本發(fā)明涉及2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate的結(jié)構(gòu)、制備方法，以及2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate在制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，ra)是以對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的異質(zhì)性、系統(tǒng)性、自身免疫性疾病，是在環(huán)境因素、遺傳背景以及兩者交互作用下，高度異質(zhì)性的自身免疫性疾病。ra是造成人類喪失勞動(dòng)能力和致殘的主要原因之一，全世界平均發(fā)病率為0.2％～1.2％，我國(guó)患病率為0.2％～0.93％。ra患者的治療需要長(zhǎng)期服藥以控制病程并改善癥狀，治療成本高、社會(huì)負(fù)擔(dān)重。目前臨床用于治療ra的藥物主要有非甾體抗炎藥(non-steroidalanti-inflammatorydrugs，nsaids)、糖皮質(zhì)激素、改變病情抗風(fēng)濕藥、生物制劑與植物藥制劑等，雖然具有一定的療效，卻大都有較強(qiáng)的毒副作用，這與需要長(zhǎng)期服藥的理想抗類風(fēng)濕藥物尚存較大差距。因此更安全、更高效的具有抗ra活性的化合物，在研制ra治療藥物方面，具有重大價(jià)值。

本發(fā)明所涉及的化合物2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate是本發(fā)明申請(qǐng)人從傳統(tǒng)中藥珍珠梅sorbariasorbifolia(l.)a.brown.中純化制備的一個(gè)新化合物，研究發(fā)現(xiàn)該化合物具有明顯的抗ra活性，具有新型抗ra藥物開發(fā)的價(jià)值。該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、制備方法及其抗ra活性均為首次公開，因此具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種新化合物的制備方法，及其在制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所涉及的用于制備類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的化合物為2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate，其化學(xué)式是：c18h21no9，結(jié)構(gòu)式是：

本發(fā)明所涉及的2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate的制備方法為：

取珍珠梅藥材，粉碎成最粗粉，加入20倍量的適當(dāng)濃度的有機(jī)醇水溶液作提取溶劑，浸泡提取1～3次，每次10小時(shí)左右，合并提取液，過(guò)濾，脫醇濃縮至有機(jī)醇濃度20％左右，加 樣于大孔吸附樹脂柱，先用20％左右有機(jī)醇水溶液洗脫5個(gè)柱體積去除雜質(zhì)，再用50～95％有機(jī)醇洗脫4個(gè)柱體積，收集50～95％有機(jī)醇洗脫部分，減壓干燥后上100～200目的硅膠柱，選擇合適的硅膠層析洗脫體系進(jìn)行洗脫，收集含2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate的洗脫部位，濃縮，結(jié)晶，過(guò)濾，即得到2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate粗晶。粗晶溶于重結(jié)晶溶劑后形成過(guò)飽和溶液，重結(jié)晶，可得純度達(dá)98％以上的2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate樣品。

本工藝中所涉及的用作提取溶劑的有機(jī)醇，為甲醇、乙醇中的一種，優(yōu)選為乙醇。

本工藝中所涉及的大孔吸附樹脂柱，為弱極性或非極性的大孔吸附樹脂，優(yōu)選弱極性。

本工藝中所涉及的硅膠層析洗脫體系，為二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、石油醚中的一種或幾種，優(yōu)選二氯甲烷-甲醇體系。

本工藝中所涉及的重結(jié)晶溶劑，可用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等溶劑中的一種或幾種，優(yōu)選甲醇或乙酸乙酯。

本發(fā)明還提供了該化合物在制備治療抗風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及的化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)、制備方法及其抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的活性，均為首次公開，不存在由其他化合物給出任何啟示的可能，具備突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)，且有望用于一種新型抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療藥物的開發(fā)。

附圖說(shuō)明

圖1是2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate正離子質(zhì)譜圖(hr-esi-ms)。

圖2是2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate紫外光譜圖(溶劑：cd3od)。

圖3是2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate¹hnmr譜圖(溶劑：cd3od)。

圖4是2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate¹³cnmr譜(溶劑：cd3od)。

圖5是2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoatedept譜(溶劑：cd3od)。

圖6是2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate¹h-¹hcosy譜(溶劑：cd3od)。

圖7是2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoatehmqc譜(溶劑：cd3od)。

圖8是2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoatehmbc譜(溶劑：cd3od)。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施例用以解釋本發(fā)明，但是并非對(duì)本發(fā)明實(shí)質(zhì)內(nèi)容的限制。

實(shí)施例1.2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate的制備

取珍珠梅藥材，粉碎成最粗粉，加入20倍量95％乙醇，浸泡提取1～3次，每次10小時(shí)左右，合并提取液，過(guò)濾，脫醇濃縮至乙醇濃度20％左右，加樣于ab-8型弱極性大孔吸附 樹脂柱，先用20％的乙醇溶液洗脫5個(gè)柱體積去除雜質(zhì)，再用95％乙醇洗脫4個(gè)柱體積，收集95％乙醇洗脫部分，減壓干燥后上100～200目的硅膠柱，以二氯甲烷-甲醇為洗脫體系，按甲醇濃度由低到高進(jìn)行階段洗脫，收集甲醇濃度15～25％的洗脫部分，濃縮，結(jié)晶，過(guò)濾，減壓干燥，得到2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate粗晶。將粗晶溶于乙酸乙酯，形成過(guò)飽和溶液進(jìn)行重結(jié)晶，過(guò)濾，減壓干燥，即得。

實(shí)施例2.2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate的制備

取珍珠梅藥材，粉碎成最粗粉，加入20倍量甲醇，浸泡提取1～3次，每次10小時(shí)左右，合并提取液，過(guò)濾，脫醇濃縮至適當(dāng)體積，補(bǔ)水至醇濃度20％左右，加樣于d-101型非極性大孔吸附樹脂柱，先用20％的甲醇溶液洗脫5個(gè)柱體積去除雜質(zhì)，再用90％甲醇洗脫4個(gè)柱體積，收集90％甲醇洗脫部分，減壓干燥后上100～200目的硅膠柱，以二氯甲烷-甲醇為洗脫體系，按甲醇濃度由低到高進(jìn)行階段洗脫，收集甲醇濃度15～25％的洗脫部分，濃縮，結(jié)晶，過(guò)濾，減壓干燥，即得到2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate粗晶。將粗晶溶于乙酸乙酯，形成過(guò)飽和溶液進(jìn)行重結(jié)晶，過(guò)濾，減壓干燥，即得。

實(shí)施例3.2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate的結(jié)構(gòu)確證

1.儀器與材料

jascop-1020數(shù)字式旋光儀，agilenttof/6500高分辨率質(zhì)譜，島津uv-2401型可見-紫外分光光度計(jì)，核磁為brukeavanceiii500nmrspectrometer，熔點(diǎn)測(cè)定儀為yanacomp53型(熔點(diǎn)未校正)。2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate樣品為按上述實(shí)施例1步驟制備。

2.化合物結(jié)構(gòu)鑒定

無(wú)色粘稠油狀物(甲醇),易溶于二甲亞砜、甲醇，微溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿、水，不溶于石油醚，正離子esi-msm/z：396[m+h]⁺，418[m+na]⁺；負(fù)離子esi-msm/z：394[m-h]^-，430[m+cl]^-，789[2m-h]^-。正離子hr-esi-msm/z：實(shí)測(cè)值418.1108[m+na]⁺，計(jì)算值418.1114(c18h21no9na[m+na]⁺)；負(fù)離子hr-esi-msm/z：實(shí)測(cè)值394.1145[m-h]^-，計(jì)算值394.1138(c18h20no9[m-h]^-)。uvλmaxnm(logε)inmeoh：258(3.28)，209(3.31)，197(3.42)。¹h-nmr(500hz,cd3od)δ：7.97(2h,brd,j＝8.8hz,h-3',7')，6.86(2h,brd,j＝8.8hz,h-4',6')，5.74(1h,brs,ha-4)，5.55(1h,brs,h-2)，5.65(1h,brs,hb-4)，5.02(1h,brd,j＝13.5hz,ha-5)，4.97(1h,brd,j＝13.5hz,hb-5)，4.41(1h,d,j＝7.7hz,h-1”)，3.91(1h,dd,j＝11.9,1.8hz,ha-6”)，3.71(1h,dd,j＝11.9,5.6hz,hb-6”)，3.39-3.26(4h,m,h-2”,3”,4”,5”)。¹³c-nmr(125hz,cd3od)δ：167.5(s,c-1')，163.8(s,c-5')，138.7(s,c-3)，133.1(d,c-3',7')，121.8(s,c-2')，120.8(t,c-4)，118.3(s,c-1)，116.2(d,c-4',6')，102.9(d,c-1”)，78.4(d,c-5”)，77.9(d,c-3”)，74.7(d,c-2”)，71.4(d,c-4”)，68.1(d,c-2)，64.1 (t,c-5)，62.7(t,c-6”)。以上nmr數(shù)據(jù)根據(jù)dept譜以及¹h-¹hcosy、hmqc和hmbc等二維譜數(shù)據(jù)解析結(jié)果予以歸屬。經(jīng)過(guò)與2s-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate的碳譜數(shù)據(jù)和cd譜進(jìn)行對(duì)比，確定該化合物c-2的絕對(duì)構(gòu)型為r。據(jù)此推斷該化合物結(jié)構(gòu)為：

實(shí)施例4.2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate片劑的制備

取2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate10克，加入適量95％乙醇，形成浸膏，然后加入環(huán)糊精或多孔淀粉，混勻，形成軟材，造粒機(jī)造粒，真空干燥，整粒，然后加入潤(rùn)滑劑、矯味劑混合壓片，片重250mg～500mg,每片含2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate5～10mg。

實(shí)施例5.2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate膠囊劑的制備

取2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate10克，加入淀粉、羧甲基纖維素鈉，混勻，灌裝膠囊，即得。每粒膠囊重含2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate5～10mg。

實(shí)施例6.2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate對(duì)佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠血清中peg2與no水平的影響

1.儀器與材料

ex1800型酶聯(lián)免疫分析儀(biotek)；uv-2450型分光光度計(jì)(日本島津)?？ń槊?，上海生物制品研究所；羊毛脂、石蠟油、no試劑盒、前列腺素e2(pge2)試劑盒，購(gòu)于南京建成試劑公司；雷公藤多苷片，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)產(chǎn)品，批號(hào)141001。wistar大鼠，spf級(jí)，雌性，體質(zhì)量120～150g，由山東綠葉制藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2.建模與給藥

將大鼠隨機(jī)分為4組(每組8只)，分別為對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照雷公藤多苷片組、模型組及2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate組。對(duì)照組大鼠右后足跖皮內(nèi)注射生理鹽水，其他各組右后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑(每10mg卡介苗溶解于1ml石蠟油中，混勻后高壓滅菌)0.1ml，記錄大鼠左后足踝關(guān)節(jié)的周長(zhǎng)。各給藥組于造模后第9天開始ig給藥，氰苷組與雷公藤多苷均按10mg/kg給藥，模型組和對(duì)照組給予等量生理鹽水，各組連續(xù)給藥13d。

3.指標(biāo)檢測(cè)

末次給藥(造模后第21天)lh后心臟采血、取血清，-20℃保存，按照試劑盒說(shuō)明書分別測(cè)量血清中no和pge2的量。檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1.2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate對(duì)佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠血清中peg2與no水平的影響(n＝8)

4.結(jié)論：2r-cardiospermin-5-p-hydroxybenzoate可顯著抑制佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠血清中peg2與no的水平，且其活性與同等劑量的雷公藤多苷水平接近，可以用來(lái)制備治療抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。