本申請要求享有序列號62/183,728、于2015年6月23日申請和序列號62/183,729、于2015年6月23日申請和序列號62/183,726、于2015年6月23日申請的美國臨時(shí)專利申請案，它們的公開內(nèi)容通過引用全部并入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及一種治療炎性疾病的方法及原花色素化合物作為治療炎性疾病的藥物應(yīng)用。更具體地，涉及原花色素A1(Proanthocyanidin A1,PA1)的治療效果，涉及天然出現(xiàn)在刺芋中的化合物以及其治療炎性疾病或作為抗癌先導(dǎo)化合物的作用。

背景技術(shù)：

刺芋(天南星科)Lasia spinosa Linn.Thwait(Aracea)通常被稱為“帶刺芋頭”，生長于亞洲野外沼澤的多年生草本植物。天南星科植物被廣泛的應(yīng)用于傳統(tǒng)藥物或食物中,并且在先前的研究顯示該科植物以含有黃酮苷、黃酮醇、黃酮以及原花色素作主。迄今為止，幾乎沒有關(guān)于刺芋(天南星科)化學(xué)成分的研究。發(fā)明人之前發(fā)現(xiàn)水醇提取物表現(xiàn)出顯著的抗癌和抗炎活性。在本發(fā)明中，從刺芋的活性成分中分離鑒定出一個(gè)具有主導(dǎo)生物活性的原花色素類化合物。

本申請的這個(gè)部分或任何其他部分引用或識別的任何文獻(xiàn)不應(yīng)被視為承認(rèn)這些文獻(xiàn)為本申請可得到的現(xiàn)有技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明的目的是提供一種治療炎性疾病的方法及原花色素化合物作為治療炎性疾病的藥物應(yīng)用。本發(fā)明涉及原花色素A1(Proanthocyanidin，PA1)的治療作用。更具體地，它涉及天然出現(xiàn)在刺芋中的化合物以及治療炎性疾病和或作為抗癌先導(dǎo)化合物的作用。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了治療炎性疾病的方法，這個(gè)方法向有需要的主體施用有效劑量的具有下面結(jié)構(gòu)式的化合物：

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面的第一實(shí)施例，所述化合物為原花色素A1(PA1)。

本發(fā)明的一個(gè)方面的第二實(shí)施例中，所述治療炎性疾病的方法中，其中原花色素A1(PA1)從包括刺芋(Lasia spinosa(L.)Thwait)(天南星科)在內(nèi)的天然植物材料中分離。

本發(fā)明的一個(gè)方面的第三實(shí)施例中，所述治療炎性疾病的方法中，其中所述化合物抑制結(jié)腸炎、抑制結(jié)腸長度縮短、減少結(jié)腸組織損傷、抑制結(jié)腸髓過氧物酶活性(MPO)和/或抑制一氧化氮(NO)。

本發(fā)明的一個(gè)方面的第四實(shí)施例中，所述治療炎性疾病的方法中，其中有效劑量的范圍是0.81mg/kg/天到2.43mg/kg/天。

本發(fā)明的一個(gè)方面的第五實(shí)施例中，所述治療炎性疾病的方法中，其中所述化合物以口服給藥。

本發(fā)明的一個(gè)方面的第六實(shí)施例中，所述治療炎性疾病的方法中，其中有需要的主體是人類。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了原花色素化合物作為制備治療炎性疾病的藥物的應(yīng)用，其中所述原花色素化合物具有以下結(jié)構(gòu)：

本發(fā)明的另一個(gè)方面的第一實(shí)施例中，其中所述原花色素化合物為原花色素A1。

本發(fā)明的另一個(gè)方面的第二實(shí)施例中，其中所述原花色素化合物從包括刺芋的天然植物材料分離。

所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可理解的是除了那些特定描述的，本文描述的發(fā)明可進(jìn)行改變和改進(jìn)。

本發(fā)明包括所有這樣的改變和改進(jìn)。本發(fā)明也包括說明書中單獨(dú)或共同地涉及或指示的所有步驟和特征以及任一和所有的組合物或任何兩個(gè)或更多的步驟或特征。

除非上下文另有要求，本說明書中的術(shù)語“包含(comprise)”或諸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的變體，應(yīng)理解為暗示包括規(guī)定的整數(shù)(integer)或整數(shù)群組，但不排除任何其他整數(shù)或整數(shù)群組。也需要注意的是在本公開中，特別是在權(quán)利要求和/或段落中，諸如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含(comprising)”的術(shù)語以及類似術(shù)語具有它在美國專利法里的意義，例如它們的意思可為“包括(include)”、“包括(included)”、“包括(including)”以及類似的術(shù)語；以及諸如“實(shí)質(zhì)上由…組成(consisting substantially of)”和“本質(zhì)上由…組成(consists substantially of)”的這些術(shù)語具有它們在美國專利法里的意思，例如，它們包括沒有特殊引用的元素，但排除了沒有在現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)現(xiàn)的元素，或這些元素會影響本發(fā)明的基礎(chǔ)性或新穎性特征。

進(jìn)一步地，除非上下文另有所指，本說明書和權(quán)利要求中的術(shù)語“包括(include)”或諸如“包括(includes)”或“包括(including)”的變體，應(yīng)理解為暗示包括規(guī)定的整數(shù)或整數(shù)群組，但不排除任何其他整數(shù)或整數(shù)群組。

本文使用的所選術(shù)語的其他定義在本發(fā)明的詳細(xì)說明中找到并且在全文中使用。除非另有定義，本文使用的所有其它技術(shù)術(shù)語具有和本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解相同的意義。

從下述說明書的綜述中，本發(fā)明的其他方面和優(yōu)勢對于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。

附圖說明

本發(fā)明的上述和其他目的以及特征從下面對本發(fā)明的描述(結(jié)合附圖)而顯而易見。

附圖1顯示了化合物PA1的結(jié)構(gòu)。

附圖2顯示了(a)到(d)為對照組以及(e)到(h)PA1(細(xì)胞以不改變細(xì)胞活力的濃度6.25μg/mL的化合物PA1治療)在人類食道癌(KYSE-150)細(xì)胞進(jìn)行的體外傷口愈合試驗(yàn)；初始放大倍率，5×。

附圖3顯示了PA1對由LPS刺激的RAW267.4細(xì)胞中的NO生成的作用。在缺少或存在不同濃度的PA1(1.56，3.12，6.25，12.5，25，50μg/mL)的情況下，用100ng/mL的LPS處理巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PA1在20小時(shí)內(nèi)不改變細(xì)胞活性，NO生成由格里斯試劑測定。數(shù)據(jù)從三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)獲得并且呈現(xiàn)為平均值±SEM(^####p，和對照組相比；*p<0.05，**p<0.01以及***p<0.001，和單獨(dú)LPS組相比)。

附圖4顯示PA1(A)對小鼠生存率、(B)小鼠體重變化、(C)小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)，(D)和(E)具有DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的小鼠的結(jié)腸長度。除去對照組，所有組都誘導(dǎo)出結(jié)腸炎。從第6天到第13天對小鼠施用PA1和陽性藥SASP。體重的變化為誘導(dǎo)結(jié)腸炎之前的體重和第14天處死的體重之間的差異。DAI分?jǐn)?shù)通過(i)體重減少、(ii)糞便稠度以及(iii)糞便出血的組合分?jǐn)?shù)確定。在第14天，處死小鼠并且測量結(jié)腸長度。數(shù)據(jù)表現(xiàn)為平均值±SEM，n＝8(^##p,和對照組相比；*p<0.05和**p<0.01，和DSS組相比)。

附圖5顯示了PA1對DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠的組織表現(xiàn)形式的作用。(A)對照組；(B)DSS模型組；(C)DSS+SASP 200mg/kg組；(D)DSS+PA1 10mg/kg組；(E)DSS+PA1 30mg/kg。對應(yīng)的結(jié)腸由蘇木精和伊紅著色，并以放大倍率10×顯示。

附圖6顯示了PA1對抑制DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的小鼠結(jié)腸中髓過氧物酶(MPO)活性的作用。除了對照組，所有組都誘導(dǎo)了結(jié)腸炎。從第6天到第13天對小鼠施用PA1和陽性藥SASP。在第14天，處死小鼠并且通過結(jié)腸勻漿確定MPO活性。數(shù)據(jù)表現(xiàn)為平均值±SEM,n＝8(*p<0.05，和DSS組相比)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明并不限定于本文描述的任何特定實(shí)施例的范圍。下面的實(shí)施例僅為例證而呈現(xiàn)。

結(jié)構(gòu)通過¹H和DEPT和核磁共振光譜數(shù)據(jù)而鑒別，以及附圖1顯示原花色素A1(PA1)的結(jié)構(gòu)。

原花色素A1：[M+H]⁺:577.1364(Calcd.for 577.1346)。¹H NMR(400MHz,CD₃OD):δ7.16(1H,d,J＝2Hz,H-10),7.04(1H,dd,J＝2,8.5Hz,H-14),6.98(1H,s,H-10’),6.86(1H,m,H-14’),6.84(1H,s,H-13),6.82(1H,s,H-13’),6.10(1H,s,H-6’),6.08(1H,d,J＝2.4Hz,H-8),5.95(1H,d,J＝2.4Hz,H-6),4.76(1H,d,J＝8.0Hz,H-8),4.26(1H,d,J＝3.2Hz,H-4),4.15(1H,d,J＝3.2Hz,H-3),4.08(1H,m,H-3’),2.98(1H,dd,J＝5.6,16.4Hz,H-4’β),2.59(1H,dd,J＝2,8.5Hz,H-4’α)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD):156.77(s,C-7),155.27(s,C-5’),154.77(s,C-5),152.70(s,C-7’),150.83(s,C-8a),149.45(s,C-8’a),145.42(s,C-11),145.37(s,C-11’),145.04(s,C-12),144.47(s,C-12’),130.83(s,C-9),129.55(s,C-9’),118.94(d,C-14’),118.46(d,C-14),114.96(d,C-13),114.34(d,C-10),114.25(d,C-13’),114.05(d,C-10’),105.16(s,C-8’),102.66(s,C-4a),101.44(s,C-4a’),99.03(s,C-2),96.77(d,C-6),95.21(d,C-8),95.16(d,C-6’),82.50(d,C-2’),67.00(d,C-3’),66.27(d,C-3),27.86(d,C-4),27.79(t,C-4’)。

3-[4,5-二甲基噻唑-2-炔]-2,5-二苯基四唑溴化物(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)和二甲基亞砜(DMSO)、柳氮磺胺吡啶(sulsafalazine，SASP)、脂多糖(LPS，L3129)、格里斯試劑以及所有使用的化學(xué)物質(zhì)為HPLC級別的來自西格瑪化工有限公司(美國密蘇里州，圣路易斯)。¹H NMR和¹³C NMR光譜在Bruker-Avance 400MHz光譜儀上記錄。CD₃OD用作溶劑?；瘜W(xué)位移(δ)利用四甲基硅烷作為內(nèi)標(biāo)物以ppm記錄，并且J值以Hz記錄。高分辨率質(zhì)譜儀(HRMS)在VG Autospec-3000分光儀上分析。柱層析在高速逆流色譜(high speed countercurrent chromatography，HSCCC)上進(jìn)行并且使用制備型HPLC。HPLC分析使用配備了Alltech Alltima-C18(4.6×250mm,5μm)的Waters 2335系列儀器并且在樣品制備中使了制備型Alltech Alltima-C18柱(10×250mm,5μm)。DSS(分子量：36到50kDa)從MP生物醫(yī)學(xué)公司(圣安娜，加利福尼亞，美國)購買。RPMI 1640培養(yǎng)基，Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM),FBS,盤尼西林和鏈霉素從美國生命技術(shù)公司(卡爾斯巴德，加利福尼亞，美國)購買。

提取和分離

刺芋根(500g)干燥粉碎后在60℃利用75％乙醇(ETOH)(2L)回流提取萃取三次。濃縮乙醇溶劑獲得殘?jiān)?23.1g)，在用不同溶劑(3×100mL)分離之前，在分液漏斗中將它懸浮在水中(100mL)。正丁醇層(3.5g,0.7％)在硅膠柱(半-制備型柱子制備型RP-C₁₈)上用色譜分析以獲得化合物1(PA1，6.16mg)。

細(xì)胞培養(yǎng)

將鼠類RAW264.7巨噬細(xì)胞和人類食道癌細(xì)胞系KYSE-70,KYSE-150,KYSE-410以及KYSE-520保持在補(bǔ)充了100U/mL盤尼西林,100μg/mL鏈霉素和10％FBS(胎牛血清)的RPMI 1640或DMEM培養(yǎng)基中，并在具有5％CO₂的潮濕環(huán)境和37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞每三天以1:6的稀釋度傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞毒性試驗(yàn)

在這發(fā)明中，PA1溶解在二甲亞砜(DMSO)中以制作儲備溶液并且進(jìn)一步稀釋在培養(yǎng)基中以進(jìn)行本試驗(yàn)。細(xì)胞接種在96-孔板(3×10³細(xì)胞/孔)并且附著過夜?；厥蘸?，細(xì)胞利用培養(yǎng)基中1.56，3.125，6.25，12.5，25，50μg/mL的PA1處理48小時(shí)。然后每孔20μL MTT(溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)的5mg/mL儲備溶液)加入到培養(yǎng)基(200μL)并且在37℃下培養(yǎng)4小時(shí)。最后，移除培養(yǎng)基并且加入200μL DMSO以溶解紫色甲瓚(formazan)結(jié)晶。利用酶標(biāo)儀分光光度計(jì)(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，赫拉克斯勒，加利福尼亞)在570nm波長測量溶液的吸光度。

傷口愈合試驗(yàn)

6×10⁴細(xì)胞/孔在完整培養(yǎng)基中以30％細(xì)胞覆蓋率接種在12孔板上。接種24小時(shí)后，單細(xì)胞層利用無菌塑料頭(1mL)刨痕而造成損傷，然后利用PBS清洗兩遍以除去細(xì)胞碎片，并且隨后在存在或缺少6.25μg/mLPA1的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時(shí)間至長達(dá)72小時(shí)。遷移到傷口表面的細(xì)胞利用奧林巴斯IX71顯微技術(shù)檢測并且進(jìn)行數(shù)字化拍照。

檢測一氧化氮生成

一氧化氮(NO)生成通過測量培養(yǎng)基中的亞硝酸鹽水平間接評估，它是由基于格里斯試劑的比色測定法確定。缺乏或存在LPS(100ng/mL)下于37℃利用不同濃度的PA1共同處理細(xì)胞24小時(shí)。然后，每100μL上層清液和等體積的格里斯試劑混合并且在室溫下培養(yǎng)15分鐘；同時(shí)，亞硝酸鈉作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。利用酶標(biāo)儀于540nm測量光密度。

動(dòng)物

7個(gè)星期大體重約為20-22g的雄鼠C57BL/6從香港中文大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買。該實(shí)驗(yàn)流程被香港浸會大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會批準(zhǔn)。

慢性結(jié)腸炎的誘導(dǎo)和治療

動(dòng)物被隨機(jī)分為五組(n＝8)。對照組的老鼠被施用蒸餾水但所有其他試驗(yàn)組連續(xù)5天被施用2.0％(w/v)葡聚糖硫酸鈉(DSS)。隨后，DSS/SASP(200mg/kg/天)以及PA1(10或30mg/kg/天)處理組的老鼠從第6天到13天分別用生理鹽水、SASP或PA1以填喂法給藥。

人體等效劑量利用下述等式從小鼠劑量轉(zhuǎn)化：D_人類＝D_老鼠×k(k＝0.081)(Regan-Shaw等人，(2007)，其公開全部并入本文)。因此，人體等效劑量的范圍是0.81mg/kg/天到2.43mg/kg/天。

疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評估

DAI通過計(jì)算體重、腹瀉、結(jié)腸長度以及出血變化而確定。每個(gè)分?jǐn)?shù)在表1中給出。

表1.基于疾病標(biāo)記強(qiáng)度的疾病活動(dòng)指數(shù)

組織學(xué)分析

結(jié)腸被縱向切開，利用冰冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕沖洗，過夜固定于4％多聚甲醛然后將其嵌入石蠟。根據(jù)評估結(jié)腸損傷的標(biāo)準(zhǔn)步驟，五微米切片利用蘇木精/伊紅著色。組織學(xué)損傷評分在表2顯示。

表2.組織損傷嚴(yán)重程度的DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎評分的組織損傷評分系統(tǒng)

測定結(jié)腸組織的中性粒細(xì)胞浸潤(MPO試驗(yàn))

髓過氧物酶(MPO)主要通過中性粒細(xì)胞釋放的酶，并且它的活性直接和給定組織的發(fā)炎程度相關(guān)。在本發(fā)明中，按照發(fā)明人較早出版物(Mu,H.X.,et al.,Anti-inflammatory Actions of (+)-3'alpha-Angeloxy-4'-keto-3',4'-dihydroseselin(Pd-Ib)against Dextran Sulfate Sodium-Induced Colitis in C57BL/6Mice.J Nat Prod,2016)描述的方法測量MPO活性。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為結(jié)腸組織的濕重并且以單位/克的組織量化。

討論

在本發(fā)明中，刺芋根的正丁醇提取物顯示出具有潛在的抗癌和抗炎活性。發(fā)明人在制備型HPLC上利用柱層析純化活性餾分以獲得一種已知的原花色素。

為了確定PA1對人類食道癌細(xì)胞(KYSE-70,KYSE-150,KYSE-450和KYSE-520細(xì)胞系)的毒性作用，進(jìn)行了MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-炔]-2,5-二苯基四唑溴化物)試驗(yàn)。

進(jìn)一步地，人們發(fā)現(xiàn)原花色素A1(PA1)對KYSE-450細(xì)胞比對其他細(xì)胞系具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性(表3)。

結(jié)果以μg/mL為單位的IC₅₀值表示

表3.化合物對癌癥細(xì)胞系的細(xì)胞毒性

另外，傷口愈合實(shí)驗(yàn)用來測試這些化合物是否可以影響癌細(xì)胞遷移作用。和對照組相比，KYSE-150細(xì)胞的單層細(xì)胞被刨痕以形成傷口，并且在缺少或存在6.25μg/mL PA1下進(jìn)行培養(yǎng)。72小時(shí)后，傷口邊緣在對照組中難以辨別，但是化合物PA1處理的細(xì)胞沒有遷移到傷口(附圖2)，表明PA1對KYSE-150細(xì)胞在無細(xì)胞毒性濃度處理時(shí)具有抗遷移作用。

PA1對NO生成的作用利用格里斯試劑測定。如附圖3所示，和對照組相比，LPS(100ng/mL)刺激導(dǎo)致NO生成顯著增加但是不同PA1濃度的處理導(dǎo)致NO生成受到顯著的抑制。

為了確定PA1對炎性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的作用，采用了DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠模型。在本發(fā)明中，當(dāng)小鼠連續(xù)5天暴露于2％DSS的飲用水(附圖4B)時(shí)，PA1治療的小鼠體重減少降低并且恢復(fù)更快。DAI指數(shù)表明PA1有效改善DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎臨床癥狀(附圖4C)。另外，作為DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的另一個(gè)重要癥狀參數(shù)，縮短結(jié)腸長度在施用PA1后得以有效緩解(附圖4D和4E)。PA1治療組的死亡率降低，與DSS模型組相比以下癥狀的減輕相一致：粘膜潰瘍、隱窩損傷、水腫以及細(xì)胞浸潤到粘膜組織(附圖4A和附圖5)。酶髓過氧物酶(MPO)反映了結(jié)腸組織損傷的中性粒細(xì)胞浸潤。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PA1的施用明顯降低MPO活性(附圖6)。

在本發(fā)明中，PA1可改善結(jié)腸炎的炎癥并且在食道癌細(xì)胞系發(fā)揮顯著抗腫瘤入侵活性。

總括而言，PA1可開發(fā)為結(jié)腸炎和癌癥的新型治療劑。

工業(yè)應(yīng)用性

本發(fā)明公開了從自然資源中分離的具有治療和醫(yī)療用途的化學(xué)單體。更具體地，它涉及刺芋(天南星科)植物中天然出現(xiàn)的化合物以及其治療炎性疾病或作為抗癌先導(dǎo)化合物的生物活性。

如若需要，本文討論的不同功能可以不同順序和/或同時(shí)使用而進(jìn)行。進(jìn)一步地，如若需要，可選擇或結(jié)合一個(gè)或更多上述功能。

雖然前述發(fā)明描述了不同實(shí)施例和示例，但是人們可理解的是其他實(shí)施例在本發(fā)明下述權(quán)利要求和它們的等價(jià)物所表達(dá)的范圍內(nèi)。并且，上述特定示例應(yīng)理解為僅是說明性的，而沒有以任何方式或其他公開的暗示進(jìn)行限制。沒有進(jìn)一步詳述，相信所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)本文的描述將本發(fā)明發(fā)揮最大作用。本文所有引用的公開文獻(xiàn)在此通過引用全部并入本文。