǎng)絡(luò)的至少一部分內(nèi)，其中，所述礦物基材為脫鈣骨基質(zhì)，所述生物聚合物為多聚左旋賴氨酸。該材料通過(guò)用生物聚合物對(duì)具有三維多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的礦物基材進(jìn)行表面修飾而形成，位于礦物基材孔隙中的生物聚合物修飾層具有二級(jí)多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

在本實(shí)施例的優(yōu)選方案中，所述脫鈣骨基質(zhì)與所述多聚左旋賴氨酸的質(zhì)量比為1000：(0.05～1)。

需要說(shuō)明的是，本說(shuō)明書(shū)中，多聚左旋賴氨酸(PLL)，英文為poly-L-lysine；脫鈣骨基質(zhì)(DBM)，英文為demineralized bone matrix，是一種是由膠原蛋白、非膠原蛋白以及較低濃度的生長(zhǎng)因子(如骨形成蛋白，骨中的骨形成蛋白被致密的礦物成份包繞，未脫鈣骨無(wú)誘導(dǎo)成骨能力，脫鈣程度不同對(duì)應(yīng)的機(jī)械強(qiáng)度也不同)等組成的復(fù)合物天然骨移植材料，主要來(lái)源于人或動(dòng)物(豬、牛、狗、兔等)的顱骨、股骨干和脛骨干。

該材料將多聚左旋賴氨酸(poly-L-lysine，PLL)與脫鈣骨基質(zhì)(demineralized bone matrix,DBM)按優(yōu)選的比例浸泡、負(fù)壓抽濾和冷凍干燥，對(duì)脫鈣骨基質(zhì)表面進(jìn)行修飾及優(yōu)化，促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)的黏附、增殖與分泌基質(zhì)等細(xì)胞功能，從而制備高成骨活性的骨移植材料。

本實(shí)施例的材料按照如下制備方法得到，首先，于水介質(zhì)中，將脫鈣骨基質(zhì)和多聚左旋賴氨酸混合形成浸泡液，使脫鈣骨基質(zhì)和多聚左旋賴氨酸充分接觸。其次，將所得浸泡液放置足夠時(shí)間以實(shí)現(xiàn)多聚左旋賴氨酸對(duì)脫鈣骨基質(zhì)的表面修飾。再次，于溫度-42℃～-47℃、負(fù)壓20～28Pa下，將所得浸泡液進(jìn)行冷卻。最后，將冷卻的浸泡液進(jìn)行冷凍干燥。

作為優(yōu)選實(shí)施方式，在冷卻步驟之前還包括對(duì)浸泡液進(jìn)行負(fù)壓抽濾的步驟。

具體地，本實(shí)施例的材料按照如下制備方法得到：

(1)對(duì)脫鈣骨基質(zhì)進(jìn)行超聲清洗；

(2)將多聚左旋賴氨酸用雙蒸水配制成濃度為0.01～0.2mg/ml的多聚左旋賴氨酸溶液，再將脫鈣骨基質(zhì)置于多聚左旋賴氨酸溶液中，形成浸泡液，其中，脫鈣骨基質(zhì)與多聚左旋賴氨酸溶液的比例為1g：5ml；

(3)將所得浸泡液放置足夠時(shí)間以實(shí)現(xiàn)多聚左旋賴氨酸對(duì)脫鈣骨基質(zhì)的表面修飾；

(4)將盛裝有浸泡液的容器放置于分別連接負(fù)壓抽濾瓶和負(fù)壓抽濾機(jī)的無(wú)菌干燥皿中，密封好接頭與無(wú)菌干燥皿蓋口，于18℃～22℃下負(fù)壓抽濾4～8小時(shí)，直至未見(jiàn)氣泡從孔隙溢出；

(5)于溫度-42℃～-47℃、負(fù)壓20～28Pa下，將所得浸泡液進(jìn)行冷卻；

(6)將冷卻的浸泡液進(jìn)行冷凍干燥。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供了一種PLL-DBM多孔復(fù)合骨移植材料，該材料為骨髓干細(xì)胞富集材料，是由DBM與PLL復(fù)合構(gòu)成，其PLL的濃度為0.1％(0.1mg/ml)，DBM的重量：PLL的體積＝1g：5ml。所述PLL-DBM的制備方法步驟如下：

(1)DBM的清洗

取DBM置于超聲波清洗機(jī)中，再次用無(wú)菌雙蒸水洗滌3次，每2小時(shí)跟換雙蒸水一次，至PH7.3±0.1(酸度計(jì)測(cè)定)。無(wú)菌操作臺(tái)上瀝干4h，并置38℃恒溫箱烘干24h，,稱重封裝并標(biāo)記待用。

(2)PLL浸泡DBM

無(wú)菌操作下，用雙蒸水與PLL配制0.1％的PLL并經(jīng)0.22μm濾器過(guò)濾除菌。分別用上述配置好的PLL浸泡自制DBM(DBM重量:PLL體積＝1g:5ml)15h，每3h震蕩搖勻浸泡液，使PLL與DBM充分接觸。

(3)負(fù)壓抽濾

將上述浸泡容器置于連接負(fù)壓抽濾瓶、負(fù)壓抽濾機(jī)的無(wú)菌干燥皿中，密封好接頭與干燥皿蓋口，20℃持續(xù)負(fù)壓抽濾5h，直至未見(jiàn)任何氣泡自骨塊表面孔隙溢出，取出浸泡容器置－20℃冰箱冷凍隔夜。

(4)冷凍干燥

將浸泡容器置于冷凍干燥機(jī)托盤(pán)，冷凍干燥機(jī)預(yù)置―42℃～―47℃，負(fù)壓20－28Pa，預(yù)冷30min后開(kāi)始抽真空，真空度100MT以下。冷凍干燥48h，見(jiàn)材料已完全顯露，白色多聚賴氨酸已絕大部分吸附到材料中，材料邊緣與瓶底僅余很少量多聚賴氨酸白色沉淀物，將材料稱重并封裝，貼上標(biāo)簽，外面再用一層聚乙烯袋封口。

(5)滅菌與保存

鈷-60γ射線照射滅菌，常用劑量為15-25kGyCo,置-20℃低溫冰箱保存待用。取少許DBM送需氧、厭氧菌、霉菌培養(yǎng)。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供了一種PLL-DBM多孔復(fù)合骨移植材料，與實(shí)施例1相比，區(qū)別在于PLL的濃度為0.01％(0.01mg/ml)。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供了一種PLL-DBM多孔復(fù)合骨移植材料，與實(shí)施例1相比，區(qū)別在于PLL的濃度為0.05％(0.05mg/ml)。

實(shí)施例4

本實(shí)施例提供了一種PLL-DBM多孔復(fù)合骨移植材料，與實(shí)施例1相比，區(qū)別在于PLL的濃度為0.08％(0.08mg/ml)。

實(shí)施例5

本實(shí)施例提供了一種PLL-DBM多孔復(fù)合骨移植材料，與實(shí)施例1相比，區(qū)別在于PLL的濃度為0.15％(0.15mg/ml)。

實(shí)施例6

本實(shí)施例提供了一種PLL-DBM多孔復(fù)合骨移植材料，與實(shí)施例1相比，區(qū)別在于PLL的濃度為0.20％(0.20mg/ml)。

以實(shí)施例1所得產(chǎn)品為例進(jìn)行產(chǎn)品驗(yàn)證：

結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和表征

PLL-DBM具有三維網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，密度約為0.25～0.29g/ml，平均為(0.27±0.02)g/ml，孔隙率為(73±11)％。材料及孔隙表面有厚度約2～7μm的乳白色PLL覆蓋，且在孔隙中形成更小的、孔徑約20～65μm的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，大部分孔與孔之間有約100μm左右小孔貫通，三維視頻顯微鏡觀察可見(jiàn)材料整體及孔隙表面有均勻的乳白色PLL覆蓋，拉曼光譜分析表明材料內(nèi)外表面任一位點(diǎn)由DBM和多聚賴氨酸構(gòu)成，組織學(xué)觀察PLL-DBM在膠原孔狀結(jié)構(gòu)內(nèi)表面有淺色PLL涂層與網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，請(qǐng)參閱圖1至圖3所示，圖中可見(jiàn)在脫鈣骨基質(zhì)天然的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)中形成了更細(xì)小的多聚左旋賴氨酸網(wǎng)孔。

PLL-DBM的細(xì)胞毒性檢測(cè)

參照ISO10993及GB/T10886的有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，將PLL-DBM材料及其浸提液分別與人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)體外共培養(yǎng)，于培養(yǎng)20h、3d、7d行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察,四甲基偶氮唑鹽法測(cè)定培養(yǎng)1、3、5、7d的細(xì)胞增殖活性，應(yīng)用分光光度法進(jìn)行溶血試驗(yàn)。結(jié)果示：與PLL-DBM及其浸提液共培養(yǎng)的人BMSCs表現(xiàn)出更好的黏附與增殖特性，且隨浸提液濃度增加而增加，細(xì)胞毒性為0～1級(jí)。浸提液組溶血指數(shù)為2.17％，達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求。

PLL-DBM成骨效果檢測(cè)

將成人骨髓干細(xì)胞通過(guò)骨髓富集裝置復(fù)合PLL-DBM后植入裸鼠皮下，術(shù)后X線攝片和組織學(xué)檢查均顯示其成骨效果良好，與自體骨組比較無(wú)明顯差異，并在各時(shí)間點(diǎn)與明顯強(qiáng)于DBM組。

PLL-DBM選擇性細(xì)胞滯留效果檢測(cè)

①對(duì)骨髓有核細(xì)胞、血小板和骨髓干細(xì)胞的選擇性滯留效果的觀察：PLL-DBM對(duì)有核細(xì)胞選擇性滯留的倍數(shù)為3.18±0.31倍，粘附率達(dá)53％±12％；對(duì)血小板選擇性滯留的倍數(shù)為3.88±0.68倍，粘附率達(dá)34％±10％；對(duì)人骨髓干細(xì)胞選擇性滯留的倍數(shù)為5.25±1.40倍，粘附率達(dá)73％±13％，選擇率達(dá)1.41±0.34。②對(duì)促成骨生長(zhǎng)因子的選擇性滯留效果的觀察：PLL-DBM與紅骨髓富集處理后可以顯著提高TGF-β1和PDGF含量。

綜上所述，PLL-DBM是經(jīng)多聚賴氨酸表面修飾的脫鈣骨基質(zhì)，對(duì)骨髓細(xì)胞的選擇性滯留率高，與骨髓干細(xì)胞快速構(gòu)建的骨移植材料具有良好的生物相容性和成骨活性，可滿足創(chuàng)傷、骨病及急診骨缺損對(duì)骨修復(fù)高成骨活性骨移植物的需求。

以上所述僅為本申請(qǐng)的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本申請(qǐng)的專利保護(hù)范圍內(nèi)。