本發(fā)明是有關(guān)于一種用以制備改善惡病質(zhì)的組合物的用途，特別為一種用以制備改善惡病質(zhì)的含硒微生物發(fā)酵液和/或含硒植物萃取液。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，癌癥一直高居全球人類(lèi)死亡原因的前幾位，其中約30％～87％的癌癥病人會(huì)有惡病質(zhì)(cachexia)的癥狀，而其中又約有22％的癌癥病人死于惡病質(zhì)而非腫瘤本身。惡病質(zhì)是癌癥病患體內(nèi)荷爾蒙、新陳代謝異常，或因食物攝取量減少所產(chǎn)生的結(jié)果。再者，癌癥患者若合并化療藥物治療雖可有效的抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，然亦伴隨更嚴(yán)重的肌肉及脂肪的流失。

再者，亦有一些研究亦指出，硒可有效抑制乳癌、肺癌、小腸癌、大腸癌及肝癌的癌細(xì)胞生長(zhǎng)，并引發(fā)癌細(xì)胞的程序性凋亡(apoptosis)。一些研究亦顯示，于惡病質(zhì)的治療上，營(yíng)養(yǎng)的補(bǔ)給并不能減緩病患體重的減少，例如癌癥末期的患者，就算患者增加進(jìn)食的量或提高營(yíng)養(yǎng)的攝取，也無(wú)法預(yù)防或阻止患者體重的持續(xù)下降。

然目前市售微量元素如硒元素相關(guān)營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品，大多為無(wú)機(jī)態(tài)的硒元素，一個(gè)人若服用超過(guò)50微克就會(huì)有中毒危險(xiǎn)，所以醫(yī)師與藥劑師皆會(huì)交待不可攝取過(guò)量。故有機(jī)態(tài)的的硒酵母，就愈來(lái)愈受到人們重視，前述硒酵母，可使礦物質(zhì)硒在釀酒酵母體內(nèi)轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的有機(jī)形態(tài)硒，不但不具毒性，對(duì)人體而言，其吸收度相較無(wú)機(jī)型態(tài)的亞硒酸鈉為高。

然而，現(xiàn)有可將無(wú)機(jī)態(tài)的硒元素轉(zhuǎn)化為有機(jī)形態(tài)硒的微生物，無(wú)論于菌種或菌株都相當(dāng)有限。進(jìn)一步，現(xiàn)有的微生物其有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)率皆不高，故如何有效提升有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)率便成為重要問(wèn)題。另外，前述的有機(jī)硒除可作成錠劑或膠囊而方便人們服用外，若人們平日飲食中，即可藉由攝食蔬菜而補(bǔ)充人體所缺乏的有機(jī)硒，不僅補(bǔ)充方便，且有機(jī)硒攝食來(lái)源多樣化，而更能提高因來(lái)源不同，有機(jī)硒與其它微量元素、蛋白質(zhì)相結(jié)合的可能性，進(jìn)而達(dá)到寓醫(yī)于食、增進(jìn)人體健康的目的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于以上所述，如何提升有機(jī)硒于微生物細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)率，亦提升有機(jī)硒于微生物萃取物、微生物發(fā)酵物、植物萃取液中的量，進(jìn)而可大量生產(chǎn)，降低成本，提供人們方便取得而服用有機(jī)硒為一重要課題。

前述微生物萃取物的有機(jī)硒、微生物發(fā)酵液的有機(jī)硒、植物萃取液的有機(jī)硒給予癌癥或經(jīng)化療所誘導(dǎo)惡病質(zhì)患者，可改善前述患者因患癌癥、或接受化療所導(dǎo)致惡病質(zhì)的現(xiàn)象。

因此，本發(fā)明的目的對(duì)于提升含硒有機(jī)物于微生物萃取物、微生物發(fā)酵液、植物萃取液的量而改善已知含硒有機(jī)物于微生物、植物中含量不足的缺點(diǎn)。此外，本發(fā)明亦對(duì)于減緩因癌癥/腫瘤或因接受化療藥物所導(dǎo)致的惡病質(zhì)具改善功效，進(jìn)而改善惡病質(zhì)患者因已知不易自微生物萃取物、微生物發(fā)酵液、植物萃取液取得足量的含硒有機(jī)微量元素而導(dǎo)致日常生活質(zhì)量不佳的問(wèn)題。

在本發(fā)明實(shí)施例中，提供一種用以制備改善惡病質(zhì)的組合物，其中所述組合物選自含硒微生物萃取物、含硒微生物發(fā)酵液、含硒植物萃取液中的一種或多種。

在本發(fā)明實(shí)施例中，其中含硒微生物是選自含硒釀酒酵母、含硒乳酸菌、含硒樟芝菌絲體中的一種或多種。

在本發(fā)明實(shí)施例中，其中含硒微生物發(fā)酵液是選自含硒樟芝菌絲體發(fā)酵液、含硒釀酒酵母發(fā)酵液、含硒乳酸菌發(fā)酵液中的一種或多種。

在本發(fā)明實(shí)施例中，其中含硒釀酒酵母是選自含硒釀酒酵母c1(saccharomycescerevisiaec1)、含硒釀酒酵母c2(saccharomycescerevisiaec2)、含硒釀酒酵母h1(saccharomycescerevisiaeh1)、含硒釀酒酵母h2(saccharomycescerevisiaeh2)、含硒釀酒酵母h3(saccharomycescerevisiaeh3)中的一種或多種。

在本發(fā)明實(shí)施例中，其中含硒乳酸菌是選自含硒植物乳桿菌lp69(lactobacillusplantarumlp69)、含硒植物乳桿菌pi06(lactobacillusplantarumpi06)、含硒嗜酸乳桿菌la1(lactobacillusacidophilusla1)、含硒芽孢乳酸桿菌sp1(sporolactobacillussp1)、含硒嗜酸乳桿菌la2(lactobacillusacidophilusla2)、含硒植物乳桿菌p1(lactobacillusplantarump1)、含硒副干酪乳桿菌j1(lactobacillusparacaseij1)中的一種或多種。

在本發(fā)明實(shí)施例中，其中含硒植物萃取液是選自含硒蔬菜萃取液、含硒水果萃取液、含硒稻米萃取液、含硒麥萃取液中的一種或多種。

在本發(fā)明實(shí)施例中，其中含硒蔬菜萃取液是選自含硒紅鳳菜萃取液、含硒地瓜葉萃取液、含硒小白菜萃取液、含硒甘藍(lán)萃取液、含硒萵苣萃取液、含硒芥菜萃取液、含硒菠菜萃取液、含硒香菜萃取液、含硒茼蒿萃取液、含硒莧菜萃取液、含硒小青菜萃取液、含硒芹菜萃取液、含硒空心菜萃取液、含硒大白菜萃取液、含硒蓮花白萃取液、含硒苜蓿芽萃取液、含硒豆芽菜萃取液中的一種或多種。

在本發(fā)明實(shí)施例中，其中含硒植物萃取液可為含硒植物發(fā)酵液，其中含硒植物發(fā)酵液是利用樟芝菌絲體、釀酒酵母或乳酸菌中的一種或多種進(jìn)行發(fā)酵而成。

在本發(fā)明實(shí)施例中，其中所述惡病質(zhì)是選自癌癥誘導(dǎo)導(dǎo)致的惡病質(zhì)或/和化療藥物誘導(dǎo)導(dǎo)致的惡病質(zhì)。

在本發(fā)明實(shí)施例中，其中所述組合物有清除自由基的能力。

在本發(fā)明實(shí)施例中，其中所述自由基為dpph(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基。

在本發(fā)明實(shí)施例中，其中所述組合物能縮小10％至98％腫瘤體積。

在本發(fā)明實(shí)施例中，其中所述組合物能縮小30％至95％腫瘤體積。

在本發(fā)明實(shí)施例中，其中所述組合物能降低癌癥的惡病質(zhì)個(gè)體的血清中的tnf-α含量為35pg/ml至75pg/ml。

在本發(fā)明實(shí)施例中，其中所述組合物能降低化療藥物的惡病質(zhì)的個(gè)體的血清中的il-6含量為1.8至16倍。

附圖說(shuō)明

圖1為制備改善惡病質(zhì)的組合物的制程流程圖，其中：a為第一制程流程圖；b為第二制程流程圖。

圖2顯示于100l發(fā)酵槽中有機(jī)硒樟芝菌絲體的發(fā)酵情形。

圖3顯示于100l發(fā)酵槽中有機(jī)硒釀酒酵母的發(fā)酵情形。

圖4顯示于100l發(fā)酵槽中有機(jī)硒乳酸桿菌的發(fā)酵情形。

圖5顯示小鼠肺癌細(xì)胞在含硒釀酒酵母萃取物、含硒樟芝菌絲體萃取物、含硒紅鳳菜萃取液、含硒萵苣萃取液或含硒發(fā)酵液下的存活率。

圖6顯示含硒釀酒酵母萃取物、含硒樟芝菌絲體萃取物、含硒紅鳳菜萃取液、含硒萵苣萃取液或含硒發(fā)酵液清除dpph自由基的能力。

圖7顯示含硒酵母發(fā)酵液、含硒樟芝發(fā)酵菌絲體、含硒紅鳳菜萃取液、含硒地瓜葉萃取液于不同的稀釋倍數(shù)縮小腫瘤大小的能力。

附圖標(biāo)記說(shuō)明：s101、含硒微生物；s103、含硒微生物發(fā)酵液；s105、含硒微生物萃取物；s201、含硒植物；s203、含硒植物萃取液；s205、含硒發(fā)酵混合液。

實(shí)施方式

本發(fā)明是提供一種制備具改善惡病質(zhì)(cachexia)的包含微量元素有機(jī)物的組合物、其用途及其制備方法，其中達(dá)到微量元素有機(jī)物是選自含硒(se)、鈷(co)、錳(mn)、鋅(zn)的有機(jī)物，較佳為含硒有機(jī)物。

硒在自然界中一般以“有機(jī)”與“無(wú)機(jī)”兩種型態(tài)存在。有機(jī)硒較無(wú)機(jī)硒更容易被生物利用，也是最佳的硒補(bǔ)充形式。有機(jī)硒化合物(organoseleniumcompounds)是指分子中含有硒的有機(jī)化合物，如生物體內(nèi)的硒半胱氨酸(selenocysteine)即屬于此類(lèi)，這些有機(jī)硒的生體可利用率較無(wú)機(jī)硒高出甚多，且臨床效果好，毒性低，副作用小，是硒攝取的最佳補(bǔ)充方式。有機(jī)硒具有抗氧化、提升免疫功能、排除人體內(nèi)的毒素及對(duì)抗惡性腫瘤作用。

表一、有機(jī)硒與無(wú)機(jī)硒的比較

本發(fā)明所述微量元素有機(jī)物包括含微量元素的微生物、含微量元素的微生物發(fā)酵液、植物及/或植物萃取物。在實(shí)施例中，含微量元素的微生物為含硒微生物。含硒微生物包括，但不限于，含硒樟芝菌絲體、含硒釀酒酵母、含硒乳酸菌等。

本發(fā)明的含硒微生物發(fā)酵液包括含硒樟芝菌絲體發(fā)酵液、含硒釀酒酵母發(fā)酵液、及/或含硒乳酸菌發(fā)酵液。其中，所述含硒微生物發(fā)酵液于本發(fā)明中特別是指含硒微生物經(jīng)發(fā)酵后的液體，且并無(wú)經(jīng)離心處理。

在特定實(shí)施例中，釀酒酵母包括，但不限于，釀酒酵母c1(saccharomycescerevisiaec1)、釀酒酵母c2(saccharomycescerevisiaec2)、釀酒酵母h1(saccharomycescerevisiaeh1)、釀酒酵母h2(saccharomycescerevisiaeh2)或釀酒酵母h3(saccharomycescerevisiaeh3)。

又，「乳酸菌」是指能夠代謝糖類(lèi)、產(chǎn)生50％以上乳酸之細(xì)菌，具有這些功能的細(xì)菌包括乳酸桿菌(lactobacillus)等。在本發(fā)明特定實(shí)施例中，乳酸菌包括，但不限于，植物乳桿菌lp69(lactobacillusplantarumlp69)、植物乳桿菌pi06(lactobacillusplantarumpi06)、嗜酸乳桿菌la1(lactobacillusacidophilusla1)、芽孢乳酸桿菌sp1(sporolactobacillussp1)、嗜酸乳桿菌la2(lactobacillusacidophilusla2)、植物乳桿菌p1(lactobacillusplantarump1)、副干酪乳桿菌j1(lactobacillusparacaseij1)。

此外，本發(fā)明所述的植物較佳為可食用植物，例如蔬菜、水果、稻米、麥等，較佳為蔬菜。

在實(shí)施例中，含微量元素的植物，如含硒的植物，包括，但不限于含硒的紅鳳菜、地瓜葉、小白菜、甘藍(lán)、萵苣、芥菜、菠菜、香菜、茼蒿、莧菜、小青菜、芹菜、空心菜、大白菜、蓮花白、苜蓿芽或豆芽菜。

本發(fā)明所述的植物萃取液是一個(gè)或多個(gè)植物的萃取液，較佳為蔬菜萃取液。

在實(shí)施例中，植物萃取液包括，但不限于紅鳳菜、地瓜葉、小白菜、甘藍(lán)及/或萵苣萃取液。

本發(fā)明的微量元素有機(jī)物可為發(fā)酵液產(chǎn)品。

在實(shí)施例中，將紅鳳菜萃取液、地瓜葉萃取液、小白菜萃取液、甘藍(lán)萃取液、萵苣萃取液及/或樟芝菌絲體以釀酒酵母、及/或乳酸菌發(fā)酵而獲得發(fā)酵液產(chǎn)品。

在本發(fā)明中，本發(fā)明含硒有機(jī)物的使用方式包括口服或注射。

此外，本發(fā)明的組合物可單獨(dú)給藥，或是在包括有藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑及/或賦形劑的組合物中給藥。上述載體可為溶劑、散布媒劑(dispersionmedia)、涂層(coatings)、抗菌劑、抗真菌劑、等張劑、吸收延遲劑等。稀釋劑可為制菌注射水(bacteriostaticwaterforinjection，bwfi)、磷酸緩沖液、ringer溶液或葡萄糖溶液等。賦形劑可為碳酸鈣、碳酸鈉、磷酸鈣、磷酸鈉、乳醣、淀粉、明膠、藻酸、硬脂酸或硬脂酸鎂等。

本發(fā)明另提供一種降低腫瘤體積/治療癌癥的方法，包括給予一個(gè)體有效劑量的本發(fā)明含硒有機(jī)物。在一實(shí)施例中，每日給予0.01-100mg/kg，較佳為1-100mg/kg以上，更佳為每日給予5-60mg/kg。

不僅如此，本發(fā)明所給予的劑量可依照不同的參數(shù)做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。上述參數(shù)包括，但不限于，個(gè)體的種類(lèi)，個(gè)體的大小、疾病的嚴(yán)重性。本發(fā)明的活性成分可以一次給予或24小時(shí)內(nèi)多次給予或連續(xù)給予。

本發(fā)明中所述的“個(gè)體”是指人類(lèi)或非人類(lèi)的動(dòng)物，如，狗、小鼠、大鼠、牛、綿羊、豬、山羊、或靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，特別為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、家畜、及馴養(yǎng)的動(dòng)物。在一實(shí)施例中，動(dòng)物可為人類(lèi)。在另一實(shí)施例中，動(dòng)物可為嚙齒目動(dòng)物，例如，小鼠或大鼠。

本發(fā)明的含硒有機(jī)物具抗氧化能力，可清除自由基。自由基包括，但不限于，no^－、o^－、ho^－、hoo^－、hso4^－及其類(lèi)似物。在一實(shí)施例中，自由基為dpph自由基。

在另一實(shí)施例中，本發(fā)明組合物可有效降低腫瘤體積，其可減少10％以上，較佳為20％～99％。較佳地，本發(fā)明組合物可降低腫瘤體積30％至95％。例如，于一實(shí)施例中，含硒紅鳳菜萃取物與含硒地瓜葉萃取物可將癌癥個(gè)體的腫瘤縮小至10％以下。

本發(fā)明組合物具有預(yù)防及/或治療癌癥的效果，因此可給藥投予至癌癥患者、接受化療或放療的個(gè)體、癌癥高危險(xiǎn)族群等。且本發(fā)明的組合物具有高度的安全性，不會(huì)對(duì)人體造成影響，因此也可作為長(zhǎng)期的飲食補(bǔ)充品。

本發(fā)明組合物可有效地治療及/或預(yù)防癌癥，包括良性前列腺肥大、前列腺癌、乳癌、子宮癌、血癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、睪丸癌、淋巴癌、橫紋肌肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、胰臟癌、肺癌、腦部腫瘤、皮膚癌、胃癌、口腔癌、肝癌、喉癌、膽癌、甲狀腺癌、肝癌、腎臟癌以及鼻咽癌等，較佳為大腸癌、肺癌、卵巢癌、乳癌、子宮頸癌或肝癌。

所有說(shuō)明書(shū)中所揭示的發(fā)明技術(shù)特點(diǎn)可以任意方式組合。說(shuō)明書(shū)中揭示的每一技術(shù)特點(diǎn)可以提供相同、等同或相似目的的其他方式替換。因此，除非另有特別說(shuō)明，文中所有揭示的特點(diǎn)均只是等同或相似特點(diǎn)的一般系列的實(shí)例。

無(wú)需進(jìn)一步詳盡說(shuō)明，本技術(shù)領(lǐng)域的人員可根據(jù)以上描述，使用本發(fā)明至其最大限度。下面的具體實(shí)施方式，其應(yīng)解釋為僅是說(shuō)明性的，且不可用于限制本發(fā)明。本文所引用的文獻(xiàn)均并入本發(fā)明。

若未特別指明，實(shí)施例中所采用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，可以參照相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行，所采用的試劑和產(chǎn)品也均為可商業(yè)獲得的。未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法，所用試劑的來(lái)源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均與首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。

實(shí)施例

1.制備方法

如圖1所示，圖式圖1為本發(fā)明一種用以制備改善惡病質(zhì)的組合物的制備方法的流程圖，其中圖1a為第一制程的含硒微生物的發(fā)酵方法，含硒微生物(s101)是藉由微生物于發(fā)酵步驟中加入亞硒酸鈉而得含硒微生物發(fā)酵液(s103)，含硒微生物發(fā)酵液(s103)進(jìn)一步以菌萃取步驟而得含硒微生物萃取物(s105)。圖1b為第二制程的含硒植物萃取方法，包含將含硒植物(s201)藉由萃取步驟而得含硒植物萃取液(s203)，含硒植物萃取液(s203)藉加入微生物進(jìn)行發(fā)酵且可進(jìn)一步再加入另一微生物或同一微生物而得含硒發(fā)酵混合液(s205)。

1-1含有機(jī)硒樟芝菌絲體發(fā)酵液/萃取液的制備

將樟芝菌絲體自-80℃冰箱中取出解凍后，取單一菌落至10ml的ymbroth培養(yǎng)基，于30℃，150rpm震蕩培養(yǎng)16-24小時(shí)進(jìn)行活化。

取活化后的菌液7.5ml至150mlymbroth培養(yǎng)基中，于30℃，150rpm培養(yǎng)16-24小時(shí)進(jìn)行第一次繼代培養(yǎng)。接著，將第一次繼代培養(yǎng)菌液150ml接種入3l種菌培養(yǎng)基(如一種培養(yǎng)好氧反硝化菌的富集培養(yǎng)基fm)中，150rpm震蕩培養(yǎng)16-24小時(shí)做為種菌。

將150ml含種菌的新鮮培養(yǎng)基以無(wú)菌操作倒入滅菌的血清瓶中，將種菌接入發(fā)酵槽中進(jìn)行培養(yǎng)。發(fā)酵槽所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基含有70g/l葡萄糖、15g/l酵母蛋白胨(yeastpeptone)、mgso4.1.7g/l7h2o、2.5g/lkh2po4及6.5g/l(nh4)2so4。在樟芝菌絲體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初期(約種菌接入發(fā)酵槽的第3.5小時(shí))添加3ml的亞硒酸鈉溶液(na2seo3，濃度為30mg/ml)至3l發(fā)酵培養(yǎng)基中(使發(fā)酵培養(yǎng)液中亞硒酸鈉溶液的最終濃度為30μg/ml。

參閱圖2，發(fā)酵時(shí)間為11天，以100l發(fā)酵槽生產(chǎn)可得有機(jī)硒樟芝菌絲體有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率為88％，胞內(nèi)硒(se)濃度可達(dá)732mg/kg，菌體重量可達(dá)2600g/100l。

另外，本發(fā)明是藉由感應(yīng)耦合電漿質(zhì)譜儀(inductivelycoupledplasmamasssepectrometry，icp-ms)測(cè)定硒含量。舉例而言，本發(fā)明利用感應(yīng)耦合電漿質(zhì)譜儀而測(cè)定含有機(jī)硒(含硒)樟芝菌絲體、含有機(jī)硒(含硒)釀酒酵母、含有機(jī)硒(含硒)乳酸菌的菌體細(xì)胞的硒含量。另外，本發(fā)明有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率(％)則定義為：(菌體重量×有機(jī)硒含量/無(wú)機(jī)硒總量)×100％。

1-2含有機(jī)硒釀酒酵母的制備

將釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)-80℃冰箱取出并于37℃下解凍，取單一菌落于10mlymbroth培養(yǎng)基中，于30℃，以150rpm震蕩培養(yǎng)16－24小時(shí)進(jìn)行活化。

取活化后的菌液7.5ml接種于150mlymbroth培養(yǎng)基中，于30℃，150rpm震蕩培養(yǎng)16-24小時(shí)進(jìn)行第一次繼代培養(yǎng)。

將第一次繼代培養(yǎng)的種菌150ml倒入滅菌的血清瓶中，接著利用泵將種菌接入發(fā)酵槽中開(kāi)始進(jìn)行培養(yǎng)，使用的發(fā)酵培養(yǎng)基含有70g/l葡萄糖、15g/l酵母蛋白胨(yeastpeptone)、1.7g/lmgso4.7h2o、2.5g/lkh2po4、6.5g/l(nh4)2so4。于釀酒酵母的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初期(約種菌接入發(fā)酵槽的第3.5小時(shí))添加3ml亞硒酸鈉溶液(na2seo3，濃度為30mg/ml)至3l培養(yǎng)基中(使亞硒酸鈉溶液于發(fā)酵培養(yǎng)液最終濃度為30μg/ml)，總添加量為3ml。

參照?qǐng)D3及表二，使用100l發(fā)酵槽，發(fā)酵時(shí)間為1天，所獲得的含有機(jī)硒(含硒)釀酒酵母的有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率為37-77％，胞內(nèi)硒濃度可達(dá)537-792mg/kg，菌體重量可達(dá)1400-2200g/100l。

再者，如前述，各種釀酒酵母于培養(yǎng)時(shí)經(jīng)添加亞硒酸鈉溶液，而后得含硒釀酒酵母如含硒釀酒酵母c1(saccharomycescerevisiaec1)、含硒釀酒酵母c2(saccharomycescerevisiaec2)、含硒釀酒酵母h1(saccharomycescerevisiaeh1)、含硒釀酒酵母h2(saccharomycescerevisiaeh2)、含硒釀酒酵母h3(saccharomycescerevisiaeh3)(如表二所示)。又，如前述，本發(fā)明所使用的釀酒酵母其篩選的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，可以參照相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行。

表二、各種釀酒酵母的硒濃度及轉(zhuǎn)化率

1-3有機(jī)硒乳酸桿菌的制備

將乳酸菌(如本發(fā)明實(shí)施例的植物乳桿菌lp69(lactobacillusplantarumlp69)、植物乳桿菌pi06(lactobacillusplantarumpi06)、嗜酸乳桿菌la1(lactobacillusacidophilusla1)、芽孢乳酸桿菌sp1(sporolactobacillussp1)、嗜酸乳桿菌la2(lactobacillusacidophilusla2)、植物乳桿菌p1(lactobacillusplantarump1)、副干酪乳桿菌j1(lactobacillusparacaseij1)-80℃冰箱取出并于37℃下解凍，取單一菌落于10mlmrsbroth培養(yǎng)基(mrs肉湯培養(yǎng)基)中，于30℃，以150rpm震蕩培養(yǎng)16－24小時(shí)進(jìn)行活化。

取活化后的菌液7.5ml接種于150mlmrsbroth培養(yǎng)基中，于30℃，150rpm震蕩培養(yǎng)16-24小時(shí)進(jìn)行第一次繼代培養(yǎng)。

將第一次繼代培養(yǎng)的種菌150ml倒入滅菌的血清瓶中，接著利用泵將種菌接入發(fā)酵槽中開(kāi)始進(jìn)行培養(yǎng)，使用的發(fā)酵培養(yǎng)基含有10g/l蛋白胨、10g/l牛肉抽出物、5g/l酵母抽出物、20g/l葡萄糖、1g/l聚山梨醇脂80、2g/lk2hpo4、5g/l醋酸鈉、2g/l檸檬酸銨、0.1g/lmgso4.7h2o、0.05g/lmnso4.4h2o。于乳酸菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初期(約種菌接入發(fā)酵槽的第3.5小時(shí))添加3ml亞硒酸鈉溶液(na2seo3，濃度為30mg/ml)至3l培養(yǎng)基中(使發(fā)酵培養(yǎng)液最終濃度為30μg/ml)，總添加量為3ml。

參照?qǐng)D4，使用100l發(fā)酵槽，發(fā)酵時(shí)間為1天，所獲得的含有機(jī)硒(含硒)乳酸菌有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率為56-92％，胞內(nèi)硒濃度可達(dá)682-1471mg/kg，菌體重量可達(dá)1200-1782g/100l。

再者，如前述，各種乳酸菌于培養(yǎng)時(shí)經(jīng)添加亞硒酸鈉溶液，而后得含硒乳酸菌如含硒植物乳桿菌lp69(lactobacillusplantarumlp69)、含硒植物乳桿菌pi06(lactobacillusplantarumpi06)、含硒嗜酸乳桿菌la1(lactobacillusacidophilusla1)、含硒芽孢乳酸桿菌sp1(sporolactobacillussp1)、含硒嗜酸乳桿菌la2(lactobacillusacidophilusla2)、含硒植物乳桿菌p1(lactobacillusplantarump1)、含硒副干酪乳桿菌j1(lactobacillusparacaseij1)。又，如前述，本發(fā)明所使用的釀酒酵母其篩選的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，可以參照相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行。

表三、各種乳酸菌的硒濃度及轉(zhuǎn)化率

1-4含硒有機(jī)蔬菜的制備

將上述發(fā)酵廢液加至80kg篦麻粕原料，將氮、磷、鉀比例調(diào)整為1:2:1。拌入篦麻粕原料，混合攪拌與升溫至90℃，將蔬果殘?jiān)纸档椭?0％，降溫至50℃后加入菌根菌菌酛(如摩西球囊霉(glomusmosseae)、幼套球囊霉(glomusetunicatum)、根內(nèi)球囊霉(glomusintraradices)、近明球囊霉(glomusclaroideum)、沾屑球囊霉(glomusspurcum)、墾丁內(nèi)養(yǎng)囊霉(entrophosporakentinensis)、莫氏無(wú)梗囊霉(acaulosporamorrowiae)及黑色盾巨孢囊霉(scutellosporanigra)中的一種或多種)，使前述菌根菌菌酛的比例為5％，濃度達(dá)10⁹cfu/ml。將此原料于30℃下反應(yīng)60分鐘，并在90分鐘內(nèi)逐漸升溫至100℃后維持10分鐘，以獲得有機(jī)硒微生物固肥。

亦可將上述發(fā)酵廢液直接加入菌根菌菌酛(摩西球囊霉(glomusmosseae)、幼套球囊霉(glomusetunicatum)、根內(nèi)球囊霉(glomusintraradices)、近明球囊霉(glomusclaroideum)、沾屑球囊霉(glomusspurcum)、墾丁內(nèi)養(yǎng)囊霉(entrophosporakentinensis)、莫氏無(wú)梗囊霉(acaulosporamorrowiae)及黑色盾巨孢囊霉(scutellosporanigra)中的一種或多種)，使前述菌根菌菌酛的比例為5％，濃度達(dá)10⁹cfu/ml。將此原料于30℃下反應(yīng)60分鐘，并在90分鐘內(nèi)逐漸升溫至100℃后維持10分鐘，以獲得有機(jī)硒微生物液肥。

其中，前述菌根菌菌酛的分離、培養(yǎng)與繁殖是參考美國(guó)西維吉尼大學(xué)的國(guó)際菌根菌保存中心(westvirginiauniversity，invam)等菌根菌研究、農(nóng)業(yè)應(yīng)用單位其作業(yè)程序而進(jìn)一步改良、應(yīng)用。

利用此有機(jī)含硒微生物肥料種植紅鳳菜、萵苣、地瓜葉、小白菜、甘藍(lán)、芥菜、菠菜、香菜、茼蒿、莧菜、小青菜、芹菜、空心菜、大白菜、蓮花白、苜蓿芽、豆芽菜等，以獲得含硒蔬菜，并分別制作成含硒紅鳳菜萃取液、含硒萵苣萃取液、含硒地瓜葉萃取液、含硒小白菜萃取液、含硒甘藍(lán)萃取液、含硒芥菜萃取液、含硒菠菜萃取液、含硒香菜萃取液、含硒茼蒿萃取液、含硒莧菜萃取液、含硒小青菜萃取液、含硒芹菜萃取液、含硒空心菜萃取液、含硒大白菜萃取液、含硒蓮花白萃取液、含硒苜蓿芽萃取液、含硒豆芽菜萃取液等。

2.含硒有機(jī)物的抗癌效果

在本實(shí)施例中，使用(a)含硒釀酒酵母萃取物(硒含量715mg/kg)、(b)含硒樟芝菌絲體萃取物(硒含量732mg/kg)、(c)含硒紅鳳菜萃取液(硒含量10mg/kg)、(d)含硒萵苣萃取液(硒含量10mg/kg)、(e)含硒發(fā)酵混合液(硒含量10mg/kg)，將含硒紅鳳菜萃取液或/和含硒萵苣萃取液或/和含硒小白菜萃取液或/和含硒甘藍(lán)萃取液的含硒蔬菜萃取液經(jīng)釀酒酵母或乳酸菌而混合發(fā)酵后加入0.5(w/w)％樟芝菌絲體進(jìn)行試驗(yàn)。于本發(fā)明的含硒發(fā)酵混合液其中一實(shí)施例(參閱圖1)，特別是指將含硒紅鳳菜萃取液、含硒萵苣萃取液、含硒小白菜萃取液、含硒甘藍(lán)萃取液經(jīng)釀酒酵母或乳酸菌混合發(fā)酵30天后，加入0.5(w/w)％樟芝菌絲體進(jìn)行試驗(yàn)。

含硒蔬菜萃取液亦可選自含硒地瓜葉萃取液、含硒甘藍(lán)萃取液、含硒芥菜萃取液、含硒菠菜萃取液、含硒香菜萃取液、含硒茼蒿萃取液、含硒莧菜萃取液、含硒小青菜萃取液、含硒芹菜萃取液、含硒空心菜萃取液、含硒大白菜萃取液、含硒蓮花白萃取液、含硒苜蓿芽萃取液或含硒豆芽菜萃取液，另外，亦可選擇釀酒酵母、含硒釀酒酵母、乳酸菌、含硒乳酸菌、樟芝菌絲體、含硒樟芝菌絲體進(jìn)行發(fā)酵并混合。將含硒量稀釋為10mg/kg，以平衡含硒量所造成的結(jié)果差異。分別將此(a)含硒釀酒酵母萃取物、(b)含硒樟芝菌絲體萃取物、(c)含硒紅鳳菜萃取液、(d)含硒萵苣萃取液、(e)含硒發(fā)酵混合液5種含硒物質(zhì)稀釋100、200、400及800倍。

2.1細(xì)胞毒性試驗(yàn)

利用mts試驗(yàn)測(cè)試上述5種含硒有機(jī)物對(duì)于小鼠肺癌細(xì)胞(line-1)的細(xì)胞毒性。參閱圖5，稀釋100倍的含硒釀酒酵母萃取物、含硒樟芝菌絲體萃取物、含硒紅鳳菜萃取液、含硒萵苣萃取液與含硒發(fā)酵混合液對(duì)于肺癌細(xì)胞(小鼠肺癌細(xì)胞)的生長(zhǎng)具有抑制能力。在各組中，將含硒有機(jī)物稀釋200-800倍可抑制70％-40％的肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。5種含硒有機(jī)物皆可作為有效抑制肺癌細(xì)胞的物質(zhì)，且具有劑量依賴(lài)性。

2.2抗氧化試驗(yàn)

取100μl的含硒有機(jī)物加入100μl由甲醇所配制的1mm1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph自由基)，均勻混合靜置30分鐘，使用分光光度計(jì)檢測(cè)517nm吸光值。空白組以100μl的甲醇代替。吸光值越低表示樣品清除dpph自由基能力越強(qiáng)。清除率(scavengingeffect)＝(1-(樣品517nm吸光值/空白組517nm吸光值))×100％。

參閱圖6，含硒發(fā)酵混合液清除dpph自由基效果最好，經(jīng)100倍稀釋后，dpph自由基清除率約為90％；而含硒釀酒酵母萃取物與含硒樟芝菌絲體萃取物則約為30-35％；含硒蔬菜汁其清除率約為60％。

2.3惡病質(zhì)動(dòng)物試驗(yàn)一

將6至8周大的balb/cbyj小鼠，依體重平均分配至各組。小鼠飼料為一種商業(yè)基礎(chǔ)飼料(例如的5001laboratoryrodentdiet)，其經(jīng)高溫高壓滅菌，采任意食用的方式喂食。動(dòng)物模式包括(1)腫瘤誘導(dǎo)惡病質(zhì)的動(dòng)物模式及(2)化療動(dòng)物模式。

在前述(1)腫瘤誘導(dǎo)惡病質(zhì)的動(dòng)物模式中，對(duì)照組以皮下注射1×10⁵(產(chǎn)生中度惡病質(zhì))與5×10⁵(產(chǎn)生重度惡病質(zhì))肺癌細(xì)胞line-1至balb/cbyj小鼠，制造肺癌的惡病質(zhì)急性反應(yīng)，控制組則是注射0.1mlpbs(磷酸鹽緩沖液)，實(shí)驗(yàn)組則以管灌/喂食0.1ml/天的含硒發(fā)酵混合液(10mg/kg)。

腫瘤誘導(dǎo)惡病質(zhì)的動(dòng)物模式實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腫瘤小鼠的增重率顯著低于正常小鼠。中度惡病質(zhì)組別的小鼠的體重下降15.6％，重度組則下降19.1％。攝食率各組間則無(wú)顯著差異(p>0.05)，如表四所示。由此結(jié)果可知，惡病質(zhì)的體重減輕癥狀是由腫瘤所引起，屬于癌因性厭食。此外，腫瘤小鼠的血清白蛋白顯著降低，此結(jié)果與惡病質(zhì)的惡化程度具有負(fù)相關(guān)性(表四)。在重度惡病質(zhì)小鼠中，血清中發(fā)炎激素tnf-α含量顯著增加(表四)。實(shí)驗(yàn)組小鼠的體重、血清白蛋白、發(fā)炎激素tnf-α及il-6與正常小鼠無(wú)顯著差異，此結(jié)果可顯示含硒發(fā)酵混合液有助于降低腫瘤誘導(dǎo)動(dòng)物的惡病質(zhì)產(chǎn)生。亦即，本發(fā)明的含硒發(fā)酵混合液能降低癌癥的惡病質(zhì)個(gè)體的血清中tnf-α含量為35pg/ml至75pg/ml。

表四、腫瘤誘導(dǎo)惡病質(zhì)的動(dòng)物模式實(shí)驗(yàn)

*p<0.01；n為動(dòng)物只數(shù)

在(2)化療動(dòng)物模式中，以腹腔連續(xù)注射多西他賽(docetaxel)2次(低劑量組，產(chǎn)生中度惡病質(zhì))與4次(高劑量組，產(chǎn)生重度惡病質(zhì))至balb/cbyj小鼠，制造化療誘導(dǎo)的惡病質(zhì)急性反應(yīng)?？刂平M則是注射0.1mlpbs，實(shí)驗(yàn)組則灌/喂食0.1ml/天的含硒發(fā)酵混合液(10mg/kg)。

化療誘導(dǎo)的惡病質(zhì)的動(dòng)物模式實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，多西他賽(docetaxel)處理的小鼠其增重率、攝食率與血清白蛋白量顯著低于正常小鼠，且隨著施打次數(shù)增加其嚴(yán)重度越高，如表五所示。低劑量組別的小鼠其體重流失5.5％，高劑量組則流失了11.6％?；熕幬?docetaxel)會(huì)引起厭食現(xiàn)象，顯示由化療引起的體重流失有一部分是由于厭食所引起。在docetaxel處理小鼠血清中，發(fā)炎激素tnf-α含量各組間無(wú)顯著差異，但是il-6含量是正常鼠的2至3倍。臨床上惡病質(zhì)癥狀，包括低白蛋白與高發(fā)炎激素表現(xiàn)，皆與動(dòng)物模式所發(fā)現(xiàn)的特征吻合。實(shí)驗(yàn)組小鼠的體重、血清白蛋白、發(fā)炎激素tnf-α及il-6與正常小鼠無(wú)顯著差異，此結(jié)果可顯示含硒發(fā)酵混合液有助于降低化學(xué)誘導(dǎo)動(dòng)物的惡病質(zhì)產(chǎn)生。亦即，本發(fā)明的含硒發(fā)酵混合液能降低化療藥物誘導(dǎo)惡病質(zhì)的個(gè)體的血清中il-6含量為1.8至16倍。

表五、docetaxel誘導(dǎo)惡病質(zhì)的動(dòng)物模式實(shí)驗(yàn)

*p<0.01；n為動(dòng)物只數(shù)

2.4惡病質(zhì)動(dòng)物試驗(yàn)二

選用六到八周齡c57bl/6雄性小鼠，并依體重將小鼠隨機(jī)分為：對(duì)照組，喂食生理食鹽水；實(shí)驗(yàn)一組，給予含硒酵母發(fā)酵液；實(shí)驗(yàn)二組，給予含硒樟芝菌絲體萃取物；實(shí)驗(yàn)三組，給予含硒紅鳳菜萃取液；實(shí)驗(yàn)四組，給予含硒地瓜葉萃取液。于此實(shí)施例的對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中，是將1×10⁵llc細(xì)胞(肺癌細(xì)胞)注射至c57bl/6小鼠右腳背皮下而誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生，并對(duì)應(yīng)前述各實(shí)驗(yàn)組而每日分別給予20或40毫克/公斤體重的含硒酵母發(fā)酵液、含硒樟芝發(fā)酵菌絲體、含硒紅鳳菜萃取液、含硒地瓜菜萃取液。如圖7，其中如含硒紅鳳菜萃取液、含硒地瓜葉萃取液于稀釋100倍時(shí)，實(shí)驗(yàn)組小鼠的腫瘤相較對(duì)照組縮小90％以上。再者，前述各實(shí)驗(yàn)組使用本發(fā)明前述的含硒有機(jī)物皆可抑制腫瘤大小達(dá)60％以上。

綜上所述，本發(fā)明藉由提供含微量元素的微生物、含微量元素的微生物發(fā)酵液、植物及/或植物萃取物，能有效改善生物體惡病質(zhì)的情形，進(jìn)而提升有惡病質(zhì)患的生活質(zhì)量。

發(fā)明所揭露的所有特征應(yīng)可以任何結(jié)合方式實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明所揭露的每一特征應(yīng)可以相同、均等或相似目的的取代物所取代。因此，除非有明確的指定，否則所揭露的每一個(gè)特征僅僅只是均等物或相似特征的一個(gè)種類(lèi)的一實(shí)施例。

由上述內(nèi)容可知，任何所屬本領(lǐng)域技術(shù)人員，將可輕易從本發(fā)明所揭露的內(nèi)容中了解到本發(fā)明的特征，在不偏離隨附權(quán)利要求書(shū)所界定的本發(fā)明的精神與范圍下，當(dāng)可在此進(jìn)行各種改變、取代以及修正。因此，其他實(shí)施例亦落于本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)所要求保護(hù)的范圍之內(nèi)。