本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及載基因納米粒，具體涉及一種基因-光熱聯(lián)合的納米粒及其制備方法和在用于制備抗腫瘤制劑中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

據(jù)資料顯示，在腫瘤治療的干預(yù)手段中，有關(guān)設(shè)計(jì)和制備多功能的治療平臺(tái)，有效整合兩種治療模式如手術(shù)、化療、放療、基因治療、光熱治療或光動(dòng)力學(xué)療法等，可降低藥物劑量，減少副作用，克服多藥耐藥，提高抗腫瘤效果，已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注；這種智能化的納米平臺(tái)通常需要充分結(jié)合有機(jī)和無(wú)機(jī)雜化納米材料的優(yōu)勢(shì)，方可更好發(fā)揮聯(lián)合治療效果。

其中，首先，基因治療是一種有潛力的腫瘤治療手段；由于外源基因在體液中易降解且細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低，因此基因治療需要通過載體來(lái)實(shí)現(xiàn)有效的基因轉(zhuǎn)染；在目前的眾多基因載體中，病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，但存在免疫原性等潛在安全隱患；非病毒載體雖然安全性較高，但是轉(zhuǎn)染效率有限；近年來(lái)致力研究的聚乙烯亞氨(簡(jiǎn)稱pei)非病毒基因載體，因其易于內(nèi)涵體逃逸、轉(zhuǎn)染效率高，成為基因治療載體的金標(biāo)準(zhǔn)；然而，過量使用pei，特別是高分子量的pei，會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的細(xì)胞毒性和溶血性；為克服此缺陷，有研究將pei嫁接到無(wú)機(jī)納米粒，如具有大比表面積介孔納米球表面，以其作為支撐，一方面在保證有效的基因轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上，可以顯著的降低pei使用量；另一方面，介孔納米球特殊的三維球形結(jié)構(gòu)使其表面能低，空間位阻小，利于進(jìn)一步表面修飾，并且其內(nèi)部的孔結(jié)構(gòu)，可用于裝載小分子藥物，實(shí)現(xiàn)多模式聯(lián)合治療；因此，pei嫁接的介孔納米材料在腫瘤基因治療方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)；

其次，光熱治療因其侵入性低、治療的時(shí)空可控性等優(yōu)勢(shì)，成為腫瘤治療的一種有效策略。sp²雜化的碳納米材料，如：零維富勒烯、一維碳納米管、二維石墨烯，已被廣泛應(yīng)用于腫瘤光熱治療；有研究公開了三維介孔碳納米球(簡(jiǎn)稱mcn)逐漸被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，與石墨烯和碳納米管不同，mcn邊緣平滑，對(duì)細(xì)胞損傷非常小，且具有孔狀結(jié)構(gòu)，利于包載藥物；更重要的是，其分散的具有sp2雜化的碳孔壁作為產(chǎn)熱點(diǎn)，具有較高的光熱轉(zhuǎn)換能力，可用于近紅外介導(dǎo)的光熱治療。

基于此，本發(fā)明擬提供一種載基因納米粒，尤其是一種基因-光熱聯(lián)合治療納米粒及其制備方法和在用于制備抗腫瘤藥物制劑中的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種載基因納米粒，尤其是一種基因-光熱聯(lián)合的納米粒及其制備方法和在用于制備抗腫瘤藥物制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明使用氧化介孔碳納米球(omcn)作為支撐材料，表面共價(jià)連接pei，制備一種基因-光熱聯(lián)合治療的納米粒，利用pei的正電荷負(fù)載基因藥物實(shí)現(xiàn)基因治療，利用omcn的產(chǎn)熱性能實(shí)現(xiàn)光熱治療；同時(shí)，本發(fā)明使用乳腺癌荷瘤裸鼠為疾病動(dòng)物模型，考察了納米粒的抗腫瘤效果，結(jié)果顯示，能有效地提高腫瘤治療效果。

本發(fā)明提供了一種新的高效低毒的光熱-基因聯(lián)合治療腫瘤的治療平臺(tái)。

本發(fā)明的光熱-基因聯(lián)合治療納米粒在用于制備抗腫瘤中，能有效發(fā)揮各自的優(yōu)勢(shì)，用于基因和光熱聯(lián)合治療乳腺癌，與單一治療相比，具有更優(yōu)療效；本發(fā)明所制備的pei嫁接omcn的載體，與單純omcn相比，表面修飾pei后808nm的吸收增加，產(chǎn)熱能力提高，與單純pei相比，通過omcn做支撐，細(xì)胞毒性降低，基因轉(zhuǎn)染能力增強(qiáng)。

本發(fā)明提供了一種基于omcn和pei的載基因納米粒的制備方法，

本發(fā)明制備pei嫁接的omcn(op)的步驟如下：精確稱量定量的omcn，分散于適量體積的edc溶液(溶于一定ph值的mes緩沖液)和定量體積的nhs溶液(溶于一定ph值的mes緩沖液)中，攪拌一定時(shí)間，激活羧基，加入過量pei攪拌一定時(shí)間，離心水洗純化，即得op；

上述合成方法中，mes緩沖液的ph值范圍為5～6.5；

上述合成方法中，edc溶液的濃度為10mg·ml^-1，nhs溶液的濃度為4mg·ml^-1；

上述合成方法中，omcn:edc:nhs的質(zhì)量比為1:(2～5):(0.8～2)；

上述合成方法中，omcn與edc/nhs反應(yīng)時(shí)間為2～3h；

上述合成方法中，omcn與pei的質(zhì)量比為1:(2～6)；

上述合成方法中，omcn與pei的反應(yīng)時(shí)間為24h～48h；

上述合成方法中，離心速率為8000rpm～12000rpm，離心時(shí)間為8min～12min；

本發(fā)明制備基于op的載基因納米粒的步驟如下：精確稱量定量op與定量質(zhì)粒dna混合，漩渦一定時(shí)間，室溫孵育一定時(shí)間，即得op的載基因納米粒；

上述制備方法中，op與質(zhì)粒dna的質(zhì)量比為1:(0.1～1)；

上述制備方法中，漩渦時(shí)間為30s，室溫孵育時(shí)間為20min～4h；

上述所制備的基于op的載基因納米粒，使用編碼ing4的質(zhì)粒dna所制備的納米粒，簡(jiǎn)稱opi，使用編碼綠色熒光蛋白的質(zhì)粒dna所制備的納米粒，簡(jiǎn)稱ope，使用編碼熒光素酶的質(zhì)粒dna所制備的納米粒，簡(jiǎn)稱opg。

本發(fā)明通過透射電鏡觀察op和opi的形貌，通過x射線光電子能譜測(cè)定opi的元素組成，結(jié)果顯示，所制備的納米粒為球形，含有o、n、c和p元素；

本發(fā)明通過zeta電位測(cè)定儀測(cè)定不同載體材料和納米粒的表面電荷，結(jié)果顯示omcn荷負(fù)電，表面修飾陽(yáng)離子pei后荷正電，負(fù)載陰性質(zhì)粒dna后電荷降低，符合規(guī)律；

本發(fā)明通過紫外-可見分光光度計(jì)獲取載體的紫外-可見吸收光譜曲線，結(jié)果顯示，在808nm處omcn和op均有吸收，omcn經(jīng)pei修飾后吸收增強(qiáng)；

本發(fā)明使用808納米的近紅外激光照射，測(cè)定op的熱效應(yīng)，。固定照射能量強(qiáng)度為4.5w/cm²，測(cè)定不同濃度op的熱效應(yīng)曲線；固定op濃度為45μg/ml，測(cè)定不同能量強(qiáng)度照射下op的熱效應(yīng)曲線，結(jié)果顯示，op的熱效應(yīng)呈濃度依賴性和能量強(qiáng)度依賴性；

本發(fā)明使用瓊脂糖凝膠電泳考察op包載質(zhì)粒dna的能力，以及近紅外光觸發(fā)下質(zhì)粒dna從載體材料中釋放的效應(yīng)，結(jié)果顯示，op具有良好的包封質(zhì)粒dna的能力，在近紅外光觸發(fā)下，op和質(zhì)粒dna的結(jié)合會(huì)逐漸松散，利于基因藥物的釋放；

本發(fā)明通過倒置熒光顯微鏡觀察ope和單純pei在mcf-7乳腺癌細(xì)胞上的基因轉(zhuǎn)染效率差異，結(jié)果顯示，ope具有高gfp表達(dá)效率，同樣條件下，pei介導(dǎo)的基因表達(dá)效率明顯降低，細(xì)胞毒性大；

本發(fā)明使用cck-8檢測(cè)法定量評(píng)價(jià)不同處理對(duì)mcf-7乳腺癌細(xì)胞的毒性，制備opg和opi成系列濃度，與mcf-7細(xì)胞避光孵育6h，對(duì)光熱治療組，使用近紅外激光照射5分鐘，能量密度為4.5w/cm²，繼續(xù)孵育42h，按照cck-8使用說明定量檢測(cè)細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示，細(xì)胞毒性隨著納米粒濃度增加而增加，同一濃度下，包載治療基因的opi對(duì)mcf-7細(xì)胞毒性比包載報(bào)告基因的opg大，對(duì)于同一種納米粒，近紅外光照射后細(xì)胞毒性增加；

本發(fā)明使用共聚焦顯微鏡觀察mcf-7細(xì)胞經(jīng)不同處理后的死亡-存活情況，opg和opi分別與mcf-7細(xì)胞避光孵育6h，濃度為45μg/ml，對(duì)光熱治療組，使用近紅外激光照射5分鐘，能量密度為4.5w/cm²，繼續(xù)孵育42h，按照l(shuí)ive-dead試劑染色說明進(jìn)行細(xì)胞染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察，活細(xì)胞呈綠色，死細(xì)胞呈紅色，結(jié)果顯示，基因和光熱治療聯(lián)合治療組(opi+nir組)的腫瘤細(xì)胞死亡明顯高于單純的光熱治療組(opg+nir組)或單純的基因治療組(opi組)，提示聯(lián)合治療的良好效果，結(jié)果還顯示，包載報(bào)告基因的opg組沒有觀察到明顯細(xì)胞毒性。

本發(fā)明使用紅外熱成像儀檢測(cè)體內(nèi)熱效應(yīng)效果，構(gòu)建mcf-7荷瘤裸鼠模型，尾靜脈注射生理鹽水和opi后經(jīng)808nm激光照射5min，能量密度為1w/cm²，熱成像儀記錄不同時(shí)間點(diǎn)的熱效應(yīng)圖像和溫度，結(jié)果顯示，opi組隨著近紅外照射時(shí)間延長(zhǎng)，溫度提高，明顯高于生理鹽水組，提示opi良好的熱效應(yīng)；

本發(fā)明使用tunel法測(cè)定mcf-7荷瘤裸鼠尾靜脈注射不同制劑后的細(xì)胞凋亡情況，構(gòu)建mcf-7荷瘤裸鼠模型，尾靜脈注射生理鹽水、游離阿霉素、opg和opi，光熱治療組另經(jīng)808nm激光照射5min，能量密度為1w/cm²，每隔兩天處理一次，共處理2次，處死裸鼠，取皮下腫瘤，冰凍切片，按照tunel試劑盒說明測(cè)定凋亡情況，并用dapi進(jìn)行細(xì)胞核染色，藍(lán)色表示dapi染色的細(xì)胞核，綠色表示fitc標(biāo)記的凋亡細(xì)胞，結(jié)果顯示，基因和光熱治療聯(lián)合治療組(opi+nir組)的腫瘤死亡明顯高于單純的光熱治療組(opg+nir組)或單純的基因治療組(opi組)，提示聯(lián)合治療的良好效果。

本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)及特征在于，提供一種基于omcn和pei的載基因納米粒的制備方法，所述的載基因納米粒中，能有效發(fā)揮各自的優(yōu)勢(shì)，用于基因和光熱聯(lián)合治療乳腺癌，與單一治療相比，具有更優(yōu)療效，本發(fā)明所制備的pei嫁接omcn的載體，與單純omcn相比，表面修飾pei后808nm的吸收增加，產(chǎn)熱能力提高，與單純pei相比，通過omcn做支撐，細(xì)胞毒性降低，基因轉(zhuǎn)染能力增強(qiáng)。

本發(fā)明為腫瘤治療提供了新的高效低毒的光熱-基因聯(lián)合的干預(yù)技術(shù)，有助于提高腫瘤治療效果。

附圖說明

圖1載體材料和納米粒的物理表征結(jié)果，

其中，a：op的透射電鏡圖(插入圖：opi的透射電鏡圖)，

b：opi的x射線光電子能譜圖。

圖2載體材料和納米粒的性質(zhì)表征結(jié)果，

其中，a：不同載體材料和納米粒的zeta電位結(jié)果，

b：omcn和op的紫外-可見吸收光譜曲線，

c：固定808nm激光照射能量強(qiáng)度為4.5w/cm²，不同濃度op的熱效應(yīng)曲線，

d：固定濃度為45μg/ml，不同能量強(qiáng)度近紅外激光照射下op的熱效應(yīng)曲線，

e：瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，

f：不同納米粒在mcf-7乳腺癌細(xì)胞上的基因轉(zhuǎn)染效果，

g：近紅外光觸發(fā)的dna釋放結(jié)果。

圖3cck-8檢測(cè)法定量評(píng)價(jià)不同處理對(duì)mcf-7乳腺癌細(xì)胞的毒性結(jié)果。

圖4共聚焦顯微鏡觀察mcf-7細(xì)胞經(jīng)不同處理后的死亡-存活情況，

其中，綠色表示活細(xì)胞，紅色表示死細(xì)胞，bar＝200μm。

圖5mcf-7荷瘤裸鼠尾靜脈注射生理鹽水和opi后經(jīng)808nm激光照射的體內(nèi)熱效應(yīng)結(jié)果，

其中：能量強(qiáng)度為1w/cm²，持續(xù)時(shí)間為5min，

a：熱成像圖譜，

b：相應(yīng)的熱效應(yīng)定量測(cè)定結(jié)果。

圖6tunel法測(cè)定mcf-7荷瘤裸鼠尾靜脈注射不同制劑后的細(xì)胞凋亡結(jié)果，

其中：藍(lán)色表示dapi染色的細(xì)胞核，綠色表示fitc標(biāo)記的凋亡細(xì)胞。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1.

精確稱量1mgomcn分散于0.2mledc溶液(10mg·ml^-1，ph5.0的mes緩沖液)和0.2mlnhs溶液(4mg·ml^-1，ph5.0的mes緩沖液)中攪拌2h，激活羧基，加入過量pei(與omcn的質(zhì)量比為2:1)攪拌24h，8000rpm離心12min，水洗純化，即得op。

實(shí)施例2.

精確稱量1mgomcn分散于0.2mledc溶液(10mg·ml^-1，ph6.0的mes緩沖液)和0.2mlnhs溶液(4mg·ml^-1，ph6.0的mes緩沖液)中攪拌2h，激活羧基，加入過量pei(與omcn的質(zhì)量比為2:1)攪拌24h，8000rpm離心12min，水洗純化，即得op。

實(shí)施例3.

精確稱量1mgomcn分散于0.5mledc溶液(10mg·ml^-1，ph6.0的mes緩沖液)和0.5mlnhs溶液(4mg·ml^-1，ph6.0的mes緩沖液)中攪拌2h，激活羧基，加入過量pei(與omcn的質(zhì)量比為2:1)攪拌24h，8000rpm離心12min，水洗純化，即得op。

實(shí)施例4.

精確稱量1mgomcn分散于0.2mledc溶液(10mg·ml^-1，ph6.0的mes緩沖液)和0.2mlnhs溶液(4mg·ml^-1，ph6.0的mes緩沖液)中攪拌3h，激活羧基，加入過量pei(與omcn的質(zhì)量比為2:1)攪拌24h，8000rpm離心12min，水洗純化，即得op。

實(shí)施例5.

精確稱量1mgomcn分散于0.2mledc溶液(10mg·ml^-1，ph6.0的mes緩沖液)和0.2mlnhs溶液(4mg·ml^-1，ph6.0的mes緩沖液)中攪拌2h，激活羧基，加入過量pei(與omcn的質(zhì)量比為4:1)攪拌24h，8000rpm離心12min，水洗純化，即得op。

實(shí)施例6.

精確稱量1mgomcn分散于0.2mledc溶液(10mg·ml^-1，ph6.0的mes緩沖液)和0.2mlnhs溶液(4mg·ml^-1，ph6.0的mes緩沖液)中攪拌2h，激活羧基，加入過量pei(與omcn的質(zhì)量比為6:1)攪拌24h，8000rpm離心12min，水洗純化，即得op。

實(shí)施例7.

精確稱量1mgomcn分散于0.2mledc溶液(10mg·ml^-1，ph6.0的mes緩沖液)和0.2mlnhs溶液(4mg·ml^-1，ph6.0的mes緩沖液)中攪拌2h，激活羧基，加入過量pei(與omcn的質(zhì)量比為2:1)攪拌36h，8000rpm離心12min，水洗純化，即得op。

實(shí)施例8.

精確稱量1mgomcn分散于0.2mledc溶液(10mg·ml^-1，ph6.0的mes緩沖液)和0.2mlnhs溶液(4mg·ml^-1，ph6.0的mes緩沖液)中攪拌2h，激活羧基，加入過量pei(與omcn的質(zhì)量比為2:1)攪拌48h，8000rpm離心12min，水洗純化，即得op。

實(shí)施例9.

精確稱量1mgomcn分散于0.2mledc溶液(10mg·ml^-1，ph6.0的mes緩沖液)和0.2mlnhs溶液(4mg·ml^-1，ph6.0的mes緩沖液)中攪拌2h，激活羧基，加入過量pei(與omcn的質(zhì)量比為2:1)攪拌24h，10000rpm離心10min，水洗純化，即得op。

實(shí)施例10.

精確稱量1mgomcn分散于0.2mledc溶液(10mg·ml^-1，ph6.0的mes緩沖液)和0.2mlnhs溶液(4mg·ml^-1，ph6.0的mes緩沖液)中攪拌2h，激活羧基，加入過量pei(與omcn的質(zhì)量比為2:1)攪拌24h，12000rpm離心8min，水洗純化，即得op。

實(shí)施例11.

精確稱量1mg實(shí)施例2合成的op與0.5mg編碼生長(zhǎng)抑制因子4(ing4)的質(zhì)粒dna混合，漩渦30s，室溫孵育30min，即得op的載基因納米粒opi。

實(shí)施例12.

精確稱量1mg實(shí)施例2合成的op與0.1mg編碼ing4的質(zhì)粒dna混合，漩渦30s，室溫孵育30min，即得op的載基因納米粒opi。

實(shí)施例13.

精確稱量1mg實(shí)施例2合成的op與1mg編碼ing4的質(zhì)粒dna混合，漩渦30s，室溫孵育30min，即得op的載基因納米粒opi。

實(shí)施例14.

精確稱量1mg實(shí)施例2合成的op與0.5mg編碼ing4的質(zhì)粒dna混合，漩渦30s，室溫孵育20min，即得op的載基因納米粒opi。

實(shí)施例15.

精確稱量1mg實(shí)施例2合成的op與0.5mg編碼ing4的質(zhì)粒dna混合，漩渦30s，室溫孵育2h，即得op的載基因納米粒opi。

實(shí)施例16.

精確稱量1mg實(shí)施例2合成的op與0.5mg編碼ing4的質(zhì)粒dna混合，漩渦30s，室溫孵育4h，即得op的載基因納米粒opi。

實(shí)施例17.

精確稱量1mg實(shí)施例2合成的op與0.5mg編碼綠色熒光蛋白的質(zhì)粒dna混合，漩渦30s，室溫孵育30min，即得op的載基因納米粒ope。

實(shí)施例18.

精確稱量1mg實(shí)施例2合成的op與0.5mg編碼熒光素酶的質(zhì)粒dna混合，漩渦30s，室溫孵育30min，即得op的載基因納米粒opg。

實(shí)施例19.

通過jem2100f透射電鏡觀察實(shí)施例2合成的op和實(shí)施例11制備的opi的形貌，結(jié)果顯示所合成的納米載體及載基因后的納米粒均呈球形，表面較為圓整，有一層明顯聚合物包裹(如圖1a所示)。

實(shí)施例20.

通過phi-5000cescasystemx射線光電子能譜觀察實(shí)施例11制備的opi的元素組成，結(jié)果顯示所制備的納米粒中含有o、n、c和p元素(如圖1b所示)。

實(shí)施例21.

通過zeta電位測(cè)定儀測(cè)定不同載體材料和納米粒的表面電荷，結(jié)果顯示omcn荷負(fù)電，表面修飾陽(yáng)離子pei后荷正電，負(fù)載陰性質(zhì)粒dna后電荷降低，符合規(guī)律(如圖2a所示)。

實(shí)施例22.

通過紫外-可見分光光度計(jì)獲取載體的實(shí)施例2所合成的op以及omcn的紫外-可見吸收光譜曲線，結(jié)果顯示，在808nm處omcn和op均有吸收，omcn經(jīng)pei修飾后808nm處的吸收增強(qiáng)(如圖2b所示)。

實(shí)施例23.

使用808納米的近紅外激光照射，測(cè)定實(shí)施例2所合成op的熱效應(yīng)。固定照射能量強(qiáng)度為4.5w/cm²，測(cè)定不同濃度op的熱效應(yīng)曲線。結(jié)果顯示，隨著op的濃度增加，熱效應(yīng)增加，op的熱效應(yīng)呈濃度依賴性(如圖2c所示)。

實(shí)施例24.

使用808納米的近紅外激光照射，測(cè)定實(shí)施例2所合成op的熱效應(yīng)。固定op濃度為45μg/ml，測(cè)定不同能量強(qiáng)度照射下op的熱效應(yīng)曲線。結(jié)果顯示，隨著能量照射強(qiáng)度增加，熱效應(yīng)增加，op的熱效應(yīng)呈能量強(qiáng)度依賴性(如圖2d所示)。

實(shí)施例25.

使用瓊脂糖凝膠電泳考察實(shí)施例2所合成op包載質(zhì)粒dna的能力。結(jié)果顯示，所合成op具有良好的包封質(zhì)粒dna的能力(如圖2e所示)。

實(shí)施例26.

通過倒置熒光顯微鏡觀察實(shí)施例17所制備ope和單純pei在mcf-7乳腺癌細(xì)胞上的基因轉(zhuǎn)染效率差異。結(jié)果顯示，ope具有高gfp表達(dá)效率，同樣條件下，pei介導(dǎo)的基因表達(dá)效率明顯降低，細(xì)胞毒性大(如圖2f所示)。

實(shí)施例27.

使用瓊脂糖凝膠電泳考察實(shí)施例18所制備opg在近紅外光觸發(fā)下質(zhì)粒dna從載體材料中釋放的效應(yīng)。結(jié)果顯示，在近紅外光觸發(fā)下，op和質(zhì)粒dna的結(jié)合會(huì)逐漸松散，基因藥物逐漸釋放(如圖2g所示)。

實(shí)施例28.

使用cck-8檢測(cè)法定量評(píng)價(jià)不同處理對(duì)mcf-7乳腺癌細(xì)胞的毒性。將實(shí)施例18所制備的opg和實(shí)施例11所制備的opi配制成系列濃度，與mcf-7細(xì)胞避光孵育6h，對(duì)光熱治療組用近紅外激光照射5分鐘，能量密度為4.5w/cm²，繼續(xù)孵育42h，按照cck-8使用說明定量檢測(cè)細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，細(xì)胞毒性隨著納米粒濃度增加而增加，同一濃度下，包載治療基因的opi對(duì)mcf-7細(xì)胞毒性比包載報(bào)告基因的opg大，對(duì)于同一種納米粒，近紅外光照射后細(xì)胞毒性增加(如圖3所示)。

實(shí)施例29.

使用共聚焦顯微鏡觀察mcf-7細(xì)胞經(jīng)不同處理后的死亡-存活情況。將實(shí)施例18所制備的opg和實(shí)施例11所制備的opi分別與mcf-7細(xì)胞避光孵育6h，濃度為45μg/ml，對(duì)光熱治療組用近紅外激光照射5分鐘，能量密度為4.5w/cm²，繼續(xù)孵育42h，按照l(shuí)ive-dead試劑染色說明進(jìn)行細(xì)胞染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察，活細(xì)胞呈綠色，死細(xì)胞呈紅色。結(jié)果顯示，基因和光熱治療聯(lián)合治療組(opi+nir組)的腫瘤細(xì)胞死亡明顯高于單純的光熱治療組(opg+nir組)或單純的基因治療組(opi組)，提示協(xié)同的聯(lián)合治療效果。結(jié)果還顯示，包載報(bào)告基因的opg沒有明顯的細(xì)胞毒性(如圖4所示)。

實(shí)施例30.

使用熱成像儀檢測(cè)荷瘤裸鼠體內(nèi)熱效應(yīng)效果。構(gòu)建mcf-7荷瘤裸鼠模型，尾靜脈注射生理鹽水和實(shí)施例11所制備的opi后經(jīng)808nm激光照射5min，能量密度為1w/cm²，熱成像儀記錄不同時(shí)間點(diǎn)的熱效應(yīng)圖像和溫度。結(jié)果顯示，opi組隨著近紅外照射時(shí)間延長(zhǎng)，產(chǎn)熱溫度提高，明顯高于生理鹽水組，提示opi在體內(nèi)具有良好的熱效應(yīng)(如圖5所示)。

實(shí)施例31.

使用tunel法測(cè)定mcf-7荷瘤裸鼠尾靜脈注射不同制劑后的細(xì)胞凋亡情況。構(gòu)建mcf-7荷瘤裸鼠模型，尾靜脈注射生理鹽水、游離阿霉素、實(shí)施例18所制備的opg和實(shí)施例11所制備的opi，光熱治療組另經(jīng)808nm激光照射5min，能量密度為1w/cm²，每隔兩天處理一次，共處理2次。處死裸鼠，取皮下腫瘤，冰凍切片，按照tunel試劑盒說明測(cè)定凋亡情況，藍(lán)色表示dapi染色的細(xì)胞核，綠色表示fitc標(biāo)記的凋亡細(xì)胞。結(jié)果顯示，基因和光熱聯(lián)合治療組(opi+nir組)的腫瘤死亡效果明顯高于單純的光熱治療組(opg+nir組)或單純的基因治療組(opi組)，提示聯(lián)合治療的協(xié)同效果(如圖6所示)。