本發(fā)明屬于納米生物材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種酶促小分子自組裝制備納米凝膠的方法。

背景技術(shù)：

水凝膠是以水為分散介質(zhì)的凝膠，在具有網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)的水溶性高分子中引入一部分疏水基團(tuán)和親水殘基，親水殘基與水分子結(jié)合，將水分子連接在網(wǎng)狀內(nèi)部，而疏水殘基遇水膨脹。

隨著水凝膠技術(shù)的不斷發(fā)展，水凝膠的研究逐步從大塊凝膠，到微凝膠，再到納米凝膠。納米凝膠是一類通過物理或者化學(xué)交聯(lián)的具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的納米尺度的水凝膠微粒，通常由高分子單體聚合而成，直徑在200nm以下。納米凝膠相對于其它凝膠來說，具有以下優(yōu)勢：一、尺寸小，容易被細(xì)胞吞噬；二、容易穿透人體中的各種保護(hù)膜，如腦膜，從而可以實(shí)現(xiàn)腦部給藥；三、載藥效率高。因此，近年來納米凝膠受到了人們越來越多的關(guān)注。

目前，納米凝膠的制備方法主要為共混法，即將無機(jī)納米粒子與聚合物按照不同的工藝復(fù)合而成，是目前制備聚合物納米復(fù)合水凝膠最簡單的一種方法，該方法的優(yōu)點(diǎn)是納米粒子與聚合物的制備分開進(jìn)行，可有效控制納米粒子的形態(tài)和尺寸，但缺點(diǎn)是共混時(shí)納米粒子易發(fā)生團(tuán)聚，不易分散。

酶催化聚合反應(yīng)是近年來研究的熱點(diǎn)之一，在制備水凝膠方面，由于酶具有高效、專一、穩(wěn)定的特點(diǎn)，使得它成為了當(dāng)前制備水凝膠最有發(fā)展前景的方法之一。酶催化自由基聚合屬于酶催化聚合的一種，近幾年用這種方法制備水凝膠逐漸走進(jìn)了大家的視野，這種方法制得的水凝膠在調(diào)節(jié)物理和化學(xué)性質(zhì)方面非常靈活，并且具有很好的酶響應(yīng)性。但目前尚未有簡單易行的方法，利用酶催化聚合反應(yīng)制備出性能優(yōu)異的納米凝膠。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種納米凝膠分散性好且簡單易行的酶促小分子自組裝制備納米凝膠的方法。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

一種酶促小分子自組裝制備納米凝膠的方法，該方法是先依次對納米顆粒的表面進(jìn)行氨基化修飾、羧基化修飾，之后通過酰胺反應(yīng)將酶修飾在納米顆粒表面，最后加入小分子肽，在酶的作用下，小分子肽轉(zhuǎn)化為凝膠因子，并在納米顆粒表面自組裝形成納米凝膠。新形成的凝膠因子優(yōu)先在納米顆粒表面組裝，從而形成凝膠包裹在納米顆粒表面。

該方法具體包括以下步驟：

(1)納米顆粒的氨基化修飾：將納米顆粒分散在溶劑中，之后加入氨基硅烷偶聯(lián)劑，并在40-70℃下反應(yīng)8-24h，洗滌后得到氨基化修飾的納米顆粒；

(2)納米顆粒的羧基化修飾：將氨基化修飾的納米顆粒分散在有機(jī)溶劑中，之后加入丁二酸酐，并攪拌6-18h，洗滌后得到羧基化修飾的納米顆粒；

(3)納米顆粒的酶修飾：將羧基化修飾的納米顆粒分散在生物緩沖液中，并調(diào)節(jié)ph值至5-6，活化羧基后，加入酶并進(jìn)行酰胺反應(yīng)，洗滌后得到酶修飾的納米顆粒；

(4)納米顆粒表面小分子自組裝制備納米凝膠：將酶修飾的納米顆粒分散在溶劑中，并調(diào)節(jié)ph值至7-8，之后加入小分子肽，攪拌反應(yīng)6-12h后，即得到所述的納米凝膠。

所述的納米顆粒包括二氧化硅納米顆?；蛩难趸F納米顆粒中的一種或兩種。其中，二氧化硅納米顆粒采用水解法制備，調(diào)節(jié)不同成分的比例能夠制備出不同直徑的二氧化硅納米顆粒。若選用四氧化三鐵納米顆粒，當(dāng)酶修飾的四氧化三鐵納米顆粒接觸到小分子肽時(shí)，酶催化反應(yīng)發(fā)生在四氧化三鐵納米顆粒的表面，在這個(gè)表面產(chǎn)生凝膠因子，隨著催化反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，四氧化三鐵納米顆粒表面的凝膠因子濃度增加，隨即進(jìn)行自組裝形成一層水凝膠，凝膠層形成以后阻止了酶與小分子肽反應(yīng)，所以只會(huì)形成納米凝膠而非宏觀水凝膠。

所述的納米顆粒的粒徑為180-220nm。優(yōu)選為200nm，200nm的尺寸有利于后續(xù)的生物應(yīng)用，例如比較容易穿透屏障到達(dá)腫瘤癌癥等病變部位，用于藥物載體，由于被動(dòng)運(yùn)輸?shù)淖饔?，能夠?qū)崿F(xiàn)藥物控釋和靶向治療。

步驟(1)及步驟(4)中，所述的溶劑包括水或乙醇中的一種或兩種；步驟(2)中，所述的有機(jī)溶劑包括n,n-二甲基甲酰胺或n-甲基吡咯烷酮中的一種或兩種；步驟(3)中，所述的生物緩沖液包括2-嗎啉乙磺酸或檸檬酸中的一種或兩種。

步驟(1)中，所述的氨基硅烷偶聯(lián)劑包括3-氨丙基三乙氧基硅烷或3-氨丙基三甲氧基硅烷中的一種或兩種；步驟(3)中，所述的酶包括羧酸酯酶或酸性磷酸酶中的一種或兩種。

步驟(4)中，所述的小分子肽包括napffes或fmoc-tyr(h2po3)-oh中的一種或兩種，所述的napffes的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下式所示：

所述的fmoc-tyr(h2po3)-oh的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下式所示：

步驟(3)中，所述的活化羧基過程為：加入nhs及edc，之后攪拌1.5-2.5h即可，每100ml生物緩沖液中分別加入100-120mg所述的nhs及220-240mg所述的edc。nhs為n-羥基琥珀酰亞胺，edc為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽。

步驟(3)中所述的酰胺反應(yīng)過程中，反應(yīng)溫度為15-35℃，反應(yīng)時(shí)間為5-7h。

步驟(1)中，每100ml溶劑中，分別加入800-1200mg所述的納米顆粒及0.8-0.9ml所述的氨基硅烷偶聯(lián)劑；

步驟(2)中，每100ml有機(jī)溶劑中，分別加入800-1200mg所述的氨基化修飾的納米顆粒及80-120mg所述的丁二酸酐；

步驟(3)中，每100ml生物緩沖液中，分別加入80-120mg所述的羧基化修飾的納米顆粒及40-60mg所述的酶；

步驟(4)中，每100ml溶劑中，分別加入80-120mg所述的酶修飾的納米顆粒及15-25mg所述的小分子肽。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點(diǎn)：

1)通過酶促進(jìn)小分子肽轉(zhuǎn)化為凝膠因子，并優(yōu)先在納米顆粒表面組裝成小分子凝膠，進(jìn)而制備出納米凝膠，該納米凝膠具有生物活性和多功能性，可作為生長因子、藥物及細(xì)胞的載體，應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)、傷口修復(fù)的治療等，為納米凝膠的制備提供了新的思路，豐富了納米凝膠的制備方法，且本發(fā)明具有溫和高效、生物相容性強(qiáng)等優(yōu)勢，大大減少了各類溶劑清洗的時(shí)間和成本，有利于后續(xù)的生物顯影、hifu超聲等生物應(yīng)用；

2)通過改變小分子肽的濃度，能夠?qū)崿F(xiàn)凝膠層的厚度可控，隨著凝膠層厚度的增加，表面電勢會(huì)發(fā)生相應(yīng)改變，且該體系成膠安全高效，具有良好的強(qiáng)度和生物活性，能夠在應(yīng)用在細(xì)胞培養(yǎng)或組織工程等領(lǐng)域；

3)可通過改變各組分的濃度或用量，調(diào)控納米凝膠的交聯(lián)率與成膠速度，并可根據(jù)需要實(shí)現(xiàn)原位成膠，靈活性好。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中納米凝膠的制備過程示意圖；

圖2為實(shí)施例1中制備得到的napffes的nmr圖譜；

圖3為實(shí)施例1中制備得到的sio2納米顆粒及納米凝膠的sem圖譜；

圖4為實(shí)施例2中納米凝膠的制備過程示意圖；

圖5為實(shí)施例1中制備得到的fe3o4納米顆粒及納米凝膠的sem圖譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。本實(shí)施例以本發(fā)明技術(shù)方案為前提進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1：

一種酶促小分子自組裝制備納米凝膠的方法如圖1所示，具體包括以下步驟：

(1)sio2納米顆粒的合成：

將147ml無水乙醇、2.5ml去離子水、7.5ml氨水于40℃下攪拌均勻，再向其中加入2.8ml正硅酸乙酯水解3h，之后離心，并用無水乙醇洗滌三次，得到硅球，即sio2納米顆粒。

(2)固相合成法制備napff：

(2-1)稱取0.3g(0.405mmol)2-氯三苯甲基氯樹脂于固相合成器中，并加入2.5mldmf，之后通入氮?dú)?min，使2-氯三苯甲基氯樹脂充分溶脹；

(2-2)用氮?dú)獍讯燃淄閺难b有2-氯三苯甲基氯樹脂的固相合成器中壓除干凈；

(2-3)將314mg(0.81mmol)fmoc保護(hù)的氨基酸溶解在2ml的dmf里，加入145μl(0.83mmol)diea(n,n-二異丙基乙胺)，然后轉(zhuǎn)移到上述固相合成器中，通入氮?dú)?，在室溫下反?yīng)2h；

(2-4)加入130μl甲醇于固相合成器中，反應(yīng)5分鐘，把該固相合成器中液體壓凈，用2.5mldmf洗滌三次，每次30s，再用5ml含哌啶體積百分比20％的dmf洗滌，最后用2.5mldmf清洗3次，每次30s；

(2-5)取第二個(gè)fmoc保護(hù)的氨基酸256mg(0.673mmol)、120μl(0.573mmol)diea和2.5ml無水dmf制成溶液，把配好的溶液加入到上述固相合成器中，通入氮?dú)夥磻?yīng)2h；

(2-6)重復(fù)(2-5)方法依次加入所有需要的氨基酸，然后用dmf洗滌3遍，再用環(huán)己烷和異丙醇各洗三遍，每次1ml；

(2-7)按三氟乙酸與無水二氯甲烷的體積比1:9，配制成體積百分比濃度為10％的三氟乙酸溶液，把產(chǎn)物從2-氯三苯甲基氯樹脂上切下，濃縮，加入ph＝3稀鹽酸以除去殘留的三氟乙酸，用油泵抽干，得到粗品，之后用hplc分離提純，即制得napff，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下式所示：

(3)napffes的合成：

(3-1)將480mg(1mmol)napff、115mg(1mmol)nhs溶解在20mlthf里，之后加入230mg(1.2mmol)edc，活化2h，再加入過量的乙醇胺(2ml)反應(yīng)6h，然后旋蒸濃縮，用ph＝3的稀鹽酸洗滌三次，凍干，得到固體；

(3-2)將(3-1)反應(yīng)得到的固體溶于20ml三氯甲烷中，加入3mmol(0.5ml)diea(n,n-二異丙基乙胺)和3mmol(300mg)丁二酸酐，反應(yīng)一晚上，過濾，取其濾液旋蒸，用ph＝3稀鹽酸洗滌三次，凍干得到粗品，用hplc分離提純，即得到napffes。

圖2為制備得到的napffes的nmr圖譜，由圖2可以看出，通過上述步驟，合成出了小分子肽napffes。

(4)硅球表面氨基化修飾：將(1)中制備好的硅球，分散到120ml乙醇中，于40℃下攪拌，并向其中加入1ml的氨基硅烷偶聯(lián)劑(3-氨丙基三乙氧基硅烷)，反應(yīng)一晚上，用乙醇洗滌數(shù)遍。

(5)硅球表面羧基化修飾：將(4)中制備好的氨基化的硅球用乙醇洗滌后分散到dmf中，向其中加入三倍的diea(1ml)和三倍的丁二酸酐(100mg)，攪拌6h，反應(yīng)完全后用乙醇洗滌三遍，再用去離子水洗滌三遍，凍干以備用。

(6)硅球表面修飾酯酶：將(5)羧基化的硅球分散到去2-嗎啉乙磺酸100ml中，調(diào)節(jié)ph，使ph約5.5左右，加入1mmolnhs(115mg)、1.2mmoledc(230mg)活化羧基2h，然后加入50mg的羧酸酯酶室溫?cái)嚢?h，之后用去離子水洗滌三次，凍干后備用。

(7)硅球表面小分子自組裝納米凝膠制備：100mg修飾好酯酶的硅球分散到100ml去離子水中，調(diào)節(jié)ph使ph約等于7.5，向其中加入20mg的napffes反應(yīng)一晚上，在酯酶作用下前驅(qū)體napffes變?yōu)槟z因子napffe，在二氧化硅表面自組裝形成納米凝膠。然后洗滌超聲，重新分散到水里得到納米凝膠，或者凍干以備用。其中，napffes化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下式所示：

圖3為制備得到的sio2納米顆粒及納米凝膠的sem圖譜，由圖4可以看出，制備得到的納米凝膠中，sio2納米顆粒表面裹有一層水凝膠層。

實(shí)施例2：

一種酶促小分子自組裝制備納米凝膠的方法如圖4所示，具體包括以下步驟：

(1)fe3o4納米顆粒的合成：

先將0.54gfecl3溶解于20ml乙二醇和二乙二醇的混合溶液中(veg/vdeg＝3/17)，攪拌30min后，加入2g聚乙烯吡咯烷酮(pvp，k30)，然后加熱至120℃，并在攪拌下通入n2，形成透明溶液，反應(yīng)1h后，加入1.5gnaoac，并停止加熱，劇烈攪拌30min后，將溶液轉(zhuǎn)移至50ml聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，再將反應(yīng)釜置于200℃烘箱中保持12h。反應(yīng)完成后冷卻至室溫，取出反應(yīng)釜，得到的黑色產(chǎn)物即磁性納米四氧化三鐵粒子(mnps)，先后用乙醇和去離子水清洗幾次，之后分散在20ml去離子水中備用。

(2)四氧化三鐵(fe3o4)納米顆粒的表面修飾

取2ml上述制備的fe3o4分散在80ml乙醇和80ml去離子水的混合液中，超聲分散30min后，加入6mlaptes(3-氨丙基三乙氧基硅烷)，并在70℃加熱攪拌下反應(yīng)24h，同時(shí)通入n2。反應(yīng)完成后，分別用乙醇和去離子水清洗幾次，得到的顆粒為表面氨基化的四氧化三鐵，即fe3o4-aptes。接著將fe3o4-aptes分散在100mldmf中，再加入10％的丁二酸酐，攪拌反應(yīng)18h，之后用乙醇和水清洗，得到表面羧基化的四氧化三鐵fe3o4-cooh，將fe3o4-cooh分散在20ml去離子水中備用。

(3)四氧化三鐵(fe3o4)納米水凝膠的制備

將fe3o4-cooh用酸性磷酸酶(ap)修飾后，分散于100ml濃度為0.5mg/ml的fmoc-tyr(h2po3)-oh溶液中，超聲分散后，攪拌一定時(shí)間，待自組裝完成后磁分離除去未反應(yīng)的物質(zhì)，再用去離子水清洗三次得到納米凝膠，將納米凝膠分散在去離子水中備用。

四氧化三鐵納米水凝膠在制備過程中，通過酸性磷酸酶的酶切作用除去fmoc-tyr(h2po3)-oh中的磷酸根，使小分子fmoc-tyr(h2po3)-oh變?yōu)閒moc-tyr-oh，由親水性變?yōu)槭杷裕琭moc-tyr-oh由于疏水性在fe3o4顆粒表面自組裝，形成一層小分子凝膠。

圖5為制備得到的fe3o4納米顆粒及納米凝膠的sem圖譜，由圖5可以看出，制備得到的納米凝膠中，fe3o4納米顆粒表面裹有一層水凝膠層。

實(shí)施例3：

一種酶促小分子自組裝制備納米凝膠的方法，該方法是先依次對納米顆粒的表面進(jìn)行氨基化修飾、羧基化修飾，之后通過酰胺反應(yīng)將酶修飾在納米顆粒表面，最后加入小分子肽，在酶的作用下，小分子肽轉(zhuǎn)化為凝膠因子，并在納米顆粒表面自組裝形成納米凝膠。

該方法具體包括以下步驟：

(1)納米顆粒的氨基化修飾：將納米顆粒分散在溶劑中，之后加入氨基硅烷偶聯(lián)劑，并在40℃下反應(yīng)24h，洗滌后得到氨基化修飾的納米顆粒，其中，每100ml溶劑中，分別加入800mg納米顆粒及0.9ml氨基硅烷偶聯(lián)劑；

(2)納米顆粒的羧基化修飾：將氨基化修飾的納米顆粒分散在有機(jī)溶劑中，之后加入丁二酸酐，并攪拌12h，洗滌后得到羧基化修飾的納米顆粒，其中，每100ml有機(jī)溶劑中，分別加入1000mg氨基化修飾的納米顆粒及100mg丁二酸酐；

(3)納米顆粒的酶修飾：將羧基化修飾的納米顆粒分散在生物緩沖液中，并調(diào)節(jié)ph值至6，之后加入nhs及edc，并攪拌1.5h活化羧基，再加入酶，并在35℃進(jìn)行酰胺反應(yīng)5h，洗滌后得到酶修飾的納米顆粒，其中，每100ml生物緩沖液中，分別加入120mgnhs、220mgedc、120mg羧基化修飾的納米顆粒及40mg酶；

(4)納米顆粒表面小分子自組裝制備納米凝膠：將酶修飾的納米顆粒分散在溶劑中，并調(diào)節(jié)ph值至7.5，之后加入小分子肽，攪拌反應(yīng)9h后，即得到納米凝膠，其中，每100ml溶劑中，分別加入100mg酶修飾的納米顆粒及20mg小分子肽。

其中，納米顆粒為二氧化硅納米顆粒，納米顆粒的粒徑為200nm。步驟(1)及步驟(4)中，溶劑為水；步驟(2)中，有機(jī)溶劑為n-甲基吡咯烷酮；步驟(3)中，生物緩沖液為2-嗎啉乙磺酸。步驟(1)中，氨基硅烷偶聯(lián)劑包括3-氨丙基三乙氧基硅烷和3-氨丙基三甲氧基硅烷；步驟(3)中，酶為羧酸酯酶。步驟(4)中，小分子肽為napffes，napffes的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下式所示：

實(shí)施例4：

一種酶促小分子自組裝制備納米凝膠的方法，該方法是先依次對納米顆粒的表面進(jìn)行氨基化修飾、羧基化修飾，之后通過酰胺反應(yīng)將酶修飾在納米顆粒表面，最后加入小分子肽，在酶的作用下，小分子肽轉(zhuǎn)化為凝膠因子，并在納米顆粒表面自組裝形成納米凝膠。

該方法具體包括以下步驟：

(1)納米顆粒的氨基化修飾：將納米顆粒分散在溶劑中，之后加入氨基硅烷偶聯(lián)劑，并在70℃下反應(yīng)8h，洗滌后得到氨基化修飾的納米顆粒，其中，每100ml溶劑中，分別加入1200mg納米顆粒及0.8ml氨基硅烷偶聯(lián)劑；

(2)納米顆粒的羧基化修飾：將氨基化修飾的納米顆粒分散在有機(jī)溶劑中，之后加入丁二酸酐，并攪拌18h，洗滌后得到羧基化修飾的納米顆粒，其中，每100ml有機(jī)溶劑中，分別加入800mg氨基化修飾的納米顆粒及120mg丁二酸酐；

(3)納米顆粒的酶修飾：將羧基化修飾的納米顆粒分散在生物緩沖液中，并調(diào)節(jié)ph值至5，之后加入nhs及edc，并攪拌2.5h活化羧基，再加入酶，并在15℃進(jìn)行酰胺反應(yīng)7h，洗滌后得到酶修飾的納米顆粒，其中，每100ml生物緩沖液中，分別加入100mgnhs、240mgedc、80mg羧基化修飾的納米顆粒及60mg酶；

(4)納米顆粒表面小分子自組裝制備納米凝膠：將酶修飾的納米顆粒分散在溶劑中，并調(diào)節(jié)ph值至7，之后加入小分子肽，攪拌反應(yīng)12h后，即得到納米凝膠，其中，每100ml溶劑中，分別加入80mg酶修飾的納米顆粒及25mg小分子肽。

其中，納米顆粒為四氧化三鐵納米顆粒，納米顆粒的粒徑為220nm。步驟(1)及步驟(4)中，溶劑為乙醇；步驟(2)中，有機(jī)溶劑包括n,n-二甲基甲酰胺和n-甲基吡咯烷酮；步驟(3)中，生物緩沖液包括2-嗎啉乙磺酸和檸檬酸。步驟(1)中，氨基硅烷偶聯(lián)劑為3-氨丙基三甲氧基硅烷；步驟(3)中，酶為酸性磷酸酶。步驟(4)中，小分子肽為fmoc-tyr(h2po3)-oh。

實(shí)施例5：

一種酶促小分子自組裝制備納米凝膠的方法，該方法是先依次對納米顆粒的表面進(jìn)行氨基化修飾、羧基化修飾，之后通過酰胺反應(yīng)將酶修飾在納米顆粒表面，最后加入小分子肽，在酶的作用下，小分子肽轉(zhuǎn)化為凝膠因子，并在納米顆粒表面自組裝形成納米凝膠。

該方法具體包括以下步驟：

(1)納米顆粒的氨基化修飾：將納米顆粒分散在溶劑中，之后加入氨基硅烷偶聯(lián)劑，并在55℃下反應(yīng)16h，洗滌后得到氨基化修飾的納米顆粒，其中，每100ml溶劑中，分別加入1000mg納米顆粒及0.85ml氨基硅烷偶聯(lián)劑；

(2)納米顆粒的羧基化修飾：將氨基化修飾的納米顆粒分散在有機(jī)溶劑中，之后加入丁二酸酐，并攪拌6h，洗滌后得到羧基化修飾的納米顆粒，其中，每100ml有機(jī)溶劑中，分別加入1200mg氨基化修飾的納米顆粒及80mg丁二酸酐；

(3)納米顆粒的酶修飾：將羧基化修飾的納米顆粒分散在生物緩沖液中，并調(diào)節(jié)ph值至5.5，之后加入nhs及edc，并攪拌2h活化羧基，再加入酶，并在20℃進(jìn)行酰胺反應(yīng)6h，洗滌后得到酶修飾的納米顆粒，其中，每100ml生物緩沖液中，分別加入110mgnhs、230mgedc、100mg羧基化修飾的納米顆粒及50mg酶；

(4)納米顆粒表面小分子自組裝制備納米凝膠：將酶修飾的納米顆粒分散在溶劑中，并調(diào)節(jié)ph值至8，之后加入小分子肽，攪拌反應(yīng)6h后，即得到納米凝膠，其中，每100ml溶劑中，分別加入120mg酶修飾的納米顆粒及15mg小分子肽。

其中，納米顆粒包括二氧化硅納米顆粒和四氧化三鐵納米顆粒，納米顆粒的粒徑為180nm。步驟(1)及步驟(4)中，溶劑包括水和乙醇；步驟(2)中，有機(jī)溶劑為n,n-二甲基甲酰胺；步驟(3)中，生物緩沖液為檸檬酸。步驟(1)中，氨基硅烷偶聯(lián)劑為3-氨丙基三乙氧基硅烷；步驟(3)中，酶包括羧酸酯酶和酸性磷酸酶。步驟(4)中，小分子肽包括napffes和fmoc-tyr(h2po3)-oh，napffes的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下式所示：

上述的對實(shí)施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對這些實(shí)施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應(yīng)用到其他實(shí)施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動(dòng)。因此，本發(fā)明不限于上述實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。