相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2014年12月16日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)62/092,658和2015年10月2日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)62/236,732的優(yōu)先權(quán)，其各自全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文。本發(fā)明涉及眼科疾病和病變的基于細(xì)胞的治療或再生性治療的領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明提供使用祖細(xì)胞諸如臍帶組織衍生的細(xì)胞和胎盤組織衍生的細(xì)胞以及由那些細(xì)胞制得的條件培養(yǎng)基來再生或修復(fù)眼部細(xì)胞和組織的方法和組合物。
背景技術(shù)：
：作為身體一個(gè)復(fù)雜而敏感的器官，眼可經(jīng)受多種疾病和影響其發(fā)揮正常功能的能力的其它有害病癥。這些病癥中的許多與特定眼部細(xì)胞以及由那些細(xì)胞所構(gòu)成組織的損傷或變性相關(guān)聯(lián)。作為一個(gè)示例，視神經(jīng)和視網(wǎng)膜的疾病和變性病癥是全世界導(dǎo)致失明的主要原因。角膜、晶狀體和相關(guān)眼部組織的損傷或變性是世界范圍內(nèi)視力喪失的另一個(gè)重要原因。視網(wǎng)膜包含七個(gè)交替的細(xì)胞和突起的層，將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為神經(jīng)信號(hào)。視網(wǎng)膜感光細(xì)胞和相鄰的視網(wǎng)膜色素上皮(rpe)形成在許多病變中因基因突變或環(huán)境條件(包括年齡)而變得不平衡的功能單元。這通過細(xì)胞凋亡或繼發(fā)性變性而造成感光細(xì)胞損失，其導(dǎo)致視覺進(jìn)行性惡化且在一些情況下導(dǎo)致失明(綜述參見例如lund，r.d.等人，progressinretinalandeyeresearch，2001；20：415-449)。屬于該模式的兩類眼部病變是年齡相關(guān)性黃斑變性(amd)和色素性視網(wǎng)膜炎(rp)。在50歲或更年長(zhǎng)的那些美國(guó)人中，amd是視力喪失的最常見原因，并且其隨年齡增長(zhǎng)而愈加普遍。amd的主要病變似乎是由于rpe功能障礙和特征為類脂沉積、蛋白質(zhì)交聯(lián)和對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的滲透性減小等等的布魯赫氏膜改變(參見lund等人，2001，同上)。多種因素均可導(dǎo)致黃斑變性，包括基因構(gòu)成、年齡、營(yíng)養(yǎng)、吸煙和暴露于目光或其它氧化應(yīng)激反應(yīng)。非滲出性或“干”形式的amd占amd病例的90％；其它10％為滲出性或新血管形式(“濕”amd)。在干性adm患者中，視網(wǎng)膜色素上皮(rpe)逐漸消失，從而導(dǎo)致外接區(qū)域萎縮。因?yàn)楦泄饧?xì)胞損失是rpe消失的結(jié)果，所以受到影響的視網(wǎng)膜區(qū)域幾乎沒有或沒有視覺功能。amd的當(dāng)前療法例如包括諸如激光治療和藥物干預(yù)的方法。激光束通過轉(zhuǎn)移熱能破壞黃斑下的滲漏血管，從而減慢視力喪失速度。激光治療的缺點(diǎn)在于光束遞送的高熱能也破壞了鄰近的健康組織。neuroscience第4版(purves，d等人2008)敘述“目前無法治療干性amd?！比祟惖膔pe移植尚未取得成功。例如，zarbin，m，2003敘述“隨著正常老化，人布魯赫氏膜(尤其是在黃斑下區(qū)域中)發(fā)生多個(gè)變化(例如，厚度增加，ecm和脂質(zhì)沉積，蛋白質(zhì)交聯(lián)，非酶促形成陳舊性糖化作用終產(chǎn)物)。這些變化以及附加變化是由于amd可減小ecm配體(例如，層粘連蛋白、纖粘蛋白和膠原iv)的生物利用率并導(dǎo)致患amd的眼中rpe細(xì)胞的存活極差。因此，雖然人rpe細(xì)胞表達(dá)連接這些ecm分子所需的整聯(lián)蛋白，但老年黃斑下人布魯赫氏膜上的rpe細(xì)胞存活卻變差?！?zarbin，ma，transamophthalmolsoc，2003；101：493-514)。色素性視網(wǎng)膜炎主要被認(rèn)為是遺傳性疾病，其中超過100個(gè)突變與感光細(xì)胞損失相關(guān)聯(lián)(參見lund等人，2001，同上)。雖然大多數(shù)突變以感光細(xì)胞為目標(biāo)，但一些突變?nèi)灾苯佑绊憆pe細(xì)胞。這些突變一起影響諸如感光細(xì)胞與rpe細(xì)胞之間的分子運(yùn)輸和光傳導(dǎo)的過程。其它較不常見但仍使人衰弱的視網(wǎng)膜病變還可包括導(dǎo)致視力喪失和失明的進(jìn)行性細(xì)胞變性。這些包括例如糖尿病性視網(wǎng)膜病和脈絡(luò)膜新生血管膜(cnvm)。用于組織修復(fù)和再生的基于干細(xì)胞的治療的出現(xiàn)為多種前述細(xì)胞退行性病變及其它眼部病變提供潛在治療。干細(xì)胞能夠自我更新和分化以產(chǎn)生多種成熟的細(xì)胞譜系。此類細(xì)胞移植可用作重構(gòu)靶組織從而恢復(fù)生理和結(jié)構(gòu)功能的臨床工具。干細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用非常廣泛，包括組織工程、基因治療遞送和細(xì)胞療法，即，生物治療劑經(jīng)由產(chǎn)生或包含這些藥劑的外源提供的活細(xì)胞或細(xì)胞組分遞送至靶位置。(綜述參見例如tresco，p.a.等人，advanceddrugdeliveryreviews，2000，42：2-37)。最近已顯示產(chǎn)后衍生細(xì)胞改善視網(wǎng)膜變性(us2010/0272803)?；始彝饪漆t(yī)學(xué)院(royalcollegeofsurgeons，rcs)大鼠具有影響外節(jié)段吞噬作用的酪氨酸受體激酶(mertk)缺陷，從而導(dǎo)致感光細(xì)胞死亡。(fengw.等人，jbiolchem.，2002，10：277(19)：17016-17022)。已發(fā)現(xiàn)將視網(wǎng)膜色素上皮(rpe)細(xì)胞移植到rcs大鼠的視網(wǎng)膜下間隙限制感光細(xì)胞損失的發(fā)展并且維持視覺功能(us2010/0272803)。也已證明產(chǎn)后衍生細(xì)胞可用于促進(jìn)感光細(xì)胞挽救并因而保留rcs模型中的感光細(xì)胞(us2010/0272803)。將人臍帶組織衍生的細(xì)胞(hutc)經(jīng)視網(wǎng)膜下注入rcs大鼠眼中提高視敏度并且改善視網(wǎng)膜變性(us2010/0272803；lundrd等人，stemcells.2007；25(3)：602-611)。此外，采用源于hutc的條件培養(yǎng)基(cm)處理恢復(fù)了體外營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞中的ros吞噬(us2010/0272803)。吞噬細(xì)胞清除凋亡細(xì)胞是正常生命的組成部分，并且該過程中的缺陷可對(duì)自身耐受性和自身免疫性具有重要意義(ravichandran等人，coldspringharbperspectbiol.，2013，5(1)：a008748.doi：10.1101/cshperspect.a008748.綜述)。識(shí)別并除去凋亡細(xì)胞主要由專業(yè)吞噬細(xì)胞(受體結(jié)合病原體進(jìn)行吞噬)諸如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞及其它白細(xì)胞以及非專業(yè)吞噬細(xì)胞(吞噬作用并非主要功能)諸如上皮細(xì)胞、rpe細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)。迄今為止，已鑒定出多個(gè)“吞噬我”的信號(hào)，包括表面蛋白糖基化的變化或表面電荷的變化(ravichandran等人，coldspringharbperspectbiol.，2013)。磷脂酰絲氨酸(ps)的外在化是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志，并且是研究最透徹的“吞噬我”信號(hào)(wu等人，trends.cellbiol.，2006，16(4)：189-197)?！巴淌晌摇毙盘?hào)直接地(如同ps受體)或間接地經(jīng)由橋分子和輔助受體由吞噬細(xì)胞的吞噬受體識(shí)別出(erwig等人，celldeath.differ.，2008；15：243-250)。橋分子乳-脂肪-小珠-egf-因子8(mfg-e8)、生長(zhǎng)抑制特異性蛋白6(gas6)、蛋白質(zhì)s、血小板反應(yīng)蛋白(tsp)、載脂蛋白h(先前被稱為β2-糖蛋白i、β2-gpi)均與凋亡細(xì)胞表面上的ps結(jié)合。mfg-e8可隨后由αvβ3和αvβ5整聯(lián)蛋白通過其rgd基序識(shí)別出(hanayama等人，science，2004，304：1147-1150；borisenko等人，celldeathdiffer.，2004；11：943-945)，gas6由ax1、tyro3和mer家族的受體酪氨酸激酶識(shí)別出(scott等人，nature，2001；411：207-211)并且載脂蛋白h由β2-gpi受體識(shí)別出(balasubramanian等人，jbiochem，1997；272：31113-31117)。其它橋分子連接至所識(shí)別的凋亡細(xì)胞表面上改變的糖和/或脂質(zhì)，例如凝集素家族的成員表面活性劑蛋白a和d(vandivier等人，jimmunol，2002；169：3978-398)。凝集素家族的分子然后通過如下方式被識(shí)別出：其膠原尾部與鈣網(wǎng)蛋白(crt)相互作用，進(jìn)而發(fā)出信號(hào)以使吞噬細(xì)胞通過低密度脂蛋白(ldl)-受體-相關(guān)蛋白(lrp-1/cd91)攝取(gardai等人，cell，2003；115：13-23)。又如，所鑒定的第一橋分子為血小板反應(yīng)蛋白(tsp)-1(savill等人，jclininvest，1992；90：1513-1522)，細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白被認(rèn)為與凋亡細(xì)胞上的tsp-1結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，并然后與包含αvβ3和αvβ5整聯(lián)蛋白和清道夫受體cd36的吞噬細(xì)胞上的受體復(fù)合物結(jié)合。膜聯(lián)蛋白i屬于膜聯(lián)蛋白家族的ca2+-依賴性磷脂-結(jié)合蛋白并優(yōu)先位于質(zhì)膜的胞質(zhì)面。膜聯(lián)蛋白i示出與ps共同定位。rpe的ros吞噬作用對(duì)視網(wǎng)膜功能至關(guān)重要(finnemann等人，pnas，1997；94：12932-937)。據(jù)報(bào)道參與rpe吞噬ros的受體包括清道夫受體cd36、整聯(lián)蛋白受體αvβ5、受體酪氨酸激酶(稱為mertk)和甘露糖受體(mr)(cd206)(kevany等人，physiology，2009；25：8-15)。finnemann發(fā)現(xiàn)，分離的ros具有外化的ps，該外化ps的阻斷或移除降低了rpe在培養(yǎng)中對(duì)其的結(jié)合和吞噬(finnemann等人，pnas，2012；109(21)：8145-8148)。然而，對(duì)rpe吞噬作用的了解仍知之甚少。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供適用于眼科疾病和病變的基于細(xì)胞的治療或再生性治療的組合物和方法。具體地，本發(fā)明的特征在于治療眼科疾病或病癥的方法和組合物，包括用祖細(xì)胞如產(chǎn)后衍生細(xì)胞以及由那些細(xì)胞產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基再生或修復(fù)眼部組織。產(chǎn)后衍生細(xì)胞可為臍帶組織衍生的細(xì)胞(utc)或胎盤組織衍生的細(xì)胞(pdc)。本發(fā)明的一個(gè)方面是治療眼科疾病的方法，包括向受治療者施用祖細(xì)胞，或者由祖細(xì)胞群制得的條件培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞分泌橋分子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，橋分子由條件培養(yǎng)基中的細(xì)胞群分泌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，橋分子選自mfg-e8、gas6、血小板反應(yīng)蛋白(tsp)-1和tsp-2。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，細(xì)胞是祖細(xì)胞。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，細(xì)胞是產(chǎn)后衍生細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，產(chǎn)后衍生細(xì)胞從基本上不含血的人臍帶組織或胎盤組織中分離。在一些實(shí)施方案中，祖細(xì)胞例如產(chǎn)后衍生細(xì)胞群分泌橋分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，由祖細(xì)胞例如產(chǎn)后衍生細(xì)胞群制得的條件培養(yǎng)基包含細(xì)胞群所分泌的橋分子。細(xì)胞分泌的和條件培養(yǎng)基中分泌的此類橋分子選自mfg-e8、gas6、tsp-1和tsp-2。產(chǎn)后衍生細(xì)胞為臍帶組織衍生的細(xì)胞(utc)或胎盤組織衍生的細(xì)胞(pdc)。在一個(gè)實(shí)施方案中，橋分子抑制感光細(xì)胞凋亡。在另一個(gè)實(shí)施方案中，祖細(xì)胞分泌的和在條件培養(yǎng)基中分泌的橋分子減少感光細(xì)胞的損失。在一個(gè)實(shí)施方案中，感光細(xì)胞的損失通過橋分子刺激感光細(xì)胞片段的吞噬來減少。在另一個(gè)實(shí)施方案中，上述細(xì)胞群或由上述細(xì)胞群制得的條件培養(yǎng)基修飾視桿細(xì)胞外節(jié)膜盤(ros)以促進(jìn)吞噬。在另一個(gè)實(shí)施方案中，橋分子增強(qiáng)視網(wǎng)膜色素上皮(rpe)細(xì)胞對(duì)ros的結(jié)合和內(nèi)在化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，上述細(xì)胞群或由上述細(xì)胞群制得的條件培養(yǎng)基包含細(xì)胞群所分泌的受體酪氨酸激酶(rtk)營(yíng)養(yǎng)因子。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，營(yíng)養(yǎng)因子為bdnf、nt3、hgf、pdgf-cc、pdgf-dd和gdnf。在一些實(shí)施方案中，rtk營(yíng)養(yǎng)因子介導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮(rpe)細(xì)胞的吞噬作用。在某些實(shí)施方案中，rtk營(yíng)養(yǎng)因子介導(dǎo)rpe細(xì)胞的吞噬作用以吞噬脫落的感光細(xì)胞片段(細(xì)胞脫落的感光細(xì)胞片段)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，rtk營(yíng)養(yǎng)因子激活rce細(xì)胞上的受體以刺激吞噬作用。本發(fā)明的另一個(gè)方面的特征在于用于減少視網(wǎng)膜變性中的感光細(xì)胞的損失的方法，該方法包括將祖細(xì)胞群或由祖細(xì)胞群制得的條件培養(yǎng)基以有效減少感光細(xì)胞損失的量施用于眼。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，祖細(xì)胞是產(chǎn)后衍生細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，產(chǎn)后衍生細(xì)胞從基本上不含血的人臍帶組織或胎盤組織中分離。如在其它在實(shí)施方案中，產(chǎn)后衍生細(xì)胞分泌橋分子。在一些實(shí)施方案中，條件培養(yǎng)基包含由細(xì)胞群如產(chǎn)后衍生細(xì)胞群分泌的橋分子。此類由產(chǎn)后衍生細(xì)胞分泌的橋分子選自mfg-e8、gas6、tsp-1和tsp-2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，條件培養(yǎng)基由來源于基本上不含血的人臍帶組織或胎盤組織的經(jīng)分離的產(chǎn)后衍生細(xì)胞或產(chǎn)后衍生細(xì)胞群產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)后衍生細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中擴(kuò)增并且具有分化成神經(jīng)表型的細(xì)胞的潛力；其中所述細(xì)胞需要l-纈氨酸用于生長(zhǎng)并且能夠在至少約5％的氧氣中生長(zhǎng)。該細(xì)胞還包括以下特征中的一種或多種：(a)在培養(yǎng)中至少約40次倍增的潛力；(b)在經(jīng)包被或未經(jīng)包被的組織培養(yǎng)容器上貼附和擴(kuò)增，其中經(jīng)包被的組織培養(yǎng)容器包含明膠、層粘連蛋白、膠原、多聚鳥氨酸、玻連蛋白或纖連蛋白的被覆物；(c)產(chǎn)生組織因子、波形蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白中的至少一種；(d)產(chǎn)生cd10、cd13、cd44、cd73、cd90、pdgfr-α、pd-l2和hla-a、b、c中的至少一種；(e)不產(chǎn)生cd31、cd34、cd45、cd80、cd86、cd117、cd141、cd178、b7-h2、hla-g和hla-dr、dp、dq中的至少一種，如由流式細(xì)胞術(shù)所檢測(cè)；(f)相對(duì)于為成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或髂嵴骨髓細(xì)胞的人細(xì)胞，編碼以下項(xiàng)的至少一種基因的基因表達(dá)是增加的：白介素8；漿膜蛋白1；趨化因子(c--x--c基序)配體1(黑素瘤生長(zhǎng)刺激活性，α)；趨化因子(c--x--c基序)配體6(粒細(xì)胞趨化蛋白2)；趨化因子(c--x--c基序)配體3；腫瘤壞死因子，α-誘導(dǎo)蛋白3；c-型凝集素超家族成員2；腎母細(xì)胞瘤1；乙醛脫氫酶1家族成員a2；腎素；氧化低密度脂蛋白受體1；智人克隆image：4179671；蛋白激酶cζ；假定蛋白dkfzp564f013；在卵巢癌中下調(diào)的1；來自克隆dkfzp547k1113的智人基因；(g)相對(duì)于為成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或髂嵴骨髓細(xì)胞的人細(xì)胞，編碼以下項(xiàng)的至少一種基因的基因表達(dá)是減少的：矮小同源盒2；熱休克27kda蛋白2；趨化因子(c--x--c基序)配體12(基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1)；彈性蛋白(主動(dòng)脈瓣上狹窄，威廉斯-博伊倫綜合征)；智人mrna；cdnadkfzp586m2022(來自克隆dkfzp586m2022)；間充質(zhì)同源盒2(生長(zhǎng)終止特異性同源盒)；sineoculis同源盒同源物2(果蠅屬)；晶狀體蛋白，αb；形態(tài)發(fā)生紊亂關(guān)聯(lián)激活因子2；dkfzp586b2420蛋白；類似于neuralin1；四連接素(纖溶酶原結(jié)合蛋白)；src同源三(sh3)和富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域；膽固醇25-羥化酶；runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3；白介素11受體，α；前膠原c-內(nèi)肽酶增強(qiáng)子；卷曲同源物7(果蠅屬)；假定基因bc008967；膠原，viii型，α1；腱生蛋白c(hexabrachion)；易洛魁族同源盒蛋白5；膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)輔助蛋白；整聯(lián)蛋白，β8；突觸小泡糖蛋白2；成神經(jīng)細(xì)胞瘤，抑制瘤變蛋白1；胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2，36kda；智人cdnaflj12280fis，克隆mamma1001744；細(xì)胞因子受體樣因子1；鉀中間體/小電導(dǎo)鈣活化通道，亞家族n，成員4；整聯(lián)蛋白，β7；具有pdz結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子(taz)；sineoculis同源盒同源物2(果蠅屬)；kiaa1034蛋白；囊泡相關(guān)膜蛋白5(肌短蛋白)；含egf腓骨蛋白樣細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1；早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子3；遠(yuǎn)端缺失同源盒5；假定蛋白flj20373；醛酮還原酶家族1，成員c3(3-α羥基類固醇脫氫酶，ii型)；雙糖鏈蛋白聚糖；具有pdz結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子(taz)；纖粘蛋白1；前腦啡肽；整聯(lián)蛋白，β樣1(具有egf樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域)；智人mrna全長(zhǎng)插入cdna克隆euroimage1968422；epha3；kiaa0367蛋白；尿鈉排泄肽受體c/鳥苷酸環(huán)化酶c(利尿鈉排泄肽受體c)；假定蛋白flj14054；智人mrna；cdnadkfzp564b222(來自克隆dkfzp564b222)；bcl2/腺病毒e1b19kda相互作用蛋白3樣；ae結(jié)合蛋白1；細(xì)胞色素c氧化酶viia亞基多肽1(肌肉)；類似于neuralin1；b細(xì)胞易位基因1；假定蛋白flj23191；和dkfzp586l151；以及(h)不表達(dá)htert或端粒酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，臍帶組織衍生的細(xì)胞還具有下列特征：(i)分泌mcp-1、il-6、il-8、gcp-2、hgf、kgf、fgf、hb-egf、bdnf、tpo、miplb、i309、mdc、rantes和timp1中的至少一種；(j)不分泌tgf-β2、mip1a、ang2、pdgfbb和vegf中的至少一種，如由elisa所檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，胎盤組織衍生的細(xì)胞還具有下列特征：(i)分泌mcp-1、il-6、il-8、gcp-2、hgf、kgf、hb-egf、bdnf、tpo、mip1a、rantes和timp1中的至少一種；(j)不分泌tgf-β2、mip1b、ang2、pdgfbb、fgf和vegf中的至少一種，如由elisa所檢測(cè)。在具體的實(shí)施方案中，產(chǎn)后衍生細(xì)胞具有以下項(xiàng)的所有鑒別特征：細(xì)胞類型umb022803(p7)(atccc登錄號(hào)pta-6067)；細(xì)胞類型umb022803(p17)(atcc登錄號(hào)pta-6068)，細(xì)胞類型pla071003(p8)(atcc登錄號(hào)pta-6074)；細(xì)胞類型pla071003(p11)(atcc登錄號(hào)pta-6075)；或細(xì)胞類型pla071003(p16)(atcc登錄號(hào)pta-6079)。在一個(gè)實(shí)施方案中，來源于臍組織的產(chǎn)后衍生細(xì)胞具有以下項(xiàng)的所有鑒別特征：細(xì)胞類型umb022803(p7)(atcc登錄號(hào)pta-6067)或細(xì)胞類型umb022803(p17)(atcc登錄號(hào)pta-6068)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，來源于胎盤組織的產(chǎn)后衍生細(xì)胞具有以下項(xiàng)的所有鑒別特征：細(xì)胞類型pla071003(p8)(atcc登錄號(hào)pta-6074)；細(xì)胞類型pla071003(p11)(atcc登錄號(hào)pta-6075)；或細(xì)胞類型pla071003(p16)(atcc登錄號(hào)pta-6079)。在某些實(shí)施方案中，產(chǎn)后衍生細(xì)胞在包括金屬蛋白酶活性、粘液溶解活性和中性蛋白酶活性的一種或多種酶活性存在下分離。優(yōu)選地，產(chǎn)后衍生細(xì)胞具有在培養(yǎng)中細(xì)胞傳代時(shí)保持的正常核型。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，產(chǎn)后衍生細(xì)胞表達(dá)cd10、cd13、cd44、cd73、cd90中的每一種。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)后衍生細(xì)胞表達(dá)cd10、cd13、cd44、cd73、cd90、pdgfr-α、以及hla-a、b、c中的每一種。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，產(chǎn)后衍生細(xì)胞不表達(dá)cd31、cd34、cd45、cd117。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)后衍生細(xì)胞不表達(dá)cd31、cd34、cd45、cd117、cd141、或hla-dr、dp、dq，如由流式細(xì)胞術(shù)所檢測(cè)。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞不表達(dá)htert或端粒酶。在如上的實(shí)施方案中，細(xì)胞群為基本上同質(zhì)的產(chǎn)后衍生細(xì)胞群。在一個(gè)具體的實(shí)施方案，群體為同質(zhì)的產(chǎn)后衍生細(xì)胞群。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，產(chǎn)后衍生細(xì)胞來源于基本上不含血的人臍帶組織或胎盤組織。在某些實(shí)施方案中，將如上所述產(chǎn)后衍生細(xì)胞群或由細(xì)胞群制得的條件培養(yǎng)基與如下至少一種其它細(xì)胞類型一起施用：星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)祖細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、視網(wǎng)膜上皮干細(xì)胞、角膜上皮干細(xì)胞、或其它多能干細(xì)胞或多潛能干細(xì)胞。在這些實(shí)施方案中，可將其它細(xì)胞類型與產(chǎn)后衍生細(xì)胞群或由產(chǎn)后衍生細(xì)胞群制得的條件培養(yǎng)基同時(shí)地、在其之前、或之后施用。同樣，在這些及其它實(shí)施方案中，將如上所述產(chǎn)后衍生細(xì)胞群或由產(chǎn)后衍生細(xì)胞群制得的條件培養(yǎng)基與如下至少一種其它試劑一起施用：眼部治療藥物、或另一種有益輔助劑，諸如抗炎劑、抗凋亡劑、抗氧化劑或生長(zhǎng)因子。在這些實(shí)施方案中，可將其它試劑與產(chǎn)后衍生細(xì)胞群或由產(chǎn)后衍生細(xì)胞群制得的條件培養(yǎng)基同時(shí)地、在其之前、或之后施用。在本文所述各種實(shí)施方案中，將產(chǎn)后衍生細(xì)胞群(臍或胎盤)或產(chǎn)后衍生細(xì)胞所產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基施用于眼，例如眼表面，或施用于眼內(nèi)部或施用于眼附近的位置，例如眼后面。產(chǎn)后衍生細(xì)胞群或由產(chǎn)后衍生細(xì)胞群制得的條件培養(yǎng)基可通過插管或從植入患者體內(nèi)的眼內(nèi)或眼附近的裝置施用，或者可通過植入具有細(xì)胞群或條件培養(yǎng)基的基質(zhì)或支架施用。本發(fā)明的另一個(gè)方面的特征在于用于減少視網(wǎng)膜變性病癥中感光細(xì)胞損失的組合物，該組合物包含有效減少感光細(xì)胞損失的量的祖細(xì)胞群或由祖細(xì)胞群制得的條件培養(yǎng)基。優(yōu)選地，祖細(xì)胞為如上所述產(chǎn)后衍生細(xì)胞。更優(yōu)選地，產(chǎn)后衍生細(xì)胞從如上所述基本上不含血的產(chǎn)后臍帶或胎盤中分離。變性病癥可為急性、慢性或進(jìn)行性病癥。在某些實(shí)施方案中，以上組合物包括至少一種其它細(xì)胞類型，諸如星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)祖細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、視網(wǎng)膜上皮干細(xì)胞、角膜上皮干細(xì)胞、或其它多能干細(xì)胞或多潛能干細(xì)胞。在這些及其它實(shí)施方案中，組合物包含至少一種其它試劑，諸如用于治療眼變性性病變的藥物或其它有益輔助劑，例如抗炎劑、抗凋亡劑、抗氧化劑或生長(zhǎng)因子。在如上所述的實(shí)施方案中，組合物為藥物組合物，該藥物組合物還包含藥學(xué)上可接受的載體。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物被配制用于施用給眼表面。另選地，其可被配制用于施用至眼內(nèi)部或眼附近(例如眼后面)。藥物組合物可被配制為包含如上所述祖細(xì)胞或由祖細(xì)胞制得的條件培養(yǎng)基的基質(zhì)或支架。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供試劑盒用于治療患有眼變性性病癥的患者。試劑盒包含藥學(xué)上可接受的載體、祖細(xì)胞或由祖細(xì)胞(例如從產(chǎn)后組織中分離的細(xì)胞，優(yōu)選上述產(chǎn)后衍生細(xì)胞)產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基，以及在治療患者的方法使用試劑盒的說明書。試劑盒還可包含一種或多種附加組分，例如用于產(chǎn)生條件培養(yǎng)基的試劑和說明書，或者至少一種其它細(xì)胞類型的群體、或一種或多種用于治療眼變性性病癥的試劑。本發(fā)明的另一個(gè)方面包括用于減少視網(wǎng)膜變性中感光細(xì)胞損失的方法，該方法包括將包含祖細(xì)胞群或由祖細(xì)胞群制得的條件培養(yǎng)基的組合物以有效減少感光細(xì)胞損失的量施用。優(yōu)選地，祖細(xì)胞為產(chǎn)后衍生細(xì)胞，或者條件培養(yǎng)基由如本文所述的產(chǎn)后衍生細(xì)胞群制備。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，產(chǎn)后衍生細(xì)胞從基本上不含血的臍帶組織或胎盤組織中分離。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，產(chǎn)后衍生細(xì)胞或由產(chǎn)后衍生細(xì)胞群制得的條件培養(yǎng)基包含細(xì)胞群分泌的橋分子。產(chǎn)后衍生細(xì)胞分泌的或條件培養(yǎng)基中分泌的此類橋分子選自mfg-e8、gas6、tsp-1和tsp-2。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于減少視網(wǎng)膜變性中感光細(xì)胞損失的方法，該方法包括將產(chǎn)后衍生細(xì)胞或由產(chǎn)后衍生細(xì)胞群制得的條件培養(yǎng)基以有效減少或防止感光細(xì)胞損失的量施用于眼。產(chǎn)后衍生細(xì)胞來源于基本上不含血的臍帶組織或胎盤組織。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)后衍生細(xì)胞群是基本上同質(zhì)的群體。在特定實(shí)施方案中，細(xì)胞群是同質(zhì)的。在本文所述的另一些方面，產(chǎn)后衍生細(xì)胞群(臍或胎盤)或由產(chǎn)后衍生細(xì)胞產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞免受氧化應(yīng)激或氧化性損傷或者改善來自于氧化應(yīng)激或氧化性損傷的視網(wǎng)膜損傷。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明為減少視網(wǎng)膜變性的方法，該方法包括將產(chǎn)后衍生細(xì)胞群或由產(chǎn)后衍生細(xì)胞群產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基以有效降低或免于氧化應(yīng)激或損傷的量施用于眼。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，產(chǎn)后衍生細(xì)胞從基本上不含血的臍帶組織或胎盤組織中分離。在一些實(shí)施方案中，視網(wǎng)膜細(xì)胞和組織暴露于氧化應(yīng)激或氧化性損傷。在本文實(shí)施方案中，視網(wǎng)膜細(xì)胞和組織是感光細(xì)胞或視網(wǎng)膜上皮，包括視網(wǎng)膜色素上皮(rpe)細(xì)胞。在本文實(shí)施方案中，氧化應(yīng)激或氧化性損傷是高氧壓、日光接觸，包括慢性日光接觸。一個(gè)實(shí)施方案是減少視網(wǎng)膜變性中感光細(xì)胞損失的方法，該方法包括將產(chǎn)后衍生細(xì)胞群或由產(chǎn)后衍生細(xì)胞群產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基以有效降低或免于氧化應(yīng)激或損傷的量施用于眼。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)后衍生細(xì)胞從基本上不含血的臍帶組織或胎盤組織中分離。在一些實(shí)施方案中，視網(wǎng)膜細(xì)胞和組織暴露于氧化應(yīng)激或氧化性損傷。在本文實(shí)施方案中，視網(wǎng)膜細(xì)胞和組織是感光細(xì)胞或視網(wǎng)膜上皮，包括視網(wǎng)膜色素上皮(rpe)細(xì)胞。在本文實(shí)施方案中，氧化應(yīng)激或氧化性損傷選自高氧壓、日光接觸(包括慢性日光接觸)、自由基應(yīng)激、光致氧化和光照誘導(dǎo)的損傷。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明為用于減少視網(wǎng)膜變性中感光細(xì)胞損失的方法，該方法包括將產(chǎn)后衍生細(xì)胞群或由產(chǎn)后衍生細(xì)胞群產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基以有效減少或防止感光細(xì)胞損失的量施用，其中所述細(xì)胞群從基本上不含血的產(chǎn)后組織中分離，并且其中所述細(xì)胞群能夠在培養(yǎng)中擴(kuò)增，具有分化成至少一種神經(jīng)表型的細(xì)胞的潛力，在傳代時(shí)保持正常核型，并且具有以下特征：a)在培養(yǎng)中40次群體倍增的潛力；b)產(chǎn)生cd10、cd13、cd44、cd73和cd90；以及c)不產(chǎn)生cd31、cd34、cd45、cd117和cd141；以及其中產(chǎn)后衍生細(xì)胞群分泌橋分子，其中由產(chǎn)后衍生細(xì)胞群制得的條件培養(yǎng)基包含細(xì)胞群分泌的橋分子。在一些實(shí)施方案中，由產(chǎn)后衍生細(xì)胞分泌的橋分子選自mfg-e8、gas6、tsp-1和tsp-2。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞群是基本上同質(zhì)的群體。在特定實(shí)施方案中，細(xì)胞群是同質(zhì)的。產(chǎn)后衍生細(xì)胞為臍帶組織衍生的細(xì)胞或胎盤組織衍生的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，臍帶組織衍生的細(xì)胞群分泌mcp-1、il-6、il-8、gcp-2、hgf、kgf、fgf、hb-egf、bdnf、tpo、miplb、i309、mdc、rantes和timp1。在一些實(shí)施方案中，臍帶組織衍生的細(xì)胞群不分泌tgf-β2、mip1a、ang2、pdgfbb和vegf，如由elisa所檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，胎盤組織衍生的細(xì)胞群分泌mcp-1、il-6、il-8、gcp-2、hgf、kgf、hb-egf、bdnf、tpo、mip1a、rantes和timp1。在一些實(shí)施方案中，胎盤組織衍生的細(xì)胞群不分泌tgf-β2、miplb、ang2、pdgfbb、fgf和vegf，如由elisa所檢測(cè)。在一些實(shí)施方案中，臍衍生的細(xì)胞或胎盤衍生的細(xì)胞對(duì)hla-a、b、c呈陽(yáng)性，并且對(duì)hla-dr、dp、dq呈陰性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，臍衍生的細(xì)胞不表達(dá)htert或端粒酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明為用于減少視網(wǎng)膜變性中感光細(xì)胞損失的方法，該方法包括將產(chǎn)后衍生細(xì)胞群或由產(chǎn)后衍生細(xì)胞群制得的條件培養(yǎng)基以有效減少感光細(xì)胞損失的量施用，其中所述細(xì)胞群從基本上不含血的人臍帶組織中分離，并且其中所述細(xì)胞群能夠在培養(yǎng)中擴(kuò)增，具有分化成至少一種神經(jīng)表型的細(xì)胞的潛力，在傳代時(shí)保持正常核型，并且具有以下特征：a)在培養(yǎng)中40次群體倍增的潛力；b)產(chǎn)生cd10、cd13、cd44、cd73和cd90；c)不產(chǎn)生cd31、cd34、cd45、cd117和cd141；以及d)相對(duì)于為成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或髂嵴骨髓細(xì)胞的人細(xì)胞，編碼白介素8和漿膜蛋白1的基因表達(dá)增加，并且其中產(chǎn)后衍生細(xì)胞群分泌橋分子，或者其中由產(chǎn)后衍生細(xì)胞群制得的條件培養(yǎng)基包含細(xì)胞群分泌的橋分子。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)后衍生細(xì)胞群分泌的橋分子，或者產(chǎn)后衍生細(xì)胞群在條件培養(yǎng)基中分泌的橋分子選自mfg-e8、gas6、tsp-1和tsp-2。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞群分泌mcp-1、il-6、il-8、gcp-2、hgf、kgf、fgf、hb-egf、bdnf、tpo、miplb、i309、mdc、rantes和timp1。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞群不分泌tgf-β2、mip1a、ang2、pdgfbb和vegf，如由elisa所檢測(cè)。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞群對(duì)hla-a、b、c呈陽(yáng)性，并且對(duì)hla-dr、dp、dq呈陰性。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞群是基本上同質(zhì)的群體。在特定實(shí)施方案中，細(xì)胞群是同質(zhì)的。此外，細(xì)胞群不表達(dá)htert或端粒酶。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于減少視網(wǎng)膜變性中感光細(xì)胞損失的方法，該方法包括將臍衍生細(xì)胞群或由臍衍生細(xì)胞群制得的條件培養(yǎng)基以有效減少或防止感光細(xì)胞損失的量施用，其中所述細(xì)胞群從基本上不含血的人臍帶組織中分離，并且其中所述細(xì)胞群能夠在培養(yǎng)中擴(kuò)增，具有分化成至少一種神經(jīng)表型的細(xì)胞的潛力，并且具有以下特征：a.在培養(yǎng)中40次群體倍增的潛力；b.產(chǎn)生cd10、cd13、cd44、cd73和cd90；以及c.相對(duì)于為成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或髂嵴骨髓細(xì)胞的人細(xì)胞，編碼白介素8和漿膜蛋白1的基因表達(dá)增加，并且產(chǎn)后衍生細(xì)胞群分泌橋分子，其中由產(chǎn)后衍生細(xì)胞群制得的條件培養(yǎng)基包含細(xì)胞群分泌的橋分子。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)后衍生細(xì)胞群分泌的橋分子，或者條件培養(yǎng)基中分泌的橋分子選自mfg-e8、gas6、tsp-1和tsp-2。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞不產(chǎn)生cd31、cd34、cd45、cd117和cd141并對(duì)它們呈陰性。在一個(gè)實(shí)施方案中，臍帶組織衍生的細(xì)胞群分泌mcp-1、il-6、il-8、gcp-2、hgf、kgf、fgf、hb-egf、bdnf、tpo、miplb、i309、mdc、rantes和timp1，并且不分泌tgf-β2、mip1a、ang2、pdgfbb和vegf，如由elisa所檢測(cè)。在一些實(shí)施方案中，臍衍生細(xì)胞群對(duì)hla-a、b、c呈陽(yáng)性，并且對(duì)hla-dr、dp、dq呈陰性。此外，細(xì)胞群不表達(dá)htert或端粒酶。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞群是基本上同質(zhì)的群體。在特定實(shí)施方案中，細(xì)胞群是同質(zhì)的。本發(fā)明的另一個(gè)方面是制備條件培養(yǎng)基的方法，所述方法包括培養(yǎng)細(xì)胞群，其中所述條件培養(yǎng)基包含細(xì)胞群分泌的橋分子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，橋分子由條件培養(yǎng)基中的細(xì)胞群分泌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，橋分子選自mfg-e8、gas6、血小板反應(yīng)蛋白(tsp)-1和tsp-2。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，細(xì)胞是祖細(xì)胞。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，細(xì)胞是產(chǎn)后衍生細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，產(chǎn)后衍生細(xì)胞從基本上不含血的人臍帶組織或胎盤組織中分離。在如上所述的本發(fā)明實(shí)施方案中，產(chǎn)后衍生細(xì)胞群具有如下特征：在經(jīng)包被或未經(jīng)包被的組織培養(yǎng)容器上貼附和擴(kuò)增，其中經(jīng)包被的組織培養(yǎng)容器包含明膠、層粘連蛋白、膠原、多聚鳥氨酸、玻連蛋白或纖連蛋白的被覆物；產(chǎn)生波形蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白；并且對(duì)hla-a、b、c呈陽(yáng)性且對(duì)hla-dr、dp、dq呈陰性。在如上所述的本發(fā)明實(shí)施方案中，視網(wǎng)膜變性、視網(wǎng)膜病變或視網(wǎng)膜/黃斑病變?yōu)槟挲g相關(guān)性黃斑變性。在一個(gè)另選實(shí)施方案中，視網(wǎng)膜變性、視網(wǎng)膜病變或視網(wǎng)膜/黃斑病變?yōu)楦尚阅挲g相關(guān)性黃斑變性。在如上所述的本發(fā)明實(shí)施方案中，感光細(xì)胞的損失通過抑制感光細(xì)胞的凋亡來減少或防止。在一些實(shí)施方案中，感光細(xì)胞的損失通過刺激脫落的感光細(xì)胞片段的吞噬來減少或防止。附圖說明圖1a-1b示出在含血清的hutccm1制劑中預(yù)孵育對(duì)營(yíng)養(yǎng)不良rpe吞噬作用的影響。圖1a.將著色的營(yíng)養(yǎng)不良rpe用cm1制劑(含有血清)預(yù)孵育。就對(duì)照而言，將棕褐色盔狀正常和著色的rpe用對(duì)照培養(yǎng)基(dmem：f12培養(yǎng)基+10％fbs+青霉素(50u/ml)/鏈霉素(50μg/ml))預(yù)孵育。孵育時(shí)間為16小時(shí)。(tann：棕褐色盔狀正常rpe；pigd：著色的營(yíng)養(yǎng)不良rpe；con：對(duì)照；m：培養(yǎng)基；cm：條件培養(yǎng)基；w：含有)。值為一個(gè)樣本的計(jì)數(shù)視野中被吞噬的ros數(shù)的平均值±sd(每個(gè)樣本n＝11或12；n：所計(jì)數(shù)的視野數(shù))；相對(duì)于pigd對(duì)照p＜0.05。圖1b.將營(yíng)養(yǎng)不良rpe用cm1(含有血清)預(yù)孵育。就對(duì)照而言，將正常和營(yíng)養(yǎng)不良rpe在含血清的對(duì)照培養(yǎng)基中預(yù)孵育。孵育時(shí)間為24小時(shí)。(n：正常rpe；d：營(yíng)養(yǎng)不良rpe；d(1)：一式三份的第1份；d(2)：一式三份的第2份；d(3)：一式三份的第3份；con：對(duì)照；m：培養(yǎng)基；cm：條件培養(yǎng)基；w：含有)。值為一個(gè)樣本的計(jì)數(shù)視野中被吞噬的ros數(shù)的平均值±sd(每個(gè)樣本n＝11、12或13；n：所計(jì)數(shù)的視野數(shù))。相對(duì)于d對(duì)照p＜0.05。圖2示出在無血清的hutccm1制劑中預(yù)孵育對(duì)營(yíng)養(yǎng)不良rpe吞噬作用的影響。將著色的營(yíng)養(yǎng)不良rpe用cm1(無血清)預(yù)孵育。就對(duì)照而言，將棕褐色盔狀正常和著色的營(yíng)養(yǎng)不良rpe在無血清的對(duì)照培養(yǎng)基中預(yù)孵育。孵育時(shí)間為24小時(shí)。(tann：棕褐色盔狀正常rpe；pigd：著色的營(yíng)養(yǎng)不良rpe；con：對(duì)照；m：培養(yǎng)基；cm：條件培養(yǎng)基；wo：無)。值為一個(gè)樣本的計(jì)數(shù)視野中被吞噬的ros數(shù)的平均值±sd(每個(gè)樣本n＝9、10、11或12；n：所計(jì)數(shù)的視野數(shù))；相對(duì)于pigd對(duì)照p＜0.05。圖3a-3d示出在hutccm中預(yù)孵育對(duì)吞噬作用的影響。(圖3a)在hutccm2中預(yù)孵育對(duì)吞噬作用的影響將著色的營(yíng)養(yǎng)不良rpe用cm2預(yù)孵育。就對(duì)照而言，將棕褐色盔狀正常和著色的營(yíng)養(yǎng)不良rpe在對(duì)照培養(yǎng)基中預(yù)孵育。孵育時(shí)間為24小時(shí)。(tann：棕褐色盔狀正常rpe；pigd：著色的營(yíng)養(yǎng)不良rpe；con：對(duì)照；m：培養(yǎng)基；cm：條件培養(yǎng)基)。值為一個(gè)樣本的計(jì)數(shù)視野中被吞噬的ros數(shù)的平均值±sd(每個(gè)樣本n＝8或10；n：所計(jì)數(shù)的視野數(shù))。(圖3b-3d)在hutccm3中預(yù)孵育對(duì)吞噬作用的影響將營(yíng)養(yǎng)不良rpe用cm3預(yù)孵育。就對(duì)照而言，將正常和營(yíng)養(yǎng)不良rpe在對(duì)照培養(yǎng)基中預(yù)孵育。孵育時(shí)間為24小時(shí)。圖3b(n：正常rpe；d：營(yíng)養(yǎng)不良rpe；con：對(duì)照；m：培養(yǎng)基；cm：條件培養(yǎng)基)。值為一式三份樣本的計(jì)數(shù)視野中被吞噬的ros數(shù)的平均值±sd(每個(gè)樣本n＝5-12；n：所計(jì)數(shù)的視野數(shù))；相對(duì)于d+conm對(duì)照p＜0.05。圖3c正常rpe對(duì)照來自于cm3測(cè)試1。(n：正常rpe；d：營(yíng)養(yǎng)不良rpe；con：對(duì)照；m：培養(yǎng)基；cm：條件培養(yǎng)基)。值為一個(gè)樣本的計(jì)數(shù)視野中被吞噬的ros數(shù)的平均值±sd(每個(gè)樣本n＝11或14；n：所計(jì)數(shù)的視野數(shù))；相對(duì)于d+conm對(duì)照p＜0.05。圖3d(n：正常rpe；n1：得自培養(yǎng)物的正常rpe；n2：得自n2培養(yǎng)物的正常rpe；tann：棕褐色盔狀正常rpe；d：營(yíng)養(yǎng)不良rpe；con：對(duì)照；m：培養(yǎng)基；cm：條件培養(yǎng)基)。值為一個(gè)樣本的計(jì)數(shù)視野中被吞噬的ros數(shù)的平均值±sd(每個(gè)樣本n＝12或13；n：所計(jì)數(shù)的視野數(shù))；相對(duì)于d+conm對(duì)照p＜0.05。圖4a-4c示出hutc對(duì)體外rcsrpe細(xì)胞中吞噬作用的影響。將rcsrpe細(xì)胞與跨孔中鋪板的hutc共培養(yǎng)(圖13e)或用hutccm孵育(圖13f)24小時(shí)并然后經(jīng)受吞噬測(cè)定。n：正常rpe；d：營(yíng)養(yǎng)不良rcsrpe；cm：條件培養(yǎng)基。在與hutc共培養(yǎng)或用hutccm孵育的rcsrpe中，觀察到吞噬增加。(圖13g)將感光細(xì)胞os用hutccm孵育24小時(shí)后喂飼給rcsrpe細(xì)胞以在不存在hutccm時(shí)進(jìn)行吞噬測(cè)定。rcsrpe對(duì)經(jīng)hutccm-處理的os的吞噬得到恢復(fù)。數(shù)據(jù)表示平均值±sem(n＝3)。****p＜0.0001。圖5a-5b示出對(duì)bdnf或hb-egf而言rtk配體的測(cè)定結(jié)果。將營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞用含bdnf(200ng/ml)(圖5a)或hb-egf(200ng/ml)(圖5b)的mem+5％fbs(mem5)孵育24h。就陽(yáng)性對(duì)照而言，將營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞在cm3中孵育24h。就其它對(duì)照而言，將正常和營(yíng)養(yǎng)不良rpe在mem5中孵育24h并經(jīng)受吞噬測(cè)定。(n：正常rpe；d：營(yíng)養(yǎng)不良rpe；con：對(duì)照；m：培養(yǎng)基；cm：條件培養(yǎng)基)。值為一式兩份或一式三份樣本的計(jì)數(shù)視野中被吞噬的ros數(shù)的平均值±sd(每個(gè)樣本n＝10、11或12；n：所計(jì)數(shù)的視野數(shù))；相對(duì)于d對(duì)照p＜0.05。圖6a-6e示出對(duì)pdgf-dd、肝配蛋白a4和hgf而言rtk配體的測(cè)定結(jié)果。將營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞用含pdgf-dd(圖6a，6b)、肝配蛋白a4(圖6c)或hgf(200ng/ml)(圖6d，6e)的mem5孵育24h，接著在將ros添加至包含pdgf-dd、肝配蛋白a4或hgf的mem5的情況下使其經(jīng)受吞噬測(cè)定(在添加ros時(shí)不更換培養(yǎng)基)。就陽(yáng)性對(duì)照而言，將營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞在cm3中孵育24h。就其它對(duì)照而言，將正常和營(yíng)養(yǎng)不良rpe在mem5中孵育24h并經(jīng)受吞噬測(cè)定。(n：正常rpe；d：營(yíng)養(yǎng)不良rpe；con：對(duì)照；m：培養(yǎng)基；cm：條件培養(yǎng)基)。值為一式兩份或一式三份樣本的計(jì)數(shù)視野中被吞噬的ros數(shù)的平均值±sd(每個(gè)樣本n＝10、11或12；n：所計(jì)數(shù)的視野數(shù))；相對(duì)于d對(duì)照p＜0.05。圖7a-7b示出對(duì)肝配蛋白b2而言rtk配體的測(cè)定結(jié)果。將營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞用肝配蛋白b2(200ng/ml)孵育。就陽(yáng)性對(duì)照而言，將營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞在cm3中孵育。就其它對(duì)照而言，將正常和營(yíng)養(yǎng)不良rpe在mem5中孵育24h并經(jīng)受吞噬測(cè)定。(n：正常rpe；d：營(yíng)養(yǎng)不良rpe；con：對(duì)照；m：培養(yǎng)基；cm：條件培養(yǎng)基)。值為一式兩份或一式三份樣本的計(jì)數(shù)視野中被吞噬的ros數(shù)的平均值±sd(每個(gè)樣本n＝10、11或12；n：所計(jì)數(shù)的視野數(shù))；相對(duì)于d對(duì)照p＜0.05。圖8a-8c示出用內(nèi)皮素-1、tgf-β1或il-6處理的營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞。(圖8a)相比于正常對(duì)照，針對(duì)吞噬作用測(cè)定內(nèi)皮素-1或tgf-β1(200ng/ml)。(圖8b，8c)將營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞用200ng/ml的重組人內(nèi)皮素-1、tgf-β1或il-6孵育并測(cè)定吞噬作用。將hutccm3用作陽(yáng)性對(duì)照。就其它對(duì)照而言，將正常和營(yíng)養(yǎng)不良rpe在mem5中孵育24h并經(jīng)受吞噬測(cè)定。(n：正常rpe；d：營(yíng)養(yǎng)不良rpe)。值為每個(gè)樣本的計(jì)數(shù)視野中被吞噬的ros數(shù)的平均值±sd(每個(gè)樣本n＝10；n：所計(jì)數(shù)的視野數(shù))。圖9示出用經(jīng)各種濃度的玻連蛋白預(yù)溫育的ros喂養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞連同正常對(duì)照并測(cè)定吞噬作用。將ros用對(duì)照培養(yǎng)基(dmem+10％fbs)或cm3預(yù)溫育。平行地，將ros在具有各種濃度的人重組玻連蛋白(4、2、1、0.5μg/ml)的mem20中分別預(yù)溫育。就對(duì)照而言，將單獨(dú)的正常rpe或單獨(dú)的營(yíng)養(yǎng)不良rpe在mem20中培養(yǎng)，然后在未經(jīng)處理的ros存在下(重懸于mem20中并喂飼給rpe細(xì)胞)更換成mem5以進(jìn)行吞噬測(cè)定。(n：正常rpe；d：營(yíng)養(yǎng)不良rpe；conm：對(duì)照培養(yǎng)基；v：玻連蛋白)。值為每個(gè)樣本的計(jì)數(shù)視野中被吞噬的ros數(shù)的平均值±sd(每個(gè)樣本n＝10；n：所計(jì)數(shù)的視野數(shù))。圖10示出hutc中鑒定的rtk配體的基因表達(dá)水平。從hutc中提取總mrna并且進(jìn)行rna-seq以鑒定和定量hutc中的rtk配體基因表達(dá)。所鑒定的rtk配體基于對(duì)應(yīng)的rtk亞族分類并根據(jù)其fpkm值分級(jí)。在hutc中檢測(cè)到15個(gè)rtk亞族的多個(gè)rtk配體的基因表達(dá)。圖11a-11g示出在hutccm中測(cè)量的所選rtk配體的水平。(圖11a-11f)相比于得自nhdf和arpe-19條件培養(yǎng)基的那些的rtk配體的水平。相比于nhdf和arpe-19條件培養(yǎng)基，bdnf在hutc條件培養(yǎng)基中以高水平分泌(圖11a)。hutccm中nt3的水平相比于nhdfcm較高，而nt3的量在arpe-19條件培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中卻檢測(cè)不到(圖11b)。相比于nhdf和arpe-19條件培養(yǎng)基，hgf在hutccm中以高水平分泌(圖11c)。相比于nhdf和arpe-19條件培養(yǎng)基，pdgf-cc和pdgf-dd水平在hutc條件培養(yǎng)基中較低(分別為圖11d和圖11e)。gdnf在hutc和nhdf條件培養(yǎng)基中分泌，在arpe-19條件培養(yǎng)基為痕量(圖11f)。除nt3為一式兩份樣本的平均值±sd之外，所有值均為一式三份樣本的平均值±sd。(圖11g)由elisa測(cè)量的rtk配體的水平。(所示數(shù)據(jù)為平均值±sem；n＝3)。圖12a-12e示出在hutccm中測(cè)量的橋分子的水平。(圖12a-12e)相比于nhdf和arpe-19條件培養(yǎng)基的橋分子水平。圖12a示出hutc、arpe-19和nhdf條件培養(yǎng)基中的mfg-e8水平。值為一式兩份或一式三份樣本的平均值±sd。圖12b示出hutc、arpe-19和nhdf條件培養(yǎng)基中的gas6水平。值為一式兩份樣本的平均值±sd。圖12c示出hutc、arpe-19和nhdf條件培養(yǎng)基中的tsp-1水平。值為一式兩份樣本的平均值±sd。圖12d示出hutc、arpe-19和nhdf條件培養(yǎng)基中的tsp-2水平。值為一式兩份樣本的平均值±sd。(圖12e)由elisa測(cè)量的橋分子水平。所示數(shù)據(jù)為平均值±sem(對(duì)于tsp-1和tsp-2，n＝2；對(duì)于所有mfg-e8，n＝3)。圖13a-13c展示用hutc條件培養(yǎng)基(cm)預(yù)孵育營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞對(duì)吞噬作用的影響。就對(duì)照而言，將單獨(dú)的正常rpe或單獨(dú)的營(yíng)養(yǎng)不良rpe在其常規(guī)生長(zhǎng)培養(yǎng)基mem20(mem+20％fbs)中預(yù)孵育。平行地，也將營(yíng)養(yǎng)不良rpe用cm3預(yù)孵育。此外，測(cè)試用hutccm3預(yù)溫育的ros。值為每個(gè)樣本的計(jì)數(shù)視野中被吞噬的ros數(shù)的平均值±sd。圖13a，每個(gè)樣本n＝10-20；圖13b為原始數(shù)據(jù)。圖13c，每個(gè)樣本n＝12并且每種樣本一式兩份(n：所計(jì)數(shù)的視野數(shù))；圖13d為原始數(shù)據(jù)。圖14a-14d示出橋分子和ptk配體對(duì)rcsrpe細(xì)胞吞噬視桿細(xì)胞外節(jié)盤膜(ros)的影響。將ros用對(duì)照培養(yǎng)基(dmem+10％fbs)或hutc條件培養(yǎng)基預(yù)溫育。平行地，將ros在具有各種濃度的人重組mfg-e8(圖14a)、gas6(圖14b)、tsp-1(圖14c)或tsp-2(圖14d)的對(duì)照培養(yǎng)基中預(yù)溫育。就對(duì)照而言，培養(yǎng)單獨(dú)的正常rpe或單獨(dú)的營(yíng)養(yǎng)不良rpe以進(jìn)行吞噬測(cè)定。(n：正常rpe；n+ros：在吞噬測(cè)定期間用未經(jīng)處理的ros喂養(yǎng)的正常rpe細(xì)胞；d：營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞；d+ros：在吞噬測(cè)定期間用未經(jīng)處理的ros喂養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞；conm：對(duì)照培養(yǎng)基；d+ros+con：用經(jīng)對(duì)照培養(yǎng)基預(yù)溫育的ros喂養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞；cm4：第4批hutc條件培養(yǎng)基)。d+ros+cm4：用經(jīng)cm4預(yù)溫育的ros喂養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞；d+ros+mfg-e8：用經(jīng)mfg-e8預(yù)溫育的ros喂養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞。值為每個(gè)樣本的計(jì)數(shù)視野中被吞噬的ros數(shù)的平均值±sd(每個(gè)樣本n＝10；n：所計(jì)數(shù)的視野數(shù))。*p＜0.001，經(jīng)mfg-e8、gas6、tsp-1或tsp-2預(yù)處理的d+ros相對(duì)于d+ros+conm和d+ros；**p＜0.0001，d+ros+cm4相對(duì)于d+ros和d+ros+conm。(圖14e-14h)將感光細(xì)胞os用重組人mfg-e8(圖14e)、gas6(圖14f)、tsp-1(圖14g)或tsp-2(圖14h)溫育24小時(shí)并然后喂飼給rcsrpe細(xì)胞以在不存在cm時(shí)進(jìn)行吞噬測(cè)定。將用hutccm預(yù)溫育的os用作測(cè)定的陽(yáng)性對(duì)照。rcsrpe細(xì)胞對(duì)os的吞噬以劑量依賴方式通過mfg-e8、gas6、tsp-1或tsp-2拯救。(圖14i-14k)將rcsrpe用重組人bdnf(圖14i)、hgf(圖14j)或gdnf(圖14k)孵育24小時(shí)，然后經(jīng)受吞噬測(cè)定。將用hutccm溫育的rcsrpe用作測(cè)定的陽(yáng)性對(duì)照。bdnf、hgf或gdnf劑量依賴性地增加rcsrpe細(xì)胞的吞噬。數(shù)據(jù)表示平均值±sem(n＝3)。****p＜0.0001，***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05，n.s.不顯著。圖15a-15c.rcsrpe中用于hutc-介導(dǎo)的吞噬拯救的rtk配體和橋分子。(圖15a)從未轉(zhuǎn)染的hutc和經(jīng)sirna轉(zhuǎn)染的hutc收集的細(xì)胞培養(yǎng)上層清液的elisa。(圖15b)rtk配體bdnf、hgf和gdnf的表達(dá)通過hutc的sirna轉(zhuǎn)染而沉默。收獲得到敲低(knockdown，kd)的hutccm。將rcsrpe用kdhutccm孵育24小時(shí)并然后經(jīng)受吞噬測(cè)定。hutc對(duì)rcsrpe吞噬作用的影響在bdnf、hgf或gdnf敲低時(shí)消除。(圖15c)橋分子mfg-e8、tsp-1和tsp-2的表達(dá)在hutc中通過sirna轉(zhuǎn)染沉默。收獲得到kdhutccm。將rcsrpe用經(jīng)kdhutccm預(yù)溫育24小時(shí)的os喂養(yǎng)并經(jīng)受吞噬測(cè)定。mfg-e8、tsp-1或tsp-2的敲低降低了rcsrpe中hutc-介導(dǎo)的吞噬拯救。將由未轉(zhuǎn)染的hutc和混雜sirna轉(zhuǎn)染的hutc制得的cm用作對(duì)照。數(shù)據(jù)表示平均值±sem，對(duì)于(b)和(c)，n＝3，對(duì)于未轉(zhuǎn)染的、模擬或混雜sirna轉(zhuǎn)染的hutccmelisa(a)，n＝6。****p＜0.0001，***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05，n.s.不顯著。圖16a-16d.hutc-分泌的橋分子與感光細(xì)胞os結(jié)合。將免疫熒光(if)染色的os用個(gè)體重組人mfg-e8(124ng/ml)、gas6(8.75ng/ml)、tsp-1(1.2[tg/ml)或tsp-2(238ng/ml)(圖16a)、或hutccm(圖16b)或?qū)φ张囵B(yǎng)基(圖16c)溫育24小時(shí)，隨后用alexafluor568綴合的抗視紫紅質(zhì)抗體對(duì)視紫紅質(zhì)和用alexafluor488綴合的抗-mfg-e8、抗-gas6、抗-tsp-1、抗-tsp-2、小鼠igg2a或小鼠igg2b同種型對(duì)照抗體對(duì)橋分子進(jìn)行雙重if染色。經(jīng)視紫紅質(zhì)染色的os微粒對(duì)于重組橋分子蛋白或hutccm中所存在的分泌橋分子中的每者也呈現(xiàn)正染。(圖16d)抗視紫紅質(zhì)抗體的特異性通過用alexafluor568綴合的抗視紫紅質(zhì)抗體和alexafluor488綴合的小鼠igg2b、x同種型對(duì)照抗體對(duì)os進(jìn)行雙重if染色加以證實(shí)。上部圖形(圖16a-16d)，橋分子和同種型抗體染色；下部圖形(圖16a-16d)，視紫紅質(zhì)抗體染色。圖17a-17f示出hutc和hutc條件培養(yǎng)基免受氧化應(yīng)激或損傷。圖17a-17b示出hutc條件培養(yǎng)基防止含a2e的rpe細(xì)胞在430nm輻射之后無生存力。(圖17a)使用雙色熒光測(cè)定來測(cè)定細(xì)胞死亡。將hutc條件培養(yǎng)基和非條件對(duì)照培養(yǎng)基(250μl/孔)與載有a2e的arpe-19細(xì)胞一起溫育7天。非存活細(xì)胞的百分比通過雙色熒光測(cè)定進(jìn)行測(cè)定；平行測(cè)定5次。圖17b示出得自5％和10％fbs處理的合并的數(shù)據(jù)。數(shù)值為平均值+/-semp＜0.05；單因素方差分析和newmankeuls多重比較測(cè)試。圖17c-17d示出hutc條件培養(yǎng)基保護(hù)arpe-19細(xì)胞免于與a2e光致氧化相關(guān)的降低的細(xì)胞生存力。(圖17c)通過mtt來分析細(xì)胞生存力。將hutc條件培養(yǎng)基和非條件對(duì)照培養(yǎng)基(250μl/孔)與載有a2e的arpe-19細(xì)胞一起溫育(7天，37℃，5％co2，5％fbs)。柱條高度表示mtt吸光度并反映細(xì)胞生存力。圖17d示出得自5％和10％fbs處理的合并的數(shù)據(jù)。數(shù)值為平均值+/-sem；4次平行測(cè)定/2個(gè)實(shí)驗(yàn)。*p＞0.05；**p＜0.05；單因素方差分析和newmankeuls多重比較測(cè)試。圖17e-17f示出hutc條件培養(yǎng)基保護(hù)arpe-19細(xì)胞免于與急性h2o2相關(guān)的降低的細(xì)胞生存力。通過mtt(圖17e)和結(jié)晶紫(圖17d)測(cè)定細(xì)胞生存力。y軸表示550nm處校正過的od讀數(shù)。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。p＜0.05(通過雙因素方差分析)。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)由下述具體實(shí)施方式和實(shí)施例將是顯而易見的。具體實(shí)施方式貫穿整個(gè)說明書參考了各種專利和其它出版物。這些出版物各自全文以引用方式并入本文。在例示性實(shí)施方案的下述詳述中，參考構(gòu)成其一部分的附圖。這些實(shí)施方案充分詳細(xì)地進(jìn)行描述，以允許本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)踐本發(fā)明，并且應(yīng)當(dāng)理解可利用其它實(shí)施方案，并且可作出邏輯結(jié)構(gòu)、機(jī)械、電和化學(xué)變化，而不背離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)或范圍。為了避免對(duì)于允許本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)踐本文描述的實(shí)施方案不必要的細(xì)節(jié)，描述可省略本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的某些信息。因此，接下來的詳述不應(yīng)被理解為限制性意義的，并且例示性實(shí)施方案的范圍僅由所附的權(quán)利要求界定。定義貫穿整個(gè)說明書和權(quán)利要求所用的各種術(shù)語(yǔ)均按下文所述定義并且旨在闡明本發(fā)明。干細(xì)胞是由單細(xì)胞自我更新和分化以產(chǎn)生后代細(xì)胞的能力定義的未分化細(xì)胞，包括自我更新的祖細(xì)胞、非更新的祖細(xì)胞以及終末分化的細(xì)胞。干細(xì)胞還由它們的以下能力來表征：從多個(gè)胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)體外分化成多種細(xì)胞譜系的功能細(xì)胞的能力，以及在移植后產(chǎn)生多個(gè)胚層的組織的能力和在注射到胚泡后基本上促成大多數(shù)組織(如果不是所有的組織的話)的能力。根據(jù)干細(xì)胞的發(fā)育潛力，將它們分類為：(1)全能；(2)多能；(3)多潛能；(4)寡能；和(5)單能。全能細(xì)胞能夠產(chǎn)生所有胚胎和胚胎外細(xì)胞類型。多能細(xì)胞能夠產(chǎn)生所有胚胎細(xì)胞類型。多潛能細(xì)胞包括能夠產(chǎn)生細(xì)胞譜系的子類，但是均處于特定組織、器官或生理學(xué)系統(tǒng)內(nèi)(例如，造血干細(xì)胞(hsc)可以產(chǎn)生子代，所述子代包括hsc(自我更新)、血液細(xì)胞限制性寡能祖細(xì)胞和作為血液正常組分的全部細(xì)胞類型和要素(例如，血小板))的那些；寡能細(xì)胞能夠產(chǎn)生比多潛能干細(xì)胞更加局限的細(xì)胞譜系子類；單能細(xì)胞能夠產(chǎn)生單個(gè)細(xì)胞譜系(例如生精干細(xì)胞)。也基于干細(xì)胞可獲得的來源而將它們分類。成體干細(xì)胞一般為在包含多個(gè)分化細(xì)胞類型的組織中發(fā)現(xiàn)的多潛能未分化細(xì)胞。成體干細(xì)胞可自我更新。在正常情況下，它也可分化產(chǎn)生特化的組織細(xì)胞類型(其起源于該組織)，并且可能產(chǎn)生其它組織類型。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ips細(xì)胞)是轉(zhuǎn)化成多能干細(xì)胞的成體細(xì)胞(takahashi等人，cell，2006；126(4)：663-676；takahashi等人，cell，2007；131：1-12)。胚胎干細(xì)胞是來自胚泡期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的多能細(xì)胞。胎兒干細(xì)胞是源于胎兒組織或膜的干細(xì)胞。產(chǎn)后干細(xì)胞是基本上起源于可在分娩后得到的胚胎外組織(亦即胎盤和臍帶)的多潛能或多能細(xì)胞。已發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞具有多能干細(xì)胞的特征特性，包括快速增殖和分化成許多細(xì)胞譜系的潛力。產(chǎn)后干細(xì)胞可為血液衍生的(如，從臍帶血液獲得的那些)或非血液衍生的(如，從臍帶和胎盤的非血液組織獲得的)。胚胎組織通常定義為起源于胚胎的組織(在人中是指受精至發(fā)育約六周的時(shí)期)。胎兒組織是指起源于胎兒的組織(在人中是指發(fā)育約六周至分娩的時(shí)期)。胚胎外組織為與胚胎或胎兒相關(guān)但不起源于它們的組織。胚胎外組織包括胚外膜(絨毛膜、羊膜、卵黃囊和尿膜)、臍帶和胎盤(其自身由絨毛膜和母體的底蛻膜形成)?！胺只笔欠翘鼗?“未定向的”)或較少特化的細(xì)胞通過其獲得特化的細(xì)胞(諸如神經(jīng)細(xì)胞或肌肉細(xì)胞)特征的過程。分化的細(xì)胞是已在細(xì)胞譜系中占據(jù)更特化的(“定向的”)位置的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“定向的”，當(dāng)應(yīng)用到分化的過程時(shí)，是指在分化途徑中已經(jīng)進(jìn)行到這么一種程度的細(xì)胞：在正常情況下，它會(huì)繼續(xù)分化成特定的細(xì)胞類型或細(xì)胞類型子類，并且在正常情況下不能分化成不同細(xì)胞類型或回復(fù)到分化不足的細(xì)胞類型。去分化指細(xì)胞回復(fù)到細(xì)胞譜系中特化(或定向)不足的位置的過程。如本文所用，細(xì)胞譜系定義細(xì)胞的遺傳性，即源于何種細(xì)胞以及會(huì)產(chǎn)生什么細(xì)胞。細(xì)胞譜系將細(xì)胞定位于發(fā)育和分化的遺傳方案內(nèi)。在廣義上，祖細(xì)胞是具有產(chǎn)生比其自身分化程度更高的后代的能力，然而保持補(bǔ)充祖細(xì)胞數(shù)目能力的細(xì)胞。根據(jù)此定義，因?yàn)楦杉?xì)胞是終末分化細(xì)胞的更直接前體，故其本身也是祖細(xì)胞。在提及本發(fā)明的細(xì)胞(如下文更詳細(xì)地描述)時(shí)，可使用該祖細(xì)胞的廣義定義。在狹義上，祖細(xì)胞通常定義為在分化途徑中間(即，其起于干細(xì)胞)并且在成熟細(xì)胞類型或細(xì)胞類型子類生產(chǎn)中間的細(xì)胞。該祖細(xì)胞類型一般不能夠自我更新。因此，如果本文涉及該細(xì)胞類型，其將被稱為非更新的祖細(xì)胞或中間祖細(xì)胞或前體細(xì)胞。如本文所用，短語(yǔ)“分化成眼部譜系或表型”是指變得部分或完全定向于特定眼部表型的細(xì)胞，無限制地包括視網(wǎng)膜和角膜干細(xì)胞、視網(wǎng)膜和虹膜的色素上皮細(xì)胞、感光細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)及其它視覺神經(jīng)譜系(例如，視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、mueller細(xì)胞)、形成晶狀體的細(xì)胞、以及鞏膜、角膜、角膜緣和結(jié)膜的上皮細(xì)胞。短語(yǔ)“分化成神經(jīng)譜系或表型”是指變得部分或完全定向于cns或pns的特定神經(jīng)表型的細(xì)胞，即神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，后一類無限制地包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)膜細(xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。本文例示和本發(fā)明優(yōu)選使用的細(xì)胞通常被稱為產(chǎn)后衍生細(xì)胞(或ppdc)。其有時(shí)也可被更具體地稱為臍衍生的細(xì)胞或胎盤衍生的細(xì)胞(udc或pdc)。此外，所述細(xì)胞可被描述為干細(xì)胞或祖細(xì)胞，后面的術(shù)語(yǔ)在廣義中使用。術(shù)語(yǔ)“衍生的”用于指示細(xì)胞已從其生物來源獲得并且在體外生長(zhǎng)或以其它方式處理(例如，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)以擴(kuò)增群體和/或產(chǎn)生細(xì)胞系)。臍干細(xì)胞和胎盤干細(xì)胞的體外操作和本發(fā)明的臍衍生的細(xì)胞和胎盤衍生的細(xì)胞的獨(dú)特特征于下文詳細(xì)地描述。也認(rèn)為通過其它方式從產(chǎn)后胎盤和臍分離的細(xì)胞適用本發(fā)明。這些其它細(xì)胞在本文被稱為產(chǎn)后細(xì)胞(而非產(chǎn)后衍生細(xì)胞)。多個(gè)術(shù)語(yǔ)用于描述培養(yǎng)中的細(xì)胞。“細(xì)胞培養(yǎng)”一般指從活生物體取得并在受控條件下生長(zhǎng)(“在培養(yǎng)中”或“培養(yǎng)的”)的細(xì)胞。原代細(xì)胞培養(yǎng)是在第一繼代培養(yǎng)之前培養(yǎng)從生物體直接取得的細(xì)胞、組織或器官。當(dāng)在有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和/或分裂的條件下將它們放置在生長(zhǎng)培養(yǎng)液中時(shí)，細(xì)胞會(huì)在培養(yǎng)中擴(kuò)增，從而產(chǎn)生更大的細(xì)胞群。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)中擴(kuò)增時(shí)，有時(shí)通過細(xì)胞數(shù)目翻倍所需的時(shí)間量來測(cè)量細(xì)胞增殖率。這被稱為倍增時(shí)間。細(xì)胞系是由原代細(xì)胞培養(yǎng)物的一個(gè)或多個(gè)繼代培養(yǎng)形成的細(xì)胞群。每一輪傳代培養(yǎng)都被稱為傳代。當(dāng)繼代培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，它們被稱為已傳代的。細(xì)胞的特定群體或細(xì)胞系，有時(shí)由它已被傳代的次數(shù)來指稱或表征。例如，一個(gè)已傳代了十次的培養(yǎng)細(xì)胞群可以指p10培養(yǎng)物。首次培養(yǎng)物(即，在將細(xì)胞從組織分離后的第一次培養(yǎng)物)被指定為p0。在第一次傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞被描述為次代培養(yǎng)物(p1或第1代)。第二次傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞成為第三培養(yǎng)物(p2或第2代)，以此類推。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，在傳代期間可能有許多次群體倍增；因此培養(yǎng)物的群體倍增數(shù)目大于傳代數(shù)目。細(xì)胞在各次傳代之間的期間中的擴(kuò)增(即群體倍增數(shù)目)取決于許多因素，包括但不限于接種密度、基底、培養(yǎng)基、生長(zhǎng)條件和各次傳代之間的時(shí)間。術(shù)語(yǔ)生長(zhǎng)培養(yǎng)基一般指足以培養(yǎng)ppdc的培養(yǎng)基。具體地，用于培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)胞的一個(gè)目前優(yōu)選的培養(yǎng)基包括dulbecco改良的必需培養(yǎng)基(本文另縮寫為dmem)。特別優(yōu)選的是dmem-低葡萄糖(本文也為dmem-lg)(invitrogen，carlsbad，calif.)。dmem-低葡萄糖優(yōu)選地補(bǔ)充有15％(v/v)胎牛血清(例如，特級(jí)胎牛血清，hyclone，loganutah)、抗生素/抗真菌劑((優(yōu)選50-100單位/毫升青霉素，50-100微克/毫升鏈霉素和0-0.25微克/毫升兩性霉素b；invitrogen，carlsbad，calif.))和0.001％(v/v)2-巰基乙醇(sigma，st.louismo.)。如下文實(shí)施例中所用，生長(zhǎng)培養(yǎng)基是指含有15％胎牛血清和抗生素/抗真菌劑(當(dāng)包括青霉素/鏈霉素時(shí)，分別優(yōu)選50u/ml和50微克/ml；當(dāng)使用青霉素/鏈霉素/兩性霉素時(shí)，分別優(yōu)選100u/ml、100微克/ml和0.25微克/ml)的dmem-低葡萄糖。在一些情況下，使用不同的生長(zhǎng)培養(yǎng)液，或提供不同的補(bǔ)充物，并且這在文中通常表明向生長(zhǎng)培養(yǎng)液添加補(bǔ)充物。條件培養(yǎng)液是已在其中培養(yǎng)特定的細(xì)胞或細(xì)胞群，然后被去除的培養(yǎng)液。當(dāng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，它們可分泌細(xì)胞的因子，所述細(xì)胞的因子可向其它細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)支持。此類營(yíng)養(yǎng)因子包括但不限于激素、細(xì)胞因子、胞外基質(zhì)(ecm)、蛋白質(zhì)、囊泡、抗體和顆粒。包含所述細(xì)胞的因子的培養(yǎng)基是條件培養(yǎng)基。一般來講，營(yíng)養(yǎng)因子定義為促進(jìn)細(xì)胞存活、生長(zhǎng)、分化、增殖和/或成熟，或刺激細(xì)胞活性提高的物質(zhì)。細(xì)胞間經(jīng)由營(yíng)養(yǎng)因子的相互作用可發(fā)生于不同類型的細(xì)胞之間。細(xì)胞經(jīng)由營(yíng)養(yǎng)因子的相互作用基本上存在于所有的細(xì)胞類型中，并且是神經(jīng)細(xì)胞類型中尤為顯著的通訊方式。營(yíng)養(yǎng)因子還可以自分泌方式發(fā)揮作用，即，細(xì)胞可產(chǎn)生影響其自身存活、生長(zhǎng)、分化、增殖和/或成熟的營(yíng)養(yǎng)因子。當(dāng)提及培養(yǎng)的脊椎動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，術(shù)語(yǔ)衰老(也為復(fù)制性衰老或細(xì)胞衰老)是指可歸于有限細(xì)胞培養(yǎng)物的性質(zhì)；換言之，其不能生長(zhǎng)超出有限的群體倍增數(shù)(有時(shí)也稱為hayflick極限)。盡管首先使用成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞來描述細(xì)胞衰老，可在培養(yǎng)中連續(xù)生長(zhǎng)的大多數(shù)正常人細(xì)胞類型經(jīng)歷細(xì)胞衰老。不同細(xì)胞類型在體外的生命周期不同，但最大生命周期通常少于100次群體倍增(這是針對(duì)培養(yǎng)物中所有細(xì)胞變衰老且因此不能分離培養(yǎng)物的倍增數(shù))。衰老不取決于時(shí)序時(shí)間，而是由培養(yǎng)物已經(jīng)歷的細(xì)胞分裂、或群體倍增數(shù)來衡量。術(shù)語(yǔ)眼部、眼科和視覺在本文互換使用以定義“眼的、或關(guān)于眼、或與眼有關(guān)”。術(shù)語(yǔ)眼變性性病癥(或病變)是包含性術(shù)語(yǔ)，涵蓋眼部急性和慢性病癥、疾病或病變，包括眼部和腦部之間的神經(jīng)連接，涉及細(xì)胞損傷、變性或損失。眼變性性病癥可為年齡相關(guān)的，或者其可由損傷或創(chuàng)傷引起，或者其可與特定疾病或病變有關(guān)。急性眼變性性病癥包括但不限于影響眼的與細(xì)胞死亡或損害相關(guān)的病癥，包括由腦血管機(jī)能不全、局灶性或彌漫性腦創(chuàng)傷、彌漫性腦損傷、眼部感染或炎性病癥、視網(wǎng)膜撕裂或脫離、眼內(nèi)病變(挫傷穿入、壓迫、裂傷)或其它身體損傷(例如，物理或化學(xué)灼傷)引起的病癥。慢性眼變性性病癥(包括進(jìn)行性病癥)包括但不限于視網(wǎng)膜病及其它視網(wǎng)膜/黃斑病變，諸如色素性視網(wǎng)膜炎(rp)、年齡相關(guān)性黃斑變性(amd)、脈絡(luò)膜新生血管膜(cnvm)；視網(wǎng)膜病，諸如糖尿病性視網(wǎng)膜病變、阻塞性視網(wǎng)膜病、鐮狀紅細(xì)胞性視網(wǎng)膜病變和高血壓性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞、頸動(dòng)脈狹窄、視神經(jīng)病變諸如青光眼和相關(guān)綜合征；晶狀體和外眼病變，例如角膜緣干細(xì)胞缺損(lscd)，也稱為緣上皮細(xì)胞缺陷(lecd)，諸如發(fā)生于化學(xué)或熱損傷，steven-johnson綜合癥、接觸鏡片誘導(dǎo)的角膜病、眼部瘢痕性類天庖瘡、無虹膜或外胚層發(fā)育不良先天性疾病、以及多發(fā)性內(nèi)分泌缺乏相關(guān)的角膜炎。術(shù)語(yǔ)治療(或治療的)眼變性性病癥是指改善如本文所定義的眼變性性病癥的影響，或延遲、停止或逆轉(zhuǎn)眼變性性病癥的進(jìn)展、或延遲或預(yù)防眼變性性病癥的發(fā)作。術(shù)語(yǔ)有效量是指對(duì)產(chǎn)生預(yù)期結(jié)果有效的試劑或藥物組合物諸如生長(zhǎng)因子、分化劑、營(yíng)養(yǎng)因子、細(xì)胞群或其它試劑的濃度或量，所述預(yù)期結(jié)果包括細(xì)胞在體外或體內(nèi)的生長(zhǎng)和/或分化，或治療如本文所述的眼變性性病癥。就生長(zhǎng)因子而言，有效量可在約1納克/毫升至約1微克/毫升的范圍內(nèi)。就如施用于患者體內(nèi)的ppdc而言，有效量可在少至幾百或更少至多達(dá)幾百萬或更多的范圍內(nèi)。在特定的實(shí)施方案中，有效量可在103至1111的范圍內(nèi)，更具體地，至少約104個(gè)細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解，施用的細(xì)胞數(shù)量將根椐將要治療的失調(diào)的特性改變，在醫(yī)學(xué)生物學(xué)家熟悉的其它因素中，所述特性包括但不限于將要治療的范圍或總體積/表面積、以及施用至將要治療的區(qū)域的位置部位近側(cè)。術(shù)語(yǔ)有效期(或時(shí)間)和有效條件是指為實(shí)現(xiàn)預(yù)期效果的一段時(shí)間或其它可控條件(如針對(duì)體外方法的溫度、濕度)、必要的或優(yōu)選的藥劑或藥物組合物。術(shù)語(yǔ)患者或受治療者是指用藥物組合物或根據(jù)本文所述方法治療的動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人。術(shù)語(yǔ)藥學(xué)上可接受的載體(或介質(zhì))可與術(shù)語(yǔ)生物相容性載體或介質(zhì)互換使用，是指試劑、細(xì)胞、化合物、材料、組合物和/或劑型，它們不僅與將要治療施用的細(xì)胞和其它藥劑相容，而且適于在合理醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)以與合理效/險(xiǎn)比相當(dāng)量與人和動(dòng)物的組織接觸使用時(shí)無過度毒性、刺激、過敏反應(yīng)或其它并發(fā)癥。關(guān)于細(xì)胞替代療法，本文使用了幾個(gè)術(shù)語(yǔ)。術(shù)語(yǔ)自體轉(zhuǎn)移、自體移植、自體移接等等指其中細(xì)胞供體也是細(xì)胞替代療法的受體的治療。術(shù)語(yǔ)異體轉(zhuǎn)移、異體移植、異體移接等是指其中細(xì)胞供體與細(xì)胞替代療法受體的物種相同，但并非同一個(gè)體的治療。在其中供體的細(xì)胞和已與受體組織相容性匹配的細(xì)胞移植有時(shí)被稱為同基因轉(zhuǎn)移。術(shù)語(yǔ)異種轉(zhuǎn)移、異種移植、異種移接等等指其中細(xì)胞供體與細(xì)胞替代療法受體的物種不同的治療。如本文所用，移植是指將自體、或異體供體細(xì)胞替代療法引入受體中。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“約”在涉及可測(cè)量值諸如量、時(shí)距等等時(shí)，意指涵蓋與指定值±20％和±0.1％，優(yōu)選±20％或±10％，更優(yōu)選地±5％，甚至更優(yōu)選地±1％，還更優(yōu)選地±0.1％的變化，因?yàn)榇祟愖兓m合執(zhí)行本發(fā)明所公開的方法。描述眼變性性病癥涵蓋具有不同病因的急性、慢性和進(jìn)行性病變和疾病，作為共同特征具有眼部細(xì)胞的特定或易損群體的功能障礙或損失。該共性允許開發(fā)出用于修復(fù)或再生易損、受損或損失眼部組織的類似治療方法，其中之一為基于細(xì)胞的治療。所開發(fā)的用于眼變性性病癥的細(xì)胞治療受限于相對(duì)較少類型的干細(xì)胞或祖細(xì)胞，包括眼自身衍生的干細(xì)胞(例如，視網(wǎng)膜和角膜干細(xì)胞)、胚胎干細(xì)胞和少數(shù)類型的成體干細(xì)胞或祖細(xì)胞(例如，神經(jīng)、粘膜上皮和骨髓干細(xì)胞)。出于該目的，從產(chǎn)后臍帶和胎盤中分離的細(xì)胞已被鑒定為祖細(xì)胞的重要新來源(us2005-0037491和us2010-0272803)。此外，由產(chǎn)后胎盤和臍帶組織中分離的細(xì)胞產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基為治療眼變性性病癥提供另一種新來源。因此，在本文所述的各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于用于修復(fù)和再生眼部組織的方法和組合物(包括藥物組合物)，其使用得自產(chǎn)后組織中所分離的祖細(xì)胞和細(xì)胞群的條件培養(yǎng)基。本發(fā)明適用于眼變性性病癥，但預(yù)期特別適用于難以或無法實(shí)現(xiàn)治療或治愈的多種眼部病變。這些無限制地包括年齡相關(guān)性黃斑變性、色素性視網(wǎng)膜炎、糖尿病及其它視網(wǎng)膜病。預(yù)期根據(jù)在本領(lǐng)域中已知的任何方法的來源于祖細(xì)胞(例如從產(chǎn)后臍帶或胎盤中分離的細(xì)胞)的條件培養(yǎng)基適用于本發(fā)明。然而，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明優(yōu)選地根據(jù)以下所列方法使用來源于如上定義的臍帶組織衍生的細(xì)胞(hutc)或胎盤組織衍生的細(xì)胞(pdc)的條件培養(yǎng)基，所述細(xì)胞來源于顯示基本上不含血的臍帶組織或胎盤。hutc或pdc能夠在培養(yǎng)中擴(kuò)增并具有分化成其它表型的細(xì)胞的潛力。某些實(shí)施方案的特征在于由此類祖細(xì)胞制得的條件培養(yǎng)基，包含條件培養(yǎng)基的組合物，以及使用諸如藥物組合物的組合物治療患有急性或慢性眼變性性病癥的患者的方法。本發(fā)明的產(chǎn)后衍生細(xì)胞特征在于：其在培養(yǎng)中的生長(zhǎng)特性，其細(xì)胞表面標(biāo)志物，其基因表達(dá)，其產(chǎn)生某些生化營(yíng)養(yǎng)因子的能力，以及其免疫學(xué)特性。來源于產(chǎn)后衍生細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的特征在于細(xì)胞分泌的營(yíng)養(yǎng)因子和橋分子。祖細(xì)胞的制備本文描述了在本發(fā)明的組合物和方法中使用的細(xì)胞、細(xì)胞群和制劑(包含細(xì)胞裂解液、條件培養(yǎng)基等等)，并且詳見于美國(guó)專利7,524,489和7,510,873以及美國(guó)公布申請(qǐng)2005/0058634，二者均以引用方式并入本文。根據(jù)方法，哺乳動(dòng)物臍帶和胎盤是在足月或者早產(chǎn)妊娠時(shí)或不久之后(例如，分娩后排出之后)回收的。產(chǎn)后組織可在無菌容器(諸如燒瓶、燒杯、培養(yǎng)皿或袋)中從分娩地點(diǎn)運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室。該容器可具有溶液或培養(yǎng)基，包括但不限于例如鹽溶液，諸如dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基(dmem)或磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)，或用于運(yùn)輸用于移植的器官的任何溶液，諸如威斯康星大學(xué)溶液(universityofwisconsinsolution)或全氟化合物溶液?？蓪⒁环N或多種抗生素和/或抗真菌劑(諸如但不限于青霉素、鏈霉素、兩性霉素b、慶大霉素和制霉菌素)添加到培養(yǎng)基或緩沖液中。可用抗凝劑溶液諸如含肝素溶液沖洗產(chǎn)后組織。優(yōu)選在提取ppdc之前將組織保持在約4-10℃下。甚至更優(yōu)選在提取ppdc之前，組織不進(jìn)行冷凍。ppdc的分離優(yōu)選在無菌環(huán)境中發(fā)生。臍帶可通過本領(lǐng)域已知的方法從胎盤分離。另選地，臍帶和胎盤無需分離即可使用。血液和碎片優(yōu)選在ppdc分離前從產(chǎn)后組織中去除。例如，可用緩沖液溶液(例如但不限于磷酸鹽緩沖鹽水溶液)洗滌產(chǎn)后組織。洗滌緩沖液也可包含一種或多種抗真菌劑和/或抗生素，例如但不限于青霉素、鏈霉素、兩性霉素b、慶大霉素和制霉菌素。產(chǎn)后組織包括通過機(jī)械力分解的整個(gè)胎盤或臍帶或其片段或部分(切斷力或剪切力)。在目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離工序也利用酶消化過程。許多酶是本領(lǐng)域已知的用于從復(fù)合組織基質(zhì)分離個(gè)體細(xì)胞以有利于在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)。涵蓋弱消化的(例如脫氧核糖核酸酶和中性蛋白酶、分散酶)至強(qiáng)消化的(例如木瓜蛋白酶和胰蛋白酶)范圍的此類酶可商購(gòu)獲得。與本文相容的酶的不詳盡列表包括溶解粘液的酶活性材料、金屬蛋白酶、中性蛋白酶、絲氨酸蛋白酶(諸如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或彈性蛋白酶)和脫氧核糖核酸酶。目前優(yōu)選的是選自金屬蛋白酶、中性蛋白酶和溶解粘液的活性材料的酶活性材料。例如，已知膠原酶用于從組織分離多種細(xì)胞。脫氧核糖核酸酶可消化單鏈dna并且可在分離期間使細(xì)胞凝聚降到最低。優(yōu)選的方法包括采用例如膠原酶和分散酶、或膠原酶、分散酶和透明質(zhì)酸酶進(jìn)行酶處理，并且提供在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中在分離步驟中使用膠原酶和中性蛋白酶分散酶的混合物的此類方法。更優(yōu)選的是采用在來自溶組織梭菌(clostridiumhistolyticum)的至少一種膠原酶，和蛋白酶活性、分散酶和嗜熱菌蛋白酶中的任一種的存在下的消化的那些方法。還更優(yōu)選的方法是采用膠原酶和分散酶的酶活性兩者進(jìn)行消化。也優(yōu)選包括利用除了膠原酶和分散酶活性之外的透明質(zhì)酸酶活性消化的方法。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，本領(lǐng)域已知用于從多種組織來源中分離細(xì)胞的多種此類酶處理。例如，liberasetmblendzyme3(roche)系列酶組合適用于本發(fā)明方法。酶的其它來源是已知的，并且技術(shù)人員還可從它們天然來源直接獲得此類酶。技術(shù)人員也擁有齊全的設(shè)備，可評(píng)價(jià)新的或附加的酶或酶組合在分離本發(fā)明細(xì)胞方面的用途。優(yōu)選的酶處理為0.5、1、1.5或2小時(shí)長(zhǎng)或更長(zhǎng)。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，解離步驟的酶處理期間在37℃下溫育組織。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，將產(chǎn)后組織分成包含組織的多個(gè)部分(例如諸如新生兒、新生兒/母體、以及胎盤的母體部分)的區(qū)段。然后，根據(jù)本文所述的方法通過機(jī)械和/或酶離解來離解分離的部分。新生兒或母體譜系細(xì)胞可通過本領(lǐng)域已知的任何方法(例如，通過針對(duì)y染色體的核型分析或原位雜交)來鑒定。分離的細(xì)胞或ppdc從其中長(zhǎng)出的產(chǎn)后組織可用于引發(fā)、或接種細(xì)胞培養(yǎng)物。將分離的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無菌組織培養(yǎng)容器中，所述無菌組織培養(yǎng)容器未包被或包被有細(xì)胞外基質(zhì)或配體，諸如層粘連蛋白、膠原(天然、變性或交聯(lián))、明膠、纖粘蛋白和其它細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。將ppdc培養(yǎng)于能夠維持細(xì)胞生長(zhǎng)的任何培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基例如但不限于dmem(高或低葡萄糖)、高級(jí)dmem、dmem/mcdb201、eagle基本培養(yǎng)基、ham的f10培養(yǎng)基(f10)、ham的f-12培養(yǎng)基(f12)、iscove改良的dulbecco培養(yǎng)基、間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(mscgm)、dmem/f12、rpmi1640和cellgrofreetm。培養(yǎng)基可補(bǔ)充有一種或多種單獨(dú)或組合使用的組分，包括例如胎牛血清(fbs)，優(yōu)選約2-15％(v/v)；馬血清(es)；人血清(hs)；β-巰基乙醇(bme或2-me)，優(yōu)選約0.001％(v/v)；一種或多種生長(zhǎng)因子，例如血小板衍生生長(zhǎng)因子(pdgf)、表皮生長(zhǎng)因子(egf)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fgf)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(igf-1)、白細(xì)胞抑制因子(lif)和紅細(xì)胞生成素；氨基酸，包括l-纈氨酸；以及一種或多種例如控制微生物污染的抗生素和/或抗真菌劑，諸如青霉素g、硫酸鏈霉素、兩性霉素b、慶大霉素和制霉菌素。培養(yǎng)基優(yōu)選包含生長(zhǎng)培養(yǎng)基(dmem-低葡萄糖、血清、bme和抗生素)。將細(xì)胞以允許細(xì)胞生長(zhǎng)的密度接種在培養(yǎng)容器中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞在占空氣約0至約5體積％的co2下培養(yǎng)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞在占空氣約2至約25％的o2下，優(yōu)選占空氣約5至約20％的o2下培養(yǎng)。細(xì)胞優(yōu)選在約25至約40℃下培養(yǎng)，還更優(yōu)選在37℃下培養(yǎng)。細(xì)胞優(yōu)選在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基可以是靜止的，也可以例如用生物反應(yīng)器攪動(dòng)。ppdc優(yōu)選在低氧化應(yīng)激下生長(zhǎng)(例如，伴隨谷胱甘肽、維生素c、過氧化氫酶、維生素e、n-乙酰半胱氨酸的添加)。如本文所用，“低氧化應(yīng)激”指對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞沒有或有較小自由基損傷的條件。用于選擇最適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基、培養(yǎng)基制劑和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的方法是本領(lǐng)域?yàn)槿藗兯熘?，并且在多種來源中描述，包括doyle等人(編輯)，1995，cell&tissueculture：laboratoryprocedures，johnwiley&sons，chichester；以及ho和wang(編輯)，1991，animalcellbioreactors，butterworth-heinemann，boston，所述參考文獻(xiàn)以引用的方式并入本文。在將分離的細(xì)胞或組織片段培養(yǎng)足夠時(shí)間段后，ppdc將由于來自產(chǎn)后組織的遷移或細(xì)胞分裂或兩者而長(zhǎng)出。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，將ppdc傳代或取出至分開的培養(yǎng)容器中，所述培養(yǎng)容器含有與初始使用的培養(yǎng)基相同或不同類型的新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞群可在所述培養(yǎng)容器中以有絲分裂方式擴(kuò)增。本發(fā)明的細(xì)胞可在0代和衰老之間的任何時(shí)間點(diǎn)使用。細(xì)胞優(yōu)選傳代約3至約25次，更優(yōu)選傳代約4至約12次，并且優(yōu)選傳代10或11次?？蛇M(jìn)行克隆和/或亞克隆以確認(rèn)已分離出無性細(xì)胞群。在本發(fā)明的一些方面，將存在于產(chǎn)后組織中的不同細(xì)胞類型分級(jí)成可從其中分離ppdc的亞群。這可使用用于細(xì)胞分離的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)完成，包括但不限于使用酶處理將產(chǎn)后組織分解為其組分細(xì)胞然后克隆和選擇特定細(xì)胞類型，例如但不限于基于形態(tài)標(biāo)記和/或生化標(biāo)記選擇；選擇生長(zhǎng)的期望細(xì)胞(正選擇)，選擇性破壞不需要的細(xì)胞(負(fù)選擇)；用例如大豆凝集素根據(jù)混合群中不同的細(xì)胞凝集性進(jìn)行分離；凍融方法；利用混合群中的不同的細(xì)胞粘附性；過濾；常規(guī)離心和區(qū)帶離心；離心淘析(逆流離心淘析)；單位重力分離；逆流分布；電泳；以及熒光激活細(xì)胞分選(facs)。關(guān)于克隆選擇和細(xì)胞分離技術(shù)的綜述，參見freshney，1994，cultureofanimalcells：amanualofbasictechniques，第3版，wiley-liss，inc.，newyork，所述參考文獻(xiàn)以引用方式并入本文。更換培養(yǎng)液是必要的，例如，通過小心地從培養(yǎng)皿中抽出培養(yǎng)液(例如用移液器)并且補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液。繼續(xù)溫育直至培養(yǎng)皿中積聚足夠數(shù)量或密度的細(xì)胞?？扇コ纪庵踩虢M織部分，并且剩余細(xì)胞使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或使用細(xì)胞刮刀進(jìn)行胰蛋白酶消化。胰蛋白酶化之后，收集細(xì)胞，移至新鮮培養(yǎng)基中并如上溫育。在一些實(shí)施方案中，胰蛋白酶化后約24小時(shí)將培養(yǎng)基更換至少一次以去除任何漂浮的細(xì)胞。培養(yǎng)物中剩余的細(xì)胞視為ppdc。可將ppdc冷凍保存。因此，在下文更詳細(xì)地描述的優(yōu)選實(shí)施方案中，用于自體轉(zhuǎn)移(用于母親或孩子)的ppdc可源于孩子出生后的適當(dāng)產(chǎn)后組織，然后冷凍保存以便可在它們以后需要移植的情況下可用。祖細(xì)胞的特征本發(fā)明的祖細(xì)胞如ppdc的特征可在于例如生長(zhǎng)特性(例如，群體倍增能力、倍增時(shí)間、傳代至衰老)、染色體核型分析(例如，正常核型；母本或新生譜系)、流式細(xì)胞術(shù)(例如，facs分析)、免疫組織化學(xué)法和/或免疫細(xì)胞化學(xué)法(例如，用于檢測(cè)表位)、基因表達(dá)譜(例如，基因芯片陣列；聚合酶鏈反應(yīng)(例如，逆轉(zhuǎn)錄pcr、實(shí)時(shí)pcr和常規(guī)pcr)、蛋白質(zhì)陣列、蛋白質(zhì)分泌(例如，通過血漿凝血測(cè)定或分析pdc-條件培養(yǎng)基，如通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa))、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(例如，作為刺激的pbmc的量度)和/或現(xiàn)有技術(shù)已知的其它方法。來源于臍組織的ppdc的示例于2004年6月10日保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc，10801universityboulevard，manassas，va，20110)并且被指定為如下atcc登錄號(hào)：(1)菌株名umb022803(p7)指定登錄號(hào)pta-6067；并且(2)菌株名umb022803(p17)指定登錄號(hào)pta-6068。來源于胎盤組織的ppdc的示例保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc，manassas，va.)并且被指定為如下atcc登錄號(hào)：(1)菌株名pla071003(p8)保藏于2004年6月15日并指定登錄號(hào)pta-6074；(2)菌株名pla071003(p11)保藏于2004年6月15日并且指定登錄號(hào)pta-6075；并且(3)菌株名pla071003(p16)保藏于2004年6月16日并指定登錄號(hào)pta-6079。在各種實(shí)施方案中，ppdc具有下列一個(gè)或多個(gè)生長(zhǎng)特征：(1)其在培養(yǎng)中需要l-纈氨酸用于生長(zhǎng)；(2)其能夠在包含約5％至至少約20％氧氣的氣氛中生長(zhǎng)；(3)在達(dá)到衰老之前，其在培養(yǎng)中具有至少約40次倍增的潛力；以及(4)其在經(jīng)包被或未經(jīng)包被的組織培養(yǎng)容器上貼附和擴(kuò)增，其中經(jīng)包被的組織培養(yǎng)容器包含明膠、層粘連蛋白、膠原、多聚鳥氨酸、玻連蛋白或纖連蛋白的被覆物。在某些實(shí)施方案中，ppdc具有在細(xì)胞傳代時(shí)保持的正常核型。染色體核型分析特別可用于從來源于胎盤的母本細(xì)胞鑒定和區(qū)分新生兒細(xì)胞。染色體核型分析的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用且已知的。在其它實(shí)施方案中，ppdc的特征可在于產(chǎn)生某些蛋白質(zhì)，包括：(1)產(chǎn)生波形蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白中的至少一種；以及(2)產(chǎn)生cd10、cd13、cd44、cd73、cd90、pdgfr-a、pd-l2和hla-a、b、c細(xì)胞表面標(biāo)志物中的至少一種，如由流式細(xì)胞術(shù)所檢測(cè)。在其它實(shí)施方案中，ppdc的特征可在于不產(chǎn)生cd31、cd34、cd45、cd80、cd86、cd117、cd141、cd178、b7-h2、hla-g和hla-dr、dp、dq細(xì)胞表面標(biāo)志物中的至少一種，如由流式細(xì)胞術(shù)所檢測(cè)。特別優(yōu)選的是產(chǎn)生波形蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，ppdc的特征可在于相對(duì)于為成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或髂嵴骨髓細(xì)胞的人細(xì)胞，編碼以下項(xiàng)中至少一種的基因的基因表達(dá)是增加的：白介素8；漿膜蛋白1；或趨化因子(c--x--c基序)配體1(黑素瘤生長(zhǎng)刺激活性，α)；趨化因子(c--x--c基序)配體6(粒細(xì)胞趨化蛋白2)；趨化因子(c--x--c基序)配體3；腫瘤壞死因子，α-誘導(dǎo)蛋白3；c-型凝集素超家族成員2；腎母細(xì)胞瘤1；乙醛脫氫酶1家族成員a2；腎素；氧化低密度脂蛋白受體1；智人克隆image：4179671；蛋白激酶cζ；假定蛋白dkfzp564f013；在卵巢癌中下調(diào)的1；以及來自克隆dkfzp547k1113的智人基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，來源于臍帶組織的ppdc的特征可在于相對(duì)于為成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或髂嵴骨髓細(xì)胞的人細(xì)胞，編碼以下項(xiàng)中至少一種的基因的基因表達(dá)是增加的：白介素8；漿膜蛋白1；或趨化因子(c--x--c基序)配體3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，來源于胎盤組織的ppdc的特征可在于相對(duì)于為成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或髂嵴骨髓細(xì)胞的人細(xì)胞，編碼腎素或氧化低密度脂蛋白受體1中至少一種的基因的基因表達(dá)是增加的。在其它實(shí)施方案中，ppdc的特征可在于相對(duì)于為成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或髂嵴骨髓細(xì)胞的人細(xì)胞，編碼以下項(xiàng)中至少一種的基因的基因表達(dá)是減少的：矮小同源盒2；熱休克27kda蛋白2；趨化因子(c--x--c基序)配體12(基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1)；彈性蛋白(主動(dòng)脈瓣上狹窄，威廉斯-博伊倫綜合征)；智人mrna；cdnadkfzp586m2022(來自克隆dkfzp586m2022)；間充質(zhì)同源盒2(生長(zhǎng)終止特異性同源盒)；sineoculis同源盒同源物1(果蠅屬)；晶狀體蛋白，αb；形態(tài)發(fā)生紊亂關(guān)聯(lián)激活因子2；dkfzp586b2420蛋白；類似于neuralin1；四連接素(纖溶酶原結(jié)合蛋白)；src同源三(sh3)和富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域；膽固醇25-羥化酶；runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3；白介素11受體，α；前膠原c-內(nèi)肽酶增強(qiáng)子；卷曲同源物7(果蠅屬)；假定基因bc008967；膠原，viii型，α1；腱生蛋白c(hexabrachion)；易洛魁族同源盒蛋白5；膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)輔助蛋白；整聯(lián)蛋白，β8；突觸小泡糖蛋白2；成神經(jīng)細(xì)胞瘤，抑制瘤變蛋白1；胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2，36kda；智人cdnaflj12280fis，克隆mamma1001744；細(xì)胞因子受體樣因子1；鉀中間體/小電導(dǎo)鈣活化通道，亞家族n，成員4；整聯(lián)蛋白，β7；具有pdz結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子(taz)；sineoculis同源盒同源物2(果蠅屬)；kiaai034蛋白；囊泡相關(guān)膜蛋白5(肌短蛋白)；含egf腓骨蛋白樣細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1；早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子3；遠(yuǎn)端缺失同源盒5；假定蛋白flj20373；醛酮還原酶家族1，成員c3(3-α羥基類固醇脫氫酶，ii型)；雙糖鏈蛋白聚糖；具有pdz結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子(taz)；纖粘蛋白1；前腦啡肽；整聯(lián)蛋白，β樣1(具有egf樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域)；智人mrna全長(zhǎng)插入cdna克隆euroimage1968422；epha3；kiaa0367蛋白；尿鈉排泄肽受體c/鳥苷酸環(huán)化酶c(利尿鈉排泄肽受體c)；假定蛋白flj14054；智人mrna；cdnadkfzp564b222(來自克隆dkfzp564b222)；bcl2/腺病毒e1b19kda相互作用蛋白3樣；ae結(jié)合蛋白1；以及細(xì)胞色素c氧化酶viia亞基多肽1(肌肉)。在其它實(shí)施方案中，ppdc的特征可在于分泌選自mfg-e8、gas6、tsp-1和tsp-2的橋分子。此外，來源于臍帶組織的ppdc的特征可在于分泌mcp-1、il-6、il-8、gcp-2、hgf、kgf、fgf、hb-egf、bdnf、tpo、mip1b、i309、rantes、mdc和timp1中的至少一種。在一些實(shí)施方案中，來源于臍帶組織的ppdc的特征可在于不分泌tgf-β2、ang2、pdgfbb、mip1a和vegf中的至少一種，如由elisa所檢測(cè)。在另選的實(shí)施方案中，來源于臍帶組織的ppdc的特征可在于：分泌mcp-1、il-6、il-8、gcp-2、hgf、kgf、hb-egf、bdnf、tpo、mip1a、rantes和timp1中的至少一種，以及不分泌tgf-β2、mip1b、ang2、pdgfbb、fgf和vegf中的至少一種，如由elisa所檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ppdc不表達(dá)htert或端粒酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞具有上文列出的生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)/表面標(biāo)志物產(chǎn)生、基因表達(dá)或物質(zhì)分泌特征中的兩種或更多種。更優(yōu)選的是包含特征中的三種、四種、或五種或更多種的那些細(xì)胞。還更優(yōu)選的是包含特征中的六種、七種、或八種或更多種的ppdc。目前還更優(yōu)選的是包含上述特征中的所有的那些細(xì)胞。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞從基本上不含血的人臍帶組織中分離，所述細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中擴(kuò)增，不產(chǎn)生cd117或cd45，并且不表達(dá)htert或端粒酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞不表達(dá)cd117和cd45，并且任選地也不表達(dá)htert和端粒酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞不表達(dá)htert和端粒酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞從基本上不含血的人臍帶組織中分離，能夠在培養(yǎng)中擴(kuò)增，不產(chǎn)生cd117或cd45，并且不表達(dá)htert或端粒酶，并且下列一種或多種特征：表達(dá)cd10、cd13、cd44、cd73和cd90；不表達(dá)cd31或cd34；相對(duì)于人成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞或髂嵴骨髓細(xì)胞，表達(dá)白介素8或漿膜蛋白1的水平提高；并且具有分化的潛力。在目前優(yōu)選與本發(fā)明多個(gè)方面一起使用的細(xì)胞中有具有上述特征的產(chǎn)后細(xì)胞，并且更具體地是這樣的細(xì)胞：其中細(xì)胞具有正常核型并隨傳代進(jìn)行，保持正常核型，并且進(jìn)一步地，其中細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志物cd10、cd13、cd44、cd73、cd90、pdgfr-α和hla-a、b、c中的每一種，其中細(xì)胞產(chǎn)生免疫學(xué)可檢測(cè)的對(duì)應(yīng)于所列標(biāo)志物的蛋白質(zhì)。還更優(yōu)選的是這樣的細(xì)胞：其除了前述之外，不產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于標(biāo)志物cd31、cd34、cd45、cd117、cd141或hla-dr、dp、dq中的任何一種的蛋白，如由流式細(xì)胞術(shù)所檢測(cè)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞不表達(dá)htert或端粒酶。某些具有沿產(chǎn)生各種表型的細(xì)胞譜系方向分化的潛力的細(xì)胞是不穩(wěn)定的，并且因此可自發(fā)分化。目前本發(fā)明優(yōu)選使用例如不沿神經(jīng)譜系方向自發(fā)分化的細(xì)胞。當(dāng)優(yōu)選的細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，對(duì)于它們表面上產(chǎn)生的細(xì)胞標(biāo)志物而言，并且對(duì)于多種基因的表達(dá)模式而言，是基本上穩(wěn)定的，例如，如使用affymetrixgenechip測(cè)定。細(xì)胞在傳代時(shí)，經(jīng)歷多次群體倍增后，例如在它們表面標(biāo)志物特性方面仍然保持基本恒定。然而，ppdc的一個(gè)特征在于可通過使其經(jīng)受誘導(dǎo)分化的細(xì)胞培養(yǎng)條件而將其有意誘導(dǎo)分化成各種譜系表型。在用于治療某些眼變性性病癥中，可使用在本領(lǐng)域中已知的一種或多種方法將ppdc誘導(dǎo)分化成神經(jīng)表型。例如，如本文舉例說明，可將ppdc鋪到經(jīng)層粘連蛋白包被的燒瓶的neurobasal-a培養(yǎng)基(invitrogen，carlsbad，calif.)中，所述neurobasal-a培養(yǎng)基包含b27(b27補(bǔ)充劑，invitrogen)、l-谷氨酰胺和青霉素/鏈霉素，該種組合在本文稱為神經(jīng)祖細(xì)胞擴(kuò)增(npe)培養(yǎng)基。npe培養(yǎng)基可進(jìn)一步補(bǔ)充有bfgf和/或egf。另選地，可通過如下方式在體外誘導(dǎo)分化ppdc：(1)將ppdc與神經(jīng)祖細(xì)胞共培養(yǎng)；或者(2)使ppdc在神經(jīng)祖細(xì)胞條件培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。ppdc分化成神經(jīng)表型可由具有延伸突起的兩極細(xì)胞形態(tài)示出。誘導(dǎo)的細(xì)胞群可對(duì)巢蛋白的存在呈染色陽(yáng)性。分化的ppdc可通過檢測(cè)巢蛋白、tuj1(biii微管蛋白)、gfap、酪氨酸羥化酶、gaba，04和/或mbp進(jìn)行評(píng)估。在一些實(shí)施方案中，ppdc表現(xiàn)出能夠形成三維體特征的神經(jīng)元干細(xì)胞形成神經(jīng)球。細(xì)胞群本發(fā)明另一個(gè)方面的特征為祖細(xì)胞例如產(chǎn)后衍生細(xì)胞群。產(chǎn)后衍生細(xì)胞可從胎盤或臍組織中分離。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞群包含上述ppdc，并且這些細(xì)胞群在下面部分有所描述。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞群是異質(zhì)的。本發(fā)明的異質(zhì)細(xì)胞群可包含至少約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的細(xì)胞。本發(fā)明的異質(zhì)細(xì)胞群還可包含祖細(xì)胞(產(chǎn)后衍生細(xì)胞)或其它祖細(xì)胞，諸如上皮或神經(jīng)祖細(xì)胞，或者其還可包含完全分化的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述群體是基本上同質(zhì)的，即基本上僅包含ppdc(優(yōu)選至少約96％、97％、98％、99％或更多細(xì)胞)。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞群是同質(zhì)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的同質(zhì)細(xì)胞群可包含臍或胎盤衍生的細(xì)胞。臍衍生的細(xì)胞的同質(zhì)群體優(yōu)選地不含母體譜系的細(xì)胞。胎盤衍生的細(xì)胞的同質(zhì)群體可為新生兒或母體譜系。同質(zhì)細(xì)胞群可通過本領(lǐng)域已知的任何方法實(shí)現(xiàn)，例如通過細(xì)胞分選(例如流式細(xì)胞術(shù))或通過根據(jù)已知的方法的無性擴(kuò)增。因此，優(yōu)選的同質(zhì)ppdc群體可包含產(chǎn)后衍生細(xì)胞的克隆細(xì)胞系。當(dāng)分離具有高度期望功能的細(xì)胞克隆時(shí)，此類群體是特別有用的。本文還提供了在一種或多種因子的存在下，或在刺激干細(xì)胞沿期望途徑(例如神經(jīng)、上皮)分化的條件下孵育的細(xì)胞群。此類因子是本領(lǐng)域已知的，并且技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到合適的分化條件的確定可用常規(guī)實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)。此類條件優(yōu)化可通過統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析來實(shí)現(xiàn)，例如響應(yīng)面分析法允許同時(shí)優(yōu)化例如在生物培養(yǎng)中的多個(gè)變量。目前優(yōu)選的因子包括但不限于因子諸如生長(zhǎng)因子或營(yíng)養(yǎng)因子、脫甲基化劑、與神經(jīng)或上皮譜系細(xì)胞的共培養(yǎng)物或在神經(jīng)或上皮譜系細(xì)胞條件培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物、以及現(xiàn)有技術(shù)已知刺激干細(xì)胞沿這些途徑分化的其它條件(用于神經(jīng)分化的因子，參見例如lang，k.j.d.等人，2004，j.neurosci.res.76：184-192；johe，k.k.等人，1996，genesdevel.10：3129-3140；gottleib，d.，2002，ann.rev.neurosci.25：381-407)。條件培養(yǎng)基在一個(gè)方面，本發(fā)明提供得自培養(yǎng)的祖細(xì)胞，諸如產(chǎn)后衍生細(xì)胞，或如下所述在體外或體內(nèi)使用的其它祖細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。使用此類條件培養(yǎng)基使得能在患者內(nèi)異體地使用細(xì)胞分泌的有利營(yíng)養(yǎng)因子而無需引入可能引起排斥反應(yīng)或其它不良免疫學(xué)應(yīng)答的完整細(xì)胞?？赏ㄟ^在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞(例如細(xì)胞群)，然后從培養(yǎng)基中移除細(xì)胞來制備條件培養(yǎng)基。在某些實(shí)施方案中，產(chǎn)后細(xì)胞為utc或pdc，更優(yōu)選hutc。由如上所述細(xì)胞群制備的條件培養(yǎng)基可按原樣、進(jìn)一步濃縮(例如通過超濾或凍干、或甚至干燥)、部分純化、與本領(lǐng)域已知的藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合、或與其它化合物(諸如生物制品，例如藥學(xué)上有用的蛋白組合物)組合來使用。條件培養(yǎng)液可單獨(dú)在體外或體內(nèi)或例如與自體或同種活細(xì)胞一起使用。如果在體內(nèi)引入，可將條件培養(yǎng)液局部地引入到治療部位處，或引入到治療部位遠(yuǎn)側(cè)以向患者提供例如所需的細(xì)胞生長(zhǎng)或營(yíng)養(yǎng)因子。先前已展示人臍帶組織衍生的細(xì)胞提高視覺功能并改善視網(wǎng)膜變性(參見us2010/0272803)。也已證明產(chǎn)后衍生細(xì)胞可用于促進(jìn)感光細(xì)胞挽救并因而保留rcs模型中的感光細(xì)胞(參見us2010/0272803)。hutc經(jīng)視網(wǎng)膜下注入rcs大鼠眼中提高視敏度并改善視網(wǎng)膜變性。如本文所提供，制備hutc條件培養(yǎng)基的各種制劑并評(píng)估吞噬拯救行為。已發(fā)現(xiàn)接種密度和培養(yǎng)條件影響條件培養(yǎng)基的活性水平。對(duì)于含血清hutc(cm1)，將hutc以5,000個(gè)活細(xì)胞/cm2接種于t75細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶的hutc生長(zhǎng)培養(yǎng)基(dmem低葡萄糖+15％fbs+4mml-谷氨酰胺)中并培養(yǎng)24小時(shí)。將培養(yǎng)基替換為21ml的dmem/f12完全培養(yǎng)基(dmem：f12培養(yǎng)基+10％fbs+青霉素(50u/ml)/鏈霉素(50μg/ml))，將細(xì)胞再培養(yǎng)54小時(shí)，收集培養(yǎng)上層清液并在-70℃下冷凍(冷凍保存)。對(duì)于無血清培養(yǎng)基(無血清cm1)，在第2天為培養(yǎng)基補(bǔ)充21ml的dmem/f12無血清培養(yǎng)基(dmem：f12培養(yǎng)基+青霉素(50u/ml)/鏈霉素(50μg/ml))。含有或不含血清的cm1恢復(fù)吞噬活性(圖1a-1b和2)。另一種條件培養(yǎng)基(cm2)按與含血清cm1相同的過程制備，不同的是細(xì)胞在t225燒瓶中培養(yǎng)，每個(gè)燒瓶的培養(yǎng)基為63ml，并且培養(yǎng)基更換之后的孵育時(shí)間為48小時(shí)。然而，該培養(yǎng)基不具有活性(圖3a)。cm3采用與cm2相同的條件制備，但具有10,000個(gè)活細(xì)胞/cm2，并且刺激營(yíng)養(yǎng)不良rpe的吞噬作用(圖3b-3d)。在測(cè)試的條件中，發(fā)現(xiàn)cm2沒有活性(圖3a)。相比于cm1的54小時(shí)孵育時(shí)間，cm2具有縮短的48h孵育時(shí)間。cm3通過將細(xì)胞接種密度加倍來制備，其具有相比于cm2相同的培養(yǎng)基更換后的孵育時(shí)間，并且發(fā)現(xiàn)呈活性。因此，為獲得活性cm，初始細(xì)胞接種密度和培養(yǎng)基更換后的孵育時(shí)間是兩個(gè)重要條件。得自皇家外科醫(yī)學(xué)院(rcs)大鼠的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(rpe)因mertk基因突變而使視桿細(xì)胞外節(jié)盤膜(ros)的吞噬有缺陷。mertk是受體酪氨酸激酶(rtk)家族的成員并且認(rèn)為其在rpe吞噬中起作用。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bfgf)(fgfrtk的配體)示出誘導(dǎo)得自rcs大鼠的培養(yǎng)rpe細(xì)胞的吞噬能力(mclaren等人，febsletters，1997；412：21-29)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，hutc通過分泌激活rtk信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并增強(qiáng)其它吞噬相關(guān)受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的rtk配體來拯救營(yíng)養(yǎng)不良rpe的吞噬作用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，rtk配體bdnf、hb-egf、pdgf-dd、肝配蛋白a4、hgf和肝配蛋白b2對(duì)rcs營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞的吞噬具有拯救作用。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，bdnf、pdgf-dd和肝配蛋白b2具有積極拯救作用(參見圖5a，6a-6b和7a-7b)。非-rtk配體激活rtk的不同受體，并且不具有與rtk配體類似的對(duì)吞噬作用的影響(圖8a-8c和圖9)。已示出hutc分泌玻連蛋白、內(nèi)皮素-1、tgf-β1和il-6。玻連蛋白的受體包括αvβ3和αvβ5整聯(lián)蛋白。finnemann等人報(bào)道rpe細(xì)胞對(duì)ros的吞噬需要αvβ5整聯(lián)蛋白(finnemann等人1997，同上)。雖然hutccm增加了營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞的吞噬，但是內(nèi)皮素-1、tgf-β1或il-6(濃度200ng/ml)和玻連蛋白(各種濃度)卻對(duì)rcsrpe吞噬作用沒有影響(圖8a-8c，圖9)。經(jīng)條件培養(yǎng)基處理和未處理的營(yíng)養(yǎng)不良rpe的基因表達(dá)譜rna分析示出，hutc表達(dá)15個(gè)rtk亞族之內(nèi)rtk配體的多個(gè)基因(圖10和表1-1)。hutc也表達(dá)包括mfg-e8、gas6、蛋白質(zhì)s、tsp-1和tsp-2的橋分子的基因(表1-3)。rcsrpe表達(dá)18個(gè)rtk亞族的基因(表1-2)。在18個(gè)中有15個(gè)rtk亞族對(duì)應(yīng)于hutc中表達(dá)的rtk配體基因。rcsrpe還表達(dá)用于橋分子結(jié)合的受體基因，包括整聯(lián)蛋白αvβ3、αvβ5、ax1、tyro3、mertk和cd36(表1-4)。利用rna-seq后進(jìn)行信息數(shù)據(jù)分析，rcsrpe細(xì)胞和hutc兩者的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜示出rcsrpe細(xì)胞表達(dá)多個(gè)rtk基因，而hutc表達(dá)多個(gè)rtk配體的基因(表1-1至1-4和表2-1)。具體地，七個(gè)rtk亞族的rtk配體具有相對(duì)高的基因表達(dá)水平。這些配體包括bdnf(腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)和nt3(神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白3)-trk家族的配體，hgf(肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子)-met家族的配體，pdgf-dd(血小板衍生生長(zhǎng)因子d型)和pdgf-cc(血小板衍生生長(zhǎng)因子c型)-pdgf家族的配體，肝配蛋白-b2-eph家族的配體，hb-egf(肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子)-erbb家族的配體，gdnf(神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)-ret家族的配體，以及集聚蛋白-musk家族的配體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，bdnf、nt3、hgf和gdnf在hutc條件培養(yǎng)基中分泌，并且水平相比于得自正常人真皮成纖維細(xì)胞(nhdf)和arpe-19細(xì)胞的那些更高，如在elisa測(cè)定中所測(cè)定的那樣(圖11a-11c和11f)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，相比于nhdf或arpe-19，hutc分泌較低水平的pdgf-cc和pdgf-dd(圖11d，11e)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如在elisa測(cè)定中所測(cè)，肝配蛋白-b2和hb-egf并未在hutc、nhdf和arpe-19的條件培養(yǎng)基中檢測(cè)到。這些細(xì)胞不分泌這兩種蛋白質(zhì)，或者該水平低于elisa測(cè)定的檢出限。hutc、nhdf和arpe-19條件培養(yǎng)基中的集聚蛋白水平類似于對(duì)照培養(yǎng)基；在所有條件培養(yǎng)基樣本中檢出的集聚蛋白均可能來自于培養(yǎng)基?；趓csrpe細(xì)胞的以rna-seq為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜分析，在hutc條件培養(yǎng)基中分泌的橋分子和其它因子的水平進(jìn)一步展示出對(duì)吞噬作用并因而對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。如所顯示，rcsrpe細(xì)胞表達(dá)目前被鑒定識(shí)別凋亡細(xì)胞上“吞噬我”信號(hào)的許多受體的基因。這些受體包括清道夫受體(sr-a、lox-1、cd68、cd36、cd14)、整聯(lián)蛋白(αvβ3和αvβ5)、ax1和tyro3的受體酪氨酸激酶、lrp-1/cd91、以及ps受體stabilin1(表3-1；摘自erwigl-p和hensonpm，celldeathanddifferentiation2008；15：243-250)。此外，hutc表達(dá)多個(gè)橋分子基因，包括tsp-1、tsp-2、表面活性劑蛋白d(sp-d)、mfg-e8、gas6、載脂蛋白h和膜聯(lián)蛋白1。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，hutc在條件培養(yǎng)基中分泌mfg-e8、gas6、tsp-1、tsp-2(圖12a-12e和表3-2)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，hutc不分泌載脂蛋白h、sp-d或膜聯(lián)蛋白i(表3-2)。在某些實(shí)施方案中，hutc以比nhdf和arpe-19顯著更高的水平分泌mfg-e8和tsp-2(圖12a和12d)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，當(dāng)用經(jīng)hutccm預(yù)溫育的ros飼喂rcsrpe細(xì)胞時(shí)，hutc條件培養(yǎng)基刺激ros的吞噬作用。營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞的吞噬作用被完全拯救。如圖13a-13d所示，未經(jīng)處理的營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞的吞噬相比于正常rpe細(xì)胞減少。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用hutccm預(yù)孵育營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞拯救吞噬。這即使在測(cè)定期間不存在hutccm時(shí)也發(fā)生。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，吞噬相關(guān)的受體及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在預(yù)孵育期間上調(diào)。無論營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞是否用hutccm預(yù)處理，在整個(gè)吞噬測(cè)定中存在hutccm時(shí)均觀察到吞噬強(qiáng)勁增強(qiáng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用經(jīng)hutccm預(yù)處理的ros喂養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞恢復(fù)或拯救吞噬。這即使在吞噬測(cè)定期間不存在hutccm時(shí)也發(fā)生。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，hutccm可修剪或修飾ros，例如通過有利促進(jìn)吞噬的橋分子/調(diào)理素增強(qiáng)ros結(jié)合和內(nèi)化。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，橋分子mfg-e8、gas6、tsp-1和tsp-2通過rcsrpe細(xì)胞介導(dǎo)ros吞噬。用經(jīng)各種濃度mfg-e8、gas6、tsp-1或tsp-2預(yù)溫育的ros喂養(yǎng)并分析吞噬作用的營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞顯示出ros吞噬作用的拯救(圖14a-14h)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，hutc條件培養(yǎng)基通過分泌橋分子例如mfg-e8、gas6、tsp-1和tsp-2來介導(dǎo)rcsrpe吞噬拯救。在一個(gè)實(shí)施方案中，rtk配體諸如bdnf、hgf和gdnf刺激rcsrpe中的hutc-介導(dǎo)的吞噬拯救。rtk配體bdnf、hgf和gdnf拯救rcsrpe的吞噬(圖14i-j)。重組的rtk配體和橋分子蛋白可模擬hutccm的作用并恢復(fù)rcsrpe的吞噬作用，并且參與rcsrpe中的hutc-介導(dǎo)的吞噬拯救。sirna介導(dǎo)的基因沉默展示hutc中bdnf、hgf、gdnf、mfg-e8、gas6、tsp-1和tsp-2敲低(沉默)。模擬或混雜sirna轉(zhuǎn)染對(duì)hutc分泌這些因子沒有影響。定向mfg-e8、tsp-1、tsp-2和hgf的sirna得到幾乎100％的敲低效率；bdnf和gdnf分別觀察到80％和65％的敲低(圖15a-15b)。敲低各個(gè)橋分子mfg-e8、tsp-1、tsp-2減少了rcsrpe對(duì)os的吞噬(圖15c)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，rtk配體bdnf、hgf和gdnf為rcsrpe中hutc-介導(dǎo)的吞噬拯救所需。在另一個(gè)實(shí)施方案中，橋分子諸如mfg-e8、gas6、tsp-1和tsp-2為rcsrpe中hutc-介導(dǎo)的吞噬拯救所需。細(xì)胞修飾、組分和產(chǎn)品祖細(xì)胞如產(chǎn)后細(xì)胞還可經(jīng)基因修飾成產(chǎn)生治療學(xué)上可用的基因產(chǎn)品，或者產(chǎn)生用于治療腫瘤的抗腫瘤藥?；蛐揎椏墒褂枚喾N載體中的任一種實(shí)現(xiàn)，包括但不限于整合病毒載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或腺相關(guān)病毒載體；非整合型復(fù)制載體，例如乳頭狀瘤病毒載體、sv40載體、腺病毒載體；或復(fù)制缺陷型病毒載體。將dna引入細(xì)胞中的其它方法包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、粒子槍或通過直接dna注射。優(yōu)選地使用由一種或多種適當(dāng)表達(dá)控制元件和選擇性標(biāo)記物控制的或與其有效連接的dna轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，所述一種或多種適當(dāng)表達(dá)控制元件例如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多聚腺苷酸化位點(diǎn)等等?？墒褂萌魏螁?dòng)子驅(qū)動(dòng)插入基因的表達(dá)。例如，病毒啟動(dòng)子包括但不限于cmv啟動(dòng)子/增強(qiáng)子、sv40、乳頭狀瘤病毒、eb病毒或彈性蛋白基因啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，用于控制感興趣的基因的表達(dá)的控制元件能夠允許基因的調(diào)控表達(dá)，使得僅在體內(nèi)需要時(shí)才合成產(chǎn)物。如果瞬時(shí)表達(dá)是所需的，則優(yōu)選地在非整合型和/或復(fù)制缺陷型載體中使用組成型啟動(dòng)子。另選地，在必要時(shí)可使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)插入基因的表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括但不限于與金屬硫蛋白和熱休克蛋白相關(guān)的啟動(dòng)子。外來dna引入之后，可允許工程化的細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，然后轉(zhuǎn)換到選擇培養(yǎng)基。外來dna中選擇性標(biāo)記物賦予選擇抗性，并且允許細(xì)胞將例如質(zhì)粒上的外來dna穩(wěn)定整合到其染色體中并長(zhǎng)成集落，繼而可克隆和擴(kuò)增成細(xì)胞系。該方法可有利地用于使表達(dá)基因產(chǎn)物的細(xì)胞系工程化。細(xì)胞可經(jīng)基因工程化而“敲除”或“敲低”促使植入位點(diǎn)發(fā)炎或排斥的因子的表達(dá)。下文將討論用于降低靶基因表達(dá)水平或靶基因產(chǎn)物活性水平的負(fù)調(diào)節(jié)技術(shù)。如本文所用，“負(fù)調(diào)節(jié)”指相對(duì)于不進(jìn)行調(diào)節(jié)處理時(shí)的靶基因產(chǎn)物的水平和/或活性，靶基因產(chǎn)物的水平和/或靶基因產(chǎn)物的活性降低。來自神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的基因的表達(dá)可使用多種技術(shù)(包括例如通過使用同源重組技術(shù)使基因失活的表達(dá)抑制)來降低或敲除。通常，在編碼蛋白質(zhì)重要區(qū)域的外顯子(或該區(qū)域5’的外顯子)中插入陽(yáng)性選擇性標(biāo)記物(例如neo)，從而防止由靶基因產(chǎn)生正常mrna并導(dǎo)致基因失活。還可通過在基因的一部分引入缺失，或通過刪除整個(gè)基因，而使基因失活。通過使用具有在基因組中相距很遠(yuǎn)的與靶基因同源的兩個(gè)區(qū)域的構(gòu)建體，可將介于兩個(gè)區(qū)域之間的序列刪除(mombaerts等人，1991，proc.nat.acad.sci.u.s.a.88：3084-3087)。反義dna酶、核糖酶、小干擾rna(sirna)、以及抑制靶基因表達(dá)的其它此類分子也可用于降低靶基因活性水平。例如，已證實(shí)抑制主要組織相容性基因復(fù)合物(hla)的表達(dá)的反義rna分子對(duì)于免疫應(yīng)答而言是最通用的。另外，可使用三螺旋分子降低靶基因活性水平。這些技術(shù)詳述于l.g.davis等人(編輯)，1994，basicmethodsinmolecularbiology，第2版，appleton&lange，norwalk，ct。在其它方面，本發(fā)明提供由下述制備的細(xì)胞裂解液和細(xì)胞可溶性級(jí)分：產(chǎn)后細(xì)胞(優(yōu)選ppdc)，或者包含ppdc細(xì)胞的異質(zhì)或同質(zhì)細(xì)胞群，以及已經(jīng)基因修飾或已被刺激沿神經(jīng)元途徑分化的ppdc或其群體。此類細(xì)胞裂解液及其級(jí)分具有許多效用。例如，在體內(nèi)使用細(xì)胞裂解液可溶性級(jí)分(即，基本上不含膜)有益于在患者內(nèi)異體地使用胞內(nèi)環(huán)境而不引入大量最易引發(fā)排斥或其它不良免疫學(xué)應(yīng)答的細(xì)胞表面蛋白。裂解細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域熟知的，包括機(jī)械破碎、酶分解或化學(xué)分解或它們的組合等多種手段。此類細(xì)胞裂解液可由細(xì)胞直接在它們的生長(zhǎng)介質(zhì)中制備，因而含有分泌的生長(zhǎng)因子等，或可在(例如)pbs或其它溶液中由不含介質(zhì)的洗滌過的細(xì)胞制備。如果優(yōu)選的，可將洗滌的細(xì)胞以大于初始群體密度的濃度重懸。在一個(gè)實(shí)施方案中，如通過破碎細(xì)胞而不進(jìn)行隨后的細(xì)胞級(jí)分的分離來制備全細(xì)胞裂解液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞膜級(jí)分通過本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法(例如離心、過濾或類似方法)分離自細(xì)胞的可溶性級(jí)分。由祖細(xì)胞例如產(chǎn)后衍生細(xì)胞群制備的細(xì)胞裂解液或細(xì)胞可溶性級(jí)分可按原樣、進(jìn)一步濃縮(通過例如超濾或凍干、或甚至干燥)、部分純化、與本領(lǐng)域已知的藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合、或與其它化合物(諸如生物制品，例如藥學(xué)上有用的蛋白組合物)組合來使用。細(xì)胞裂解液或其級(jí)分可單獨(dú)在體外或體內(nèi)，或例如與自體或同種活細(xì)胞一起使用。如果在體內(nèi)引入，可將裂解液局部地引入到治療部位處，或引入到治療部位遠(yuǎn)側(cè)以向患者提供例如需要的細(xì)胞生長(zhǎng)因子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可在體外培養(yǎng)產(chǎn)后細(xì)胞(優(yōu)選ppdc)以產(chǎn)生高收率的生物產(chǎn)物。例如，所關(guān)注的天然產(chǎn)生特定生物產(chǎn)物(如營(yíng)養(yǎng)因子)，或者已經(jīng)基因工程化以產(chǎn)生生物產(chǎn)物的此類細(xì)胞可使用本文所述的培養(yǎng)技術(shù)來無性擴(kuò)增。另選地，細(xì)胞可在誘導(dǎo)分化為期望譜系的培養(yǎng)基中擴(kuò)增。在每種情況下，通過細(xì)胞產(chǎn)生并分泌到培養(yǎng)液中的生物產(chǎn)物可使用標(biāo)準(zhǔn)分離技術(shù)(如諸如舉例來說差異蛋白沉淀、離子交換色譜、凝膠過濾色譜、電泳和hplc)容易地從條件培養(yǎng)液中分離。為了利用流動(dòng)進(jìn)料方法(例如，體外三維培養(yǎng))，可使用“生物反應(yīng)器”。實(shí)質(zhì)上，使新鮮培養(yǎng)液通過三維培養(yǎng)，從培養(yǎng)物中洗出且然后可如上所述從流出物中分離生物產(chǎn)物。另選地，所關(guān)注的生物產(chǎn)物可保持在細(xì)胞內(nèi)，因此，其收集可能需要如上所述的裂解細(xì)胞。然后可使用上文所列技術(shù)中的任何一種或多種來純化生物產(chǎn)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，作為替代形式制備、收集和利用胞外基質(zhì)(ecm)來將活細(xì)胞植入到需要組織修復(fù)或替換的受治療者中，ecm通過在液體、固體或半固體基材上培養(yǎng)產(chǎn)后細(xì)胞(優(yōu)選ppdc)產(chǎn)生。在使得期望量的ecm分泌到框架上的條件下，將細(xì)胞在如本文其它地方描述的三維框架上體外培養(yǎng)。去除細(xì)胞和框架，并且處理ecm以用于進(jìn)一步使用，例如作為可注射的制劑。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的，要將框架上細(xì)胞殺死并且從框架上去除所有細(xì)胞碎片。這個(gè)過程可以許多不同方式進(jìn)行。例如，可將活組織在液氮中快速冷凍而不低溫保存，或可將組織浸入無菌蒸餾水中，使得細(xì)胞由于滲透壓而破裂。一旦殺死細(xì)胞，細(xì)胞膜可能破碎，并且通過用溫和去垢劑(諸如edta、chaps或兩性離子去垢劑)沖洗的處理來去除細(xì)胞碎片。另選地，組織可經(jīng)酶消化和/或用分解細(xì)胞膜的試劑提取并移除細(xì)胞內(nèi)容物。此類酶的示例包括但不限于透明質(zhì)酸酶、分散酶、蛋白酶和核酸酶。去垢劑的示例例如包括非離子去垢劑，諸如烷芳基聚醚醇(tritonx-100)、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(rohmandhaasphiladelphia，pa.)、brij-35即聚乙氧基乙醇月桂基醚(atlaschemicalco.，sandiego，calif.)、聚山梨醇酯20(tween20)、聚乙氧乙醇失水山梨醇單月桂酸酯(rohmandhaas)、聚乙烯月桂基醚(rohmandhaas)；以及例如離子去污劑，諸如十二烷基硫酸鈉、硫酸化高級(jí)脂肪醇、支鏈或非支鏈中含有7至22個(gè)碳原子的磺化烷烴和磺化烷基芳烴。可以例如取決于是否已經(jīng)在三維框架上形成新組織的多種方式實(shí)現(xiàn)ecm的收集，所述三維框架是可生物降解的或不可生物降解的。例如，如果框架是不可生物降解的，ecm可通過使框架經(jīng)受超聲、高壓水射、機(jī)械刮擦或用去垢劑或酶溫和處理、或上述方法的任何組合去除。如果框架是可生物降解的，ecm可例如通過使框架降解或溶解在溶液中收集。另選地，如果可生物降解的框架由其自身可與ecm一起注射的材料構(gòu)成，則框架和ecm可針對(duì)隨后的注射一起處理。另選地，針對(duì)從不可生物降解的框架收集ecm，可通過上文所述的任何方法將ecm從可生物降解的框架去除。優(yōu)選地設(shè)計(jì)所有收集過程以免使ecm變性。在收集ecm之后，可將它進(jìn)一步處理。例如，可使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)(諸如通過超聲)將ecm勻化成細(xì)粒，使得其可通過外科針。如果需要，可通過γ照射交聯(lián)ecm的組分。優(yōu)選地，可在0.25至2兆拉德之間照射ecm以滅菌和交聯(lián)ecm。使用試劑(其是有毒的，諸如戊二醛)的化學(xué)交聯(lián)是可以的，但一般不是優(yōu)選的?？赏ㄟ^將由本發(fā)明細(xì)胞產(chǎn)生的ecm與一種或多種其它細(xì)胞類型的ecm混合來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(諸如存在于ecm的多種膠原類型)的量和/或比率。此外，生物活性物質(zhì)諸如蛋白質(zhì)、生長(zhǎng)因子和/或藥品可結(jié)合到ecm。示例性生物活性物質(zhì)包括組織生長(zhǎng)因子諸如tgf-β等，其促進(jìn)注射部位處的治愈和組織修復(fù)。此類添加劑可用于上文所述的任何實(shí)施方案中，如由細(xì)胞產(chǎn)生的全細(xì)胞裂解液、可溶性細(xì)胞級(jí)分、或進(jìn)一步地，純化的組分和產(chǎn)物。藥物組合物在另一方面，本發(fā)明提供藥物組合物，該藥物組合物使用祖細(xì)胞如產(chǎn)后細(xì)胞(優(yōu)選ppdc)、其細(xì)胞群、由此類細(xì)胞產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基，以及由此類細(xì)胞以各種方法產(chǎn)生的細(xì)胞組分和產(chǎn)物來治療眼變性性病癥。某些實(shí)施方案涵蓋包含活細(xì)胞(例如，單獨(dú)或與其它細(xì)胞類型混合的ppdc)的藥物組合物。其它實(shí)施方案涵蓋包含ppdc條件培養(yǎng)基的藥物組合物。另外的實(shí)施方案可使用ppdc的細(xì)胞組分(例如細(xì)胞裂解液、可溶性細(xì)胞級(jí)分、ecm或任何前述組分)或產(chǎn)物(例如由細(xì)胞天然產(chǎn)生或通過基因修飾產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)因子和其它生物因子、來自培養(yǎng)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基)。在任一種情況下，藥物組合物還可包含其它活性劑，諸如本領(lǐng)域已知的抗炎劑、抗凋亡的藥劑、抗氧化劑、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或神經(jīng)再生、神經(jīng)保護(hù)或眼用藥物?？杀惶砑拥剿幬锝M合物中的其它組分的示例包括但不限于：(1)其它神經(jīng)保護(hù)或神經(jīng)有益藥物；(2)所選擇的細(xì)胞外基質(zhì)組分，諸如一類或多類本領(lǐng)域已知的膠原，和/或生長(zhǎng)因子、富血小板血漿、以及藥物(另選地，ppdc可經(jīng)基因工程化而表達(dá)和產(chǎn)生生長(zhǎng)因子)；(3)抗凋亡劑(例如，紅細(xì)胞生成素(epo)、epo模擬體、促血小板生成素、胰島素樣生長(zhǎng)因子(igf)-i、igf-ii、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、半胱天冬酶抑制劑)；(4)抗炎化合物(例如，p38map激酶抑制劑、tgf-β抑制劑、抑制素、il-6和il-1抑制劑、吡嘧司特、曲尼司特、類克、雷帕霉素和非甾類抗炎藥(nsaids)(諸如替泊沙林、痛滅定和舒洛芬)；(5)免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)劑，諸如鈣調(diào)磷酸酶抑制劑、mtor抑制劑、抗增殖劑、皮質(zhì)類固醇和各種抗體；(6)抗氧化劑，諸如普羅布考、維生素c和e、輔酶q-10、谷胱甘肽、l-半胱氨酸和n-乙酰半胱氨酸；以及(6)局麻藥，這里僅列出一些。本發(fā)明的藥物組合物包含用藥學(xué)上可接受的載體或培養(yǎng)基配制的祖細(xì)胞如產(chǎn)后細(xì)胞(優(yōu)選ppdc)、那些細(xì)胞所產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基、或其組分或產(chǎn)物。合適的藥學(xué)上可接受的載體包括水、鹽溶液(諸如林格氏溶液(ringer’ssolution))、醇、油、明膠、和碳水化合物(諸如乳糖、直鏈淀粉、或淀粉、脂肪酸酯)、羥甲基纖維素、以及聚乙烯基吡咯烷?？蓪⒋祟愔苿缇?，并且如果需要，將其與輔助劑(諸如潤(rùn)滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽、緩沖液和著色劑)混合。典型但非排他性地，將包含細(xì)胞組分或產(chǎn)物(但非活細(xì)胞)的藥物組合物配制為液體。通常將包含ppdc活細(xì)胞的藥物組合物配制為液體、半固體(例如凝膠)或固體(例如，如對(duì)于眼部組織工程化適當(dāng)?shù)幕|(zhì)、支架等等)。藥物組合物可包含如藥物化學(xué)家或生物學(xué)家所熟悉的輔助組分。例如，其可包含抗氧化劑，其范圍根椐所用抗氧化劑的種類而改變。常用抗氧化劑的適當(dāng)范圍為約0.01％至約0.15％容重的edta、約0.01％至約2.0％容重的亞硫酸鈉、以及約0.01％至約2.0％容重的焦亞硫酸鈉。對(duì)于以上每者，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可使用約0.1％容重的濃度。其它代表性的化合物包括巰基丙?；拾彼?、n-乙酰半胱氨酸、β-巰基乙胺、谷胱甘肽和類似的物類，但是也可采用適于眼部施用的其它抗氧化劑，例如抗壞血酸及其鹽或亞硫酸鹽或焦亞硫酸鈉。緩沖劑可用于將滴眼制劑的ph維持在約4.0至約8.0的范圍內(nèi)；從而使眼部刺激最小化。對(duì)于直接玻璃體內(nèi)或眼內(nèi)的注射，制劑應(yīng)當(dāng)為ph7.2至7.5，優(yōu)選ph7.3-7.4。眼科用組合物也可包括適于眼施用的張力劑。其中合適的是使制劑與0.9％的鹽水溶液近似等滲的氯化鈉。在某些實(shí)施方案中，采用增粘劑配制藥物組合物。示例性試劑為羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素和聚乙烯吡咯烷酮。藥物組合物可具有根據(jù)需要添加的助溶劑。合適的助溶劑可包括甘油、聚乙二醇(peg)、聚山梨酸酯、丙二醇和聚乙烯醇。防腐劑也可包括在內(nèi)，例如苯扎氯銨、異辛基苯氧基乙氧基乙基芐基二甲基氯化銨、氯代丁醇、乙酸苯汞或硝酸苯汞、乙基汞硫代水楊酸鈉、或?qū)αu基苯甲酸甲酯或丙酯。注射用制劑優(yōu)選地被設(shè)計(jì)成單次使用給藥并且不包含防腐劑。注射溶液應(yīng)當(dāng)具有相當(dāng)于0.9％氯化鈉溶液(重量克分子滲透濃度為290-300滲透壓毫克分子)的等滲度。這可以通過添加氯化鈉或如上所列的其它共溶劑、或如上所列的賦形劑(例如緩沖劑)和抗氧化劑來實(shí)現(xiàn)。眼前房組織被房水浸泡，而視網(wǎng)膜持續(xù)暴露于玻璃體。這些液體/凝膠因包含抗氧化劑化合物和酶而以高度還原的氧化還原態(tài)存在。因此，可能有利的是在眼科用組合物中包括還原劑。合適的還原劑包括n-乙酰半胱氨酸、抗壞血酸或鹽形式，以及亞硫酸鹽鈉或偏亞硫酸氫鈉，其中抗壞血酸和/或n-乙酰半胱氨酸或谷胱甘肽尤其適用于注射溶液?？蓪?xì)胞或條件培養(yǎng)基、或細(xì)胞組分或細(xì)胞產(chǎn)物的藥物組合物以本領(lǐng)域已知的幾種遞送模式中的一種或多種遞送至患者的眼。在一個(gè)可能適用于一些情況的實(shí)施方案中，將組合物以滴眼劑或洗眼劑局部遞送至眼。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可經(jīng)由定期眼內(nèi)注射或通過以諸如bss或bssplus(alconusa，fortworth，tex.)的沖洗液灌注將組合物遞送至眼內(nèi)部的各個(gè)位置。另選地，可將組合物以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它眼科劑型施用，如預(yù)形成或原位形成的凝膠劑或脂質(zhì)體，例如授予herrero-vanrell的美國(guó)專利5，718,922中所公開的那樣。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物可經(jīng)由接觸鏡片(例如lidofilconb，bausch&lombcw79ordeltacon(deltafilcona))或臨時(shí)滯留在眼表面上的其它物體遞送至或透過需要治療的眼的晶狀體。在其它實(shí)施方案中，可采用諸如膠原角膜屏蔽體(例如，bio-cor可溶解的角膜屏蔽體，summittechnology，watertown，mass.)的支持物。還可通過來自滲透泵(alzet，alzacorp.，paloalto，calif.)的插管或者通過定時(shí)釋放的膠囊(occusent)或可生物降解片(oculex，ocusert)的植入，將組合物通過灌注施用到眼球中。這些施用途徑的優(yōu)點(diǎn)在于為眼提供連續(xù)供應(yīng)的藥物組合物。這可有利于局部遞送至角膜。在半固體或固體載體中的包含活細(xì)胞的藥物組合物通常配制用于在眼部損傷或損壞的部位處的外科植入。應(yīng)當(dāng)理解，液體組合物(例如條件培養(yǎng)基)也可通過外科規(guī)程施用。在特定的實(shí)施方案中，半固體或固體藥物組合物可包含半滲透性凝膠、晶格、細(xì)胞支架等，它們可以是不可生物降解的或可生物降解的。例如，在某些實(shí)施方案中，可能期望或合適的是將外源細(xì)胞與它們的周圍環(huán)境隔離，仍允許細(xì)胞將生物分子分泌和遞送到周圍細(xì)胞。在這些實(shí)施方案中，可將細(xì)胞配制為自主植入物，所述自主植入物包含由不可降解的、可選擇性滲透的阻隔包圍的活ppdc或含有ppdc的細(xì)胞群，所述阻隔可使移植細(xì)胞與宿主組織物理分離。有時(shí)將此類植入物稱為“免疫保護(hù)的”，因?yàn)樵诓淮嬖谒幬飳?dǎo)致的免疫抑制下，它們具有防止免疫細(xì)胞和大分子受到移植細(xì)胞殺傷的能力(關(guān)于此類裝置和方法的綜述參見如p.a.tresco等人，2000，adv.drugdeliveryrev.42：3-27)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物利用了不同種類可降解的凝膠和網(wǎng)狀物。例如，特別適合于持續(xù)釋放制劑的可降解的材料包括生物相容性聚合物，諸如聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、甲基纖維素、透明質(zhì)酸、膠原等等。可降解的聚合物的結(jié)構(gòu)、選擇和在藥品遞送媒介物中的用途已在多個(gè)公布中綜述，包括a.domb等人，1992，polymersforadvancedtechnologies3：279-291。授予wong等人的美國(guó)專利5,869,079公開了可生物降解緩釋眼部植入物中親水性和疏水性實(shí)體的組合。此外，授予guo等人的美國(guó)專利6,375,972，授予chen等人的美國(guó)專利5,902,598，授予wong等人的美國(guó)專利6,331,313，授予ogura等人的美國(guó)專利5,707,643，授予weiner等人的美國(guó)專利5,466,233，以及授予avery等人的美國(guó)專利6,251,090各自描述了可用于遞送藥物組合物的眼內(nèi)的植入裝置和系統(tǒng)。在其它實(shí)施方案中，例如，為修復(fù)神經(jīng)病變，例如損傷或切斷的眼神經(jīng)，可能期望或合適的是將細(xì)胞遞送在可生物降解的，優(yōu)選地生物吸收性或可生物吸收的支架或基質(zhì)上或其中。通常，這些三維生物材料包含附著到支架上、分散于支架內(nèi)、或結(jié)合在細(xì)胞外基質(zhì)中的活細(xì)胞，所述細(xì)胞外基質(zhì)夾帶在支架中。一旦植入到身體的靶區(qū)域，這些植入物開始與宿主組織整合，其中移植細(xì)胞開始逐漸形成(參見如，p.a.tresco等人，2000，同上；另參見d.w.hutmacher，2001，j.biomater.sci.polymeredn.12：107-174)。可用于本發(fā)明的支架或基質(zhì)(有時(shí)共同稱為“框架”)材料的示例包括非織造墊、多孔泡沫、或自組裝肽。例如，使用由以商品名vicryl(ethicon，inc.，somerville，n.j)銷售的合成的可吸收的乙醇酸和乳酸共聚物pga/pla)構(gòu)成的纖維形成非織造墊。還可利用由例如聚(ε-己內(nèi)酯)/聚(乙醇酸)(pcl/pga)共聚物組成的泡沫，其通過諸如冷凍干燥或凍干的方法形成，如美國(guó)專利6,355,699中討論的。也可使用水凝膠諸如自組裝肽(例如rad16)。原位形成的可降解網(wǎng)絡(luò)也適用于本發(fā)明(參見例如，anseth，k.s.等人，2002，j.controlledrelease78：199-209；wang，d.等人，2003，biomaterials24：3969-3980；授予he等人的美國(guó)專利公布2002/0022676)。這些材料可配制成適合注射的流體，然后可通過多種方式(如，改變溫度、ph、暴露于光)誘導(dǎo)其形成原位或體內(nèi)形成可降解的水凝膠網(wǎng)絡(luò)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述框架是氈，其可由可生物吸收的材料(例如pga、pla、pcl共聚物或共混物、或透明質(zhì)酸)制成的復(fù)絲紗線構(gòu)成。使用包括卷曲、切割、梳理和針刺的標(biāo)準(zhǔn)紡織加工技術(shù)，將所述紗線制成氈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將細(xì)胞接種到泡沫支架，所述泡沫支架可以是復(fù)合結(jié)構(gòu)。在多個(gè)上述實(shí)施方案中，可將框架模制成有用的形狀。此外，應(yīng)當(dāng)理解，例如以對(duì)應(yīng)于用于制備含成纖維細(xì)胞的gdc血管內(nèi)線圈的方式，可在預(yù)成形的、不可降解的外科的或植入式的裝置上培養(yǎng)ppdc，例如(marx，w.f.等人，2001，am.j.neuroradiol.22：323-333)。為了加強(qiáng)細(xì)胞附著，可在接種細(xì)胞之前處理基質(zhì)、支架或裝置。例如，在接種之前，可用0.1摩爾乙酸處理尼龍基質(zhì)，并且在聚賴氨酸、pbs和/或膠原中溫育以涂覆尼龍?？深愃频厥褂昧蛩崽幚砭郾揭蚁＿€可對(duì)框架的外表面進(jìn)行改性以改善細(xì)胞的附著性或生長(zhǎng)和組織分化，例如通過等離子涂布框架或添加一種或多種蛋白質(zhì)(如，膠原、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維)、糖蛋白、糖胺聚糖(如，硫酸肝素、4-硫酸軟骨素、6-硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素)、細(xì)胞基質(zhì)和/或其它材料，例如但不限于明膠、海藻酸鹽、瓊脂、瓊脂糖和植物樹膠等等。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備包含活細(xì)胞的框架。例如，可使細(xì)胞在培養(yǎng)容器中自由生長(zhǎng)至亞匯合或匯合狀態(tài)，然后將其與培養(yǎng)物分離并接種到框架上。如果需要，可在接種細(xì)胞之前、期間或之后向培養(yǎng)基添加生長(zhǎng)因子以觸發(fā)分化和組織形成。另選地，可修飾框架本身，使得增強(qiáng)在其上的細(xì)胞生長(zhǎng)，或使得降低植入物的排斥風(fēng)險(xiǎn)。因此，一種或多種生物學(xué)活性化合物(包括但不限于抗炎劑、免疫抑制劑或生長(zhǎng)因子)可加入框架中用于局部釋放。使用方法可以各種方式使用祖細(xì)胞，諸如產(chǎn)后細(xì)胞(優(yōu)選hutc或pdc)、或其細(xì)胞群、或由此類細(xì)胞產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基或其它組分或產(chǎn)物，以支持和有利于眼部細(xì)胞和組織的修復(fù)和再生。此類用途包括體外、離體和體內(nèi)方法。以下列出的方法針對(duì)ppdc，但其它產(chǎn)后細(xì)胞也可適用于那些方法。體外和體內(nèi)方法在一個(gè)實(shí)施方案中，可在體外使用祖細(xì)胞諸如產(chǎn)后細(xì)胞(優(yōu)選hutc或pdc)，以及由其產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基，以針對(duì)藥劑、生長(zhǎng)因子、調(diào)節(jié)因子等的有效性和細(xì)胞毒性篩選各種各樣的化合物。例如，此類篩選可在基本上同質(zhì)的ppdc群體上進(jìn)行，以評(píng)估與ppdc一起配制或共同配制的候選復(fù)合物治療眼部病癥的功效或毒性。另選地，出于評(píng)估新藥物候選物的功效的目的，此類篩選可在已被刺激分化成眼中存在的細(xì)胞類型或其祖細(xì)胞的ppdc上進(jìn)行。在該實(shí)施方案中，ppdc可在體外維持并暴露于待測(cè)試的化合物。潛在胞毒化合物的活性可通過其在培養(yǎng)中損害或殺死細(xì)胞的能力來測(cè)量。這可容易的通過活體染色技術(shù)來評(píng)估。如上所述，可在體外培養(yǎng)ppdc來產(chǎn)生生物產(chǎn)物，所述生物產(chǎn)物由細(xì)胞天然產(chǎn)生、或由細(xì)胞在被誘導(dǎo)分化成其它譜系時(shí)產(chǎn)生，或者由細(xì)胞經(jīng)由基因修飾產(chǎn)生。例如，已發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的臍衍生的細(xì)胞分泌timp1、tpo、kgf、hgf、fgf、hbegf、bdnf、mip1b、mcp1、rantes、i309、tarc、mdc和il-8。已發(fā)現(xiàn)timp1、tpo、kgf、hgf、hbegf、bdnf、mip1a、mcp-1、rantes、tarc、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子和il-8由生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的胎盤衍生的ppdc分泌(參見實(shí)施例)。就這一點(diǎn)而言，本發(fā)明的實(shí)施方案的特征為使用ppdc產(chǎn)生條件培養(yǎng)基。由ppdc產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基可得自未分化的ppdc或得自在刺激分化的條件下孵育的ppdc。此類條件培養(yǎng)基被設(shè)想用于例如體外或離體或者體內(nèi)培養(yǎng)上皮或神經(jīng)前體細(xì)胞，以支持包含ppdc同質(zhì)群體或含有ppdc及其它祖細(xì)胞的異質(zhì)群體的移植細(xì)胞。得自ppdc或ecm或其組分的細(xì)胞裂解液、可溶性細(xì)胞級(jí)分或組分可用于多種目的。如上所述，這些組分中的一些可在藥物組合物中使用。在其它實(shí)施方案中，細(xì)胞裂解液或ecm在進(jìn)行此類治療過程中用于涂覆(或換句話講處理)將要用于外科、或用于植入、或用于離體目的的物質(zhì)或裝置，或用于促進(jìn)細(xì)胞或組織的治愈或存活。如實(shí)施例14和16所述的那樣，ppdc在與那些細(xì)胞的共培養(yǎng)中生長(zhǎng)時(shí)展示出支持成體神經(jīng)祖細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和分化的能力。同樣，先前的研究指示ppdc可經(jīng)由營(yíng)養(yǎng)機(jī)制支持視網(wǎng)膜細(xì)胞起作用(us2010-0272803)。因此，ppdc有利地用于體外共培養(yǎng)，以對(duì)其它細(xì)胞特別是神經(jīng)細(xì)胞以及神經(jīng)和眼部祖細(xì)胞(例如，神經(jīng)干細(xì)胞和視網(wǎng)膜或角膜上皮干細(xì)胞)提供營(yíng)養(yǎng)支持。對(duì)于共培養(yǎng)，可能期望的是ppdc和期望的其它細(xì)胞，所述其它細(xì)胞將要在此兩種細(xì)胞類型接觸的條件下共培養(yǎng)。這可例如通過將細(xì)胞以異質(zhì)細(xì)胞群接種到培養(yǎng)基中或接種到合適培養(yǎng)基底上來實(shí)現(xiàn)。另選地，首先可使ppdc生長(zhǎng)至匯合狀態(tài)，然后其在培養(yǎng)中將對(duì)第二期望的細(xì)胞類型起到基材作用。在這后一實(shí)施方案中，細(xì)胞還可如通過膜或類似裝置經(jīng)物理分離，使得其它細(xì)胞類型可被去除和獨(dú)立使用，然后是共培養(yǎng)時(shí)期。在共培養(yǎng)中用于促進(jìn)神經(jīng)或眼部細(xì)胞類型的擴(kuò)增和分化的ppdc可用于科研和臨床/治療領(lǐng)域。例如，ppdc共培養(yǎng)可用于在培養(yǎng)中有利于此類細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，例如用于基礎(chǔ)科研目的或用于藥物篩選試驗(yàn)。出于治療性目的，ppdc共培養(yǎng)還可用于神經(jīng)或眼部祖細(xì)胞的離體擴(kuò)增以供稍后施用。例如，可從個(gè)體收獲神經(jīng)或眼部祖細(xì)胞，將它們與ppdc在共培養(yǎng)中離體擴(kuò)增，然后轉(zhuǎn)到該個(gè)體(自體轉(zhuǎn)移)或另一個(gè)個(gè)體(同種或異體轉(zhuǎn)移)。在這些實(shí)施方案中，應(yīng)當(dāng)理解，離體擴(kuò)增之后，可將混合的細(xì)胞群施用于有治療需要的患者，所述混合的細(xì)胞群包含ppdc和祖細(xì)胞。另選地，在自體轉(zhuǎn)移合適或期望的情況下，針對(duì)向患者施用，可在培養(yǎng)中物理地分離共培養(yǎng)的細(xì)胞群，使自體祖細(xì)胞能夠移除。體內(nèi)方法如實(shí)施例中所列出的那樣，條件培養(yǎng)基可有效地用于治療眼變性性病癥。一旦移植到眼中目標(biāo)位置，得自祖細(xì)胞如ppdc的條件培養(yǎng)基就為眼部細(xì)胞原位提供營(yíng)養(yǎng)支持?？蓪⒌米宰婕?xì)胞如ppdc的條件培養(yǎng)基與如下物質(zhì)一起施用：其它有益藥物，生物分子諸如生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)因子，條件培養(yǎng)基(得自祖細(xì)胞或分化的細(xì)胞培養(yǎng)物)，或其它活性劑，諸如本領(lǐng)域已知的抗炎劑、抗凋亡的藥劑、抗氧化劑、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或神經(jīng)再生、神經(jīng)保護(hù)藥物。當(dāng)將條件培養(yǎng)基與其它試劑一起施用時(shí)，它們可與其它試劑在單個(gè)藥物組合物中一起，或在分離的藥物組合物中，同時(shí)或順序(在其它試劑施用之前或之后)施用?？膳c祖細(xì)胞如ppdc以及條件培養(yǎng)基產(chǎn)物一起施用的其它組分的示例包括但不限于：(1)其它神經(jīng)保護(hù)或神經(jīng)有益藥物；(2)所選擇的細(xì)胞外基質(zhì)組分，諸如一類或多類本領(lǐng)域已知的膠原，和/或生長(zhǎng)因子、富血小板血漿、以及藥物(另選地，細(xì)胞可經(jīng)基因工程化而表達(dá)和產(chǎn)生生長(zhǎng)因子)；(3)抗凋亡劑(例如，紅細(xì)胞生成素(epo)、epo模擬體、促血小板生成素、胰島素樣生長(zhǎng)因子(igf)-i、igf-ii、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、半胱天冬酶抑制劑)；(4)抗炎化合物(例如，p38map激酶抑制劑、tgf-β抑制劑、抑制素、il-6和il-i抑制劑、吡嘧司特、曲尼司特、類克、雷帕霉素和非甾類抗炎藥(nsaids)(諸如替泊沙林、痛滅定和舒洛芬)；(5)免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)劑，諸如鈣調(diào)磷酸酶抑制劑、mtor抑制劑、抗增殖劑、皮質(zhì)類固醇和各種抗體；(6)抗氧化劑，諸如普羅布考、維生素c和e、輔酶q-10、谷胱甘肽、l-半胱氨酸和n-乙酰半胱氨酸；以及(6)局麻藥，這里僅列出一些?？蓪⒁后w或流體藥物組合物施用于眼中更普遍的位置(例如，局部地或眼內(nèi)地)。其它實(shí)施方案涵蓋通過施用包含得自祖細(xì)胞如ppdc的條件培養(yǎng)基、或那些細(xì)胞天然產(chǎn)生或通過細(xì)胞基因修飾產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)因子和其它生物因子的藥物組合物來治療眼變性性病癥的方法。同樣，這些方法還可包括施用其它活性劑，諸如本領(lǐng)域已知的生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或神經(jīng)再生或神經(jīng)保護(hù)藥品。根據(jù)良好的醫(yī)療實(shí)踐，考慮到各個(gè)患者的條件(例如體質(zhì)和眼變性性病癥的程度、年齡、性別、體重和一般醫(yī)療條件、以及執(zhí)業(yè)醫(yī)生已知的其它因素)，開發(fā)了施用得自產(chǎn)后細(xì)胞如ppdc的條件培養(yǎng)基或本文所述的任何其它藥物組合物的劑型和劑量方案。因此，通過這些本領(lǐng)域已知的考慮因素確定向患者施用的藥物組合物的有效量。可能期望或合適的是開始細(xì)胞療法之前藥理上抑制患者的免疫反應(yīng)。如上所述，這可通過使用全身或局部免疫抑制劑實(shí)現(xiàn)，或其可通過在膠囊包封裝置中遞送細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。用于降低或消除對(duì)移植的細(xì)胞的免疫應(yīng)答的這些和其它方法是本領(lǐng)域已知的。如上所述，作為替代形式，條件培養(yǎng)基可由經(jīng)基因修飾以降低其免疫原性的ppdc制得。可通過使用多種掃描技術(shù)(例如計(jì)算機(jī)軸向斷層攝影術(shù)(cat或ct)掃描、磁性共振成像(mri)或正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)(pet)掃描)，來測(cè)定移植的細(xì)胞在活患者內(nèi)的存活。移植物存活的測(cè)定也可在死后通過取出肺組織且在視覺上或通過顯微鏡檢查來完成。另選地，可用對(duì)神經(jīng)或眼部細(xì)胞或其產(chǎn)物(例如神經(jīng)遞質(zhì))特異的染色劑處理細(xì)胞。也可通過先前的示蹤染料(諸如若丹明或熒光素標(biāo)記的微粒、固藍(lán)、鐵微粒、雙苯甲酰胺或基因引入報(bào)道基因產(chǎn)物，諸如β-半乳糖苷酶或β-葡糖苷酸酶)的結(jié)合來鑒定移植的細(xì)胞。移植細(xì)胞或條件培養(yǎng)基在受治療者眼部組織中的功能性整合可通過檢查受損或病態(tài)的眼部功能的修復(fù)來評(píng)估。例如，黃斑變性或其它視網(wǎng)膜病的治療效果可通過視敏度的提高、異常的評(píng)估和立體彩色眼底照片的分級(jí)來確定(age-relatedeyediseasestudyresearchgroup，nei，nih，aredsreportno.8，2001，arch.ophthalmol.119：1417-1436)。試劑盒和庫(kù)在另一方面，本發(fā)明提供試劑盒，該試劑盒以如上所述用于眼部再生和修復(fù)的各種方法利用祖細(xì)胞如ppdc、以及細(xì)胞群、由細(xì)胞(優(yōu)選ppdc)制得的條件培養(yǎng)基，以及其組分和產(chǎn)品。在用于眼變性性病癥的治療或其它計(jì)劃的治療的情況下，試劑盒可包含一種或多種細(xì)胞群或條件培養(yǎng)基，包含至少產(chǎn)后細(xì)胞或來源于產(chǎn)后細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和藥學(xué)上可接受的載體(液體、半固體或固體)。試劑盒也可任選地包括施用細(xì)胞和條件培養(yǎng)基的方式，例如通過注射。試劑盒還可包括細(xì)胞和條件培養(yǎng)基的使用說明。針對(duì)野戰(zhàn)醫(yī)院用途(諸如軍事用途)制備的試劑盒可包括整個(gè)手術(shù)的供應(yīng)(包括組織支架、外科縫合線等)，其中可使用細(xì)胞或條件培養(yǎng)基輔助修復(fù)急性損傷。如本文描述的用于測(cè)定和體外方法的試劑盒可含有例如以下項(xiàng)中的一種或多種：(1)ppdc或其組分、或ppdc的條件培養(yǎng)基或其它產(chǎn)物；(2)用于實(shí)施體外方法的試劑；(3)其它細(xì)胞或細(xì)胞群(視情況而定)；以及(4)用于實(shí)施體外方法的說明書。在另一方面，本發(fā)明還提供本發(fā)明的組織、細(xì)胞、細(xì)胞群、條件培養(yǎng)基和細(xì)胞組分的存庫(kù)。如上所討論，細(xì)胞和條件培養(yǎng)基易于冷凍保存。本發(fā)明因此提供在庫(kù)中冷凍保存細(xì)胞的方法，其中細(xì)胞被凍存并與基于細(xì)胞免疫學(xué)、生物化學(xué)和遺傳特性的細(xì)胞完整特征相關(guān)聯(lián)?？筛鶕?jù)規(guī)程的需要和患者的需要，將冷凍細(xì)胞解凍并擴(kuò)增或直接用于自體、同源或異源治療。優(yōu)選地，將各個(gè)冷凍保存樣本的信息保存于計(jì)算機(jī)中，其可基于外科醫(yī)生、規(guī)程和患者的需要搜索，并且基于細(xì)胞或群體的特征作出合適的匹配。優(yōu)選地，使本發(fā)明的細(xì)胞生長(zhǎng)并擴(kuò)增至期望的細(xì)胞數(shù)量，并且在存在或不存在基質(zhì)或支持物情況下，單獨(dú)地或作為共培養(yǎng)物制備治療性細(xì)胞組合物。雖然在一些應(yīng)用中可優(yōu)選使用新鮮制備的細(xì)胞，但是可通過冷凍細(xì)胞并在計(jì)算機(jī)中輸入信息以使計(jì)算機(jī)登記與樣本相關(guān)聯(lián)來將剩余物冷凍保存和存庫(kù)。即使在無需匹配來源或此類細(xì)胞受體的供體情況下，出于免疫學(xué)目的，庫(kù)系統(tǒng)也使得易于將例如庫(kù)存細(xì)胞期望的生物化學(xué)或遺傳特性與治療要求相匹配。在將期望的特性與庫(kù)存樣本匹配時(shí)，檢索并準(zhǔn)備樣本以供治療使用。還可根據(jù)本發(fā)明將如本文所述制備的細(xì)胞裂解液、ecm或細(xì)胞組分冷凍保存或以其它方式保存(例如通過凍干)并存庫(kù)。提供以下實(shí)施例來更詳細(xì)描述本發(fā)明。這些實(shí)施例旨在說明而非限制本發(fā)明。下列縮寫可出現(xiàn)于實(shí)施例以及說明書和權(quán)利要求的其它地方。促血管生成素2——ang2(或ang2)；抗原遞呈細(xì)胞——apc；腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子——bdnf；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子——bfgf；“每天兩次”(每日兩次)——bid(bid)；細(xì)胞角蛋白18——ck18；中樞神經(jīng)系統(tǒng)——cns；趨化因子受體配體3——cxc配體3；dulbecco極限必需培養(yǎng)基——dmem；含低葡萄糖的dmem——dmem：lg(或dmem：lg，dmem：lg)；乙二胺四乙酸——edta；表皮生長(zhǎng)因子——egf(或e)；熒光激活細(xì)胞分選——facs；胎牛血清——fbs；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子——fgf(或f)；粒細(xì)胞趨化蛋白-2——gcp-2；神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子——gdnf；膠質(zhì)原纖維酸性蛋白——gfap；肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子——hb-egf；人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞——hcaec；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子——hgf；人間充質(zhì)干細(xì)胞——hmsc；肝細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子——hnf-1α；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞——hvvec；趨化因子——i309，以及配體——ccr8受體；胰島素樣生長(zhǎng)因子1——igf-1；白介素-6——il-6；白介素8——il-8；角蛋白19——k19；角蛋白8——k8；角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子——kgf；白血病抑制因子——lif：髓鞘堿性蛋白——mbp；單核細(xì)胞趨化蛋白1——mcp-1；巨噬細(xì)胞衍生趨化因子——mdc；巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α——miplα；巨噬細(xì)胞炎性蛋白1β——mip1β；基質(zhì)金屬蛋白酶(mmp)——mmp；間充質(zhì)干細(xì)胞——msc；正常人真皮成纖維細(xì)胞——nhdf；神經(jīng)祖細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基——npe；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白3——nt3；少突膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)分化標(biāo)記04——04；外周血單核細(xì)胞——pbmc；磷酸鹽緩沖鹽水——pbs；血小板衍生生長(zhǎng)因子c——pdgf-cc；血小板衍生生長(zhǎng)因子d——pdgf-dd；血小板衍生生長(zhǎng)因子bb——pdgfbb；“口服”(經(jīng)口)——po；外周神經(jīng)系統(tǒng)——pns；調(diào)節(jié)激活正常t細(xì)胞表達(dá)和分泌——rantes(或rantes)；重組人生長(zhǎng)和分化因子5——rhgdf-5；皮下——sc；基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α——sdf-1α；音猬因子——shh；標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程——sop；胸腺活化調(diào)節(jié)趨化因子——tarc；組織培養(yǎng)塑料——tcp；組織培養(yǎng)聚苯乙烯——tcps；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2——tgfβ2；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-3——tgfβ-3；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1——timp1；促血小板生成素——tpo；biii微管蛋白——tuj1；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子——vegf；血管性血友病因子——vwf；以及甲胎蛋白——αfp。本發(fā)明通過但不限于以下實(shí)施例進(jìn)一步進(jìn)行說明。實(shí)施例1臍衍生的細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)拯救的效應(yīng)營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞在體外的吞噬活性已完全確認(rèn)得自皇家外科醫(yī)學(xué)院(rcs)大鼠的視網(wǎng)膜色素上皮(rpe)細(xì)胞因mertk基因的無效突變而表現(xiàn)出受損壞的視桿細(xì)胞外節(jié)盤膜(ros)吞噬。(fengw.等人，jbiolchem.2002，10：277(19)：17016-17022)。已示出人臍組織衍生的細(xì)胞(hutc)經(jīng)視網(wǎng)膜下注入rcs大鼠眼中提高視敏度并似乎改善視網(wǎng)膜變性(us2010/0272803)。在該實(shí)施例中，采用源于hutc的條件培養(yǎng)基(cm)處理恢復(fù)了體外營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞中的ros吞噬。檢測(cè)hutc條件培養(yǎng)基：1)以評(píng)估使用新的hutccm制劑對(duì)營(yíng)養(yǎng)不良rpe吞噬作用的影響；2)以從經(jīng)cm-處理和未經(jīng)處理的營(yíng)養(yǎng)不良rpe中分離可接受質(zhì)量的rna以用于由rna-seq實(shí)現(xiàn)的基因表達(dá)譜分析；3)以檢測(cè)所選定rtk配體是否可提高不可使用mertk信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的rcs大鼠的rpe中的吞噬水平；并且4)以測(cè)試激活rtk的不同受體的其它非-rtk配體是否可表現(xiàn)出類似的功能。材料和方法人臍組織衍生的細(xì)胞(hutc)由下文實(shí)施例6-18所述的方法獲得，并且在美國(guó)專利7,524,489和7,510,873，以及美國(guó)公開申請(qǐng)2005/0058634中詳細(xì)描述，所述申請(qǐng)各自以引用方式并入本文。簡(jiǎn)而言之，人臍帶經(jīng)活產(chǎn)后供體同意得自diseaseresearchinterchange(philadelphia，pa)。將組織切碎并經(jīng)酶促方法消化。在采用包含50u/ml膠原酶(sigma，st.louis)的混合物的dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基(dmem)-低葡萄糖(lg)(invitrogen，carlsbad，ca)培養(yǎng)基幾乎完全消化之后，使細(xì)胞懸浮液過濾通過70[tm過濾器，并將上清液以350g離心。將分離的細(xì)胞在dmem-lg中洗滌數(shù)次并以5,000個(gè)細(xì)胞/cm2接種于包含15％(v/v)fbs(hyclone，logan，utah)和4mml-谷氨酰胺(gibco，grandisland，ny)的dmem-lg培養(yǎng)基中。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到約70％匯合時(shí)，使用tryple(gibco，grandisland，ny)傳代細(xì)胞。在幾次傳代之后收獲得到細(xì)胞并存庫(kù)。rpe細(xì)胞的初級(jí)培養(yǎng)物：rpe細(xì)胞獲自6-11天齡的著色的正常(rcsrdy+/p+)(同類系對(duì)照)或營(yíng)養(yǎng)不良(rcsrdy-/p+)大鼠。移除角膜緣之前的眼前部。輕輕地移除視網(wǎng)膜并將眼杯在4％(w/v)分散酶(≥0.8u/mg，rochediagnostics，mannheim，germany)中溫育20-30分鐘。移除rpe片層，使其懸浮于生長(zhǎng)培養(yǎng)基(dmem+10％fbs[新紙材20％]+青霉素(200u/ml)/鏈霉素(200μg/ml))中，利用胰蛋白酶處理進(jìn)行研制，并鋪到8-孔室載玻片孔中或置于24-孔皿的孔中的圓形玻璃蓋片上。將細(xì)胞在37℃和5％v/vco2下孵育。rpe細(xì)胞的磺酰羅丹明染色：使rpe培養(yǎng)物在包含磺酰羅丹明(40μg/ml最終濃度)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中維持24h至72h。在添加ros前36h至48h將細(xì)胞染色。在添加ros前6h至18h移除含有磺酰羅丹明的培養(yǎng)基，使培養(yǎng)物維持于更換數(shù)次的新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。大鼠感光細(xì)胞os的分離：在光照啟動(dòng)后數(shù)小時(shí)，從2-4或6-8周齡的longevans大鼠獲得眼。分離視網(wǎng)膜，用polytron(8mm發(fā)生器)或dounce玻璃勻化器勻化，在27％-50％線性蔗糖梯度頂部分層，并在4℃下以38,000rpm在sw41轉(zhuǎn)子(240,000xg)中離心1小時(shí)。收集頂部的兩個(gè)ros帶，用hbss稀釋，并以7000在hb-4轉(zhuǎn)子(8000xg)中離心10分鐘以沉淀ros。ros的fitc染色：將ros沉淀物以約1ml/沉淀物重懸于無血清的培養(yǎng)基(僅mem基礎(chǔ)培養(yǎng)基)中。添加fitc原液(2mg/ml，0.1m碳酸氫鈉中，ph9.0-9.5)至10μg/ml的最終濃度并在室溫下溫育1h。使經(jīng)fitc-染色的ros通過在微型離心機(jī)中以8000rpm離心沉淀10分鐘，重懸于生長(zhǎng)培養(yǎng)基(mem20)中，計(jì)數(shù)并稀釋至107/ml的最終濃度。hutc條件培養(yǎng)基(cm)：制備三組hutc條件培養(yǎng)基(cm)和對(duì)照培養(yǎng)基并用于在吞噬作用測(cè)定中測(cè)試。1.含血清cm1制劑在第1天，將hutc以5,000個(gè)活細(xì)胞/cm2接種于t75細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶中的hutc生長(zhǎng)培養(yǎng)基(dmem低葡萄糖+15％fbs+4mml-谷氨酰胺)中。將細(xì)胞在37℃和5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。在第2天，吸出培養(yǎng)基，用dpbs洗滌兩次，并且補(bǔ)充21ml的dmem/f12完全培養(yǎng)基(dmem：f12培養(yǎng)基+10％fbs+青霉素(50u/ml)/鏈霉素(50μg/ml))。將細(xì)胞再培養(yǎng)54小時(shí)。另外單獨(dú)將對(duì)照培養(yǎng)基(dmem：f12培養(yǎng)基+10％fbs+青霉素(50u/ml)/鏈霉素(50μg/ml))溫育54h。在第4天，收集細(xì)胞培養(yǎng)上層清液和對(duì)照培養(yǎng)基并以250g在室溫下離心5min，以3ml/管等分至冷凍管中，并且立即冷凍于-70℃冷凍機(jī)中。2.無血清cm1制劑在第1天，將hutc以5,000個(gè)活細(xì)胞/em2接種于t75細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶中的hutc生長(zhǎng)培養(yǎng)基(dmem低葡萄糖+15％fbs+4mml-谷氨酰胺)中。將細(xì)胞在37℃和5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。在第2天，吸出培養(yǎng)基，用dpbs洗滌兩次，并且補(bǔ)充21ml的dmem/f12無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)基(dmem：f12培養(yǎng)基+青霉素(50u/ml)/鏈霉素(50μg/ml))。將細(xì)胞再培養(yǎng)54小時(shí)。另外單獨(dú)將無血清對(duì)照培養(yǎng)基(dmem：f12培養(yǎng)基+青霉素(50u/ml)/鏈霉素(50μg/ml))培養(yǎng)54h。在第4天，收集細(xì)胞培養(yǎng)上層清液和對(duì)照培養(yǎng)基并以250g在室溫下離心5min，以3ml/管等分至冷凍管中，并且立即冷凍于-70℃冷凍機(jī)中。3.cm2制劑制備如同含血清cm1制劑并以5,000個(gè)活細(xì)胞/cm2接種hutc，不同的是細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶為t225燒瓶，每個(gè)燒瓶具有63ml的培養(yǎng)基，并且培養(yǎng)基更換后的孵育時(shí)間為48小時(shí)。4.cm3制備制備如同cm2，不同的是hutc接種密度增大至10,000個(gè)活細(xì)胞/cm2，并且培養(yǎng)基更換后的孵育時(shí)間為48小時(shí)。吞噬測(cè)定：將5×104個(gè)經(jīng)磺酰羅丹明-染色的rpe細(xì)胞鋪到多孔板中，在mem+20％(v/v)fbs中維持6天，然后在測(cè)定前24h維持于mem+5％(v/v)fbs中(每個(gè)樣本2次或更多次平行測(cè)定)。在添加ros前3h添加新鮮培養(yǎng)基，并且測(cè)定通過用fitc-ros(107/ml，在mem+20％(v/v)fbs中)覆蓋培養(yǎng)物而開始并在37℃下孵育3至19h(通常8h)。在孵育結(jié)束時(shí)，劇烈洗滌細(xì)胞以移除未結(jié)合的ros并用2％(w/v)多聚甲醛(sigma，st.louis，mo)固定。在初級(jí)rpe的制備和培養(yǎng)方案、ros的制備、以及吞噬測(cè)定自身方面，最優(yōu)化rpe對(duì)ros的吞噬。rtk配體：使用的rtk配體為：重組人肝配蛋白-b2(目錄號(hào)pro-937，批號(hào)1112pefnb2，prospec-tanytechnogeneltd.，israel)、重組人bdnf(目錄號(hào)248-bd-025/cf，批號(hào)ng4012051，r&dsystems，inc.，minneapolis，mn)、重組人hb-egf(目錄號(hào)259-he-050/cf，批號(hào)ji3012021，r&dsystems，inc.，minneapolis，mn)、重組人hgf(目錄號(hào)phg0254，批號(hào)73197181a，lifetechnologies，carlsbad，ca)、重組人肝配蛋白a4(目錄號(hào)e199，批號(hào)1112r245，leincotechnologies，inc.，st.louis，mo)、以及重組人pdgf-dd(目錄號(hào)1159-sb-025/cf，批號(hào)oth0412071，r&dsystems，inc.，minneapolis，mn)。單個(gè)rtk配體原液的重構(gòu)遵循供應(yīng)商的數(shù)據(jù)表：重組人bdnf和hb-egf分別以100μg/ml和250μg/ml重構(gòu)于無菌pbs中。重組人hgf以500μg/ml重構(gòu)于無菌蒸餾水中。重組人肝配蛋白a4以100μg/ml重構(gòu)于無菌pbs中。重組人pdgf-dd以100μg/ml重構(gòu)于無菌4mmhcl中。將重構(gòu)原液等分并冷凍于-70℃的冷凍機(jī)中。將培養(yǎng)基更換成mem+5％(v/v)fbs(mem5)，并將配體以200ng/ml添加至營(yíng)養(yǎng)不良細(xì)胞中，孵育24h，然后在配體存在下添加ros，并且使細(xì)胞經(jīng)受吞噬測(cè)定。作為對(duì)照，將正常rpe的平行測(cè)定預(yù)孵育于mem5中并測(cè)定吞噬作用。非rtk配體：使用的非rtk配體為：重組人玻連蛋白(目錄號(hào)2308-vn-050，批號(hào)nbh0713021，r&dsystems，inc.，minneapolis，mn)、重組人tgf-β1(目錄號(hào)240-b-010/cf，批號(hào)av5412113，r&dsystems，inc.，minneapolis，mn)、重組人il-6(目錄號(hào)206-il-010/cf，批號(hào)ojz0712041，r&dsystems，inc.，minneapolis，mn)、以及人內(nèi)皮素-1(目錄號(hào)hor-307，批號(hào)1211pedn112，prospec-tanytechnogeneltd.，israel)。單個(gè)非rtk配體原液的重構(gòu)遵循供應(yīng)商的數(shù)據(jù)表：重組人玻連蛋白和il-6分別以100μg/ml重構(gòu)于無菌pbs中。重組人tgf-β1以100μg/ml重構(gòu)于無菌4mmhcl中。重組人內(nèi)皮素-1以100μg/ml重構(gòu)于無菌18mω-cmh2o中。將重構(gòu)原液等分并冷凍于-70℃的冷凍機(jī)中。條件培養(yǎng)基的吞噬拯救活性的測(cè)定：將平行測(cè)定的營(yíng)養(yǎng)不良(d)rpe用1ml的各個(gè)條件培養(yǎng)基孵育約24h。對(duì)于對(duì)照，將平行測(cè)定的同類系對(duì)照(n)rpe的在對(duì)照培養(yǎng)基(dmem：f12培養(yǎng)基+10％fbs+青霉素(50u/ml)/鏈霉素(50μg/ml))中孵育相同的時(shí)間。在孵育之后，移除條件培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基，用新鮮mem5替代，并且使rpe經(jīng)受吞噬測(cè)定。檢查非-rtk配體對(duì)rcsrpe細(xì)胞吞噬影響的測(cè)定：將hutccm3用作測(cè)定的陽(yáng)性對(duì)照。為測(cè)試內(nèi)皮素-1、tgf-β1和il-6，將營(yíng)養(yǎng)不良(d)rpe用1ml的各個(gè)條件培養(yǎng)基孵育24h。然后移除條件培養(yǎng)基，用新鮮的mem+5％(v/v)fbs(mem5)替代并經(jīng)受吞噬測(cè)定(在mem5中喂養(yǎng)ros共8h)。就其它對(duì)照而言，將正常和營(yíng)養(yǎng)不良rpe在mem5中孵育24h并經(jīng)受吞噬測(cè)定。將營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞在mem5中用200ng/ml的重組人內(nèi)皮素-1、tgf-β1或il-6孵育24h，然后在將ros添加到包含重組人內(nèi)皮素n-1、tgf-β1或il-6的mem5中時(shí)使其經(jīng)受吞噬測(cè)定(在添加ros時(shí)不更換培養(yǎng)基)。為測(cè)試玻連蛋白，將ros用對(duì)照培養(yǎng)基(dmem+10％fbs)或條件培養(yǎng)基在37℃的co2細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)箱中預(yù)溫育24h。平行地，在37℃的co2細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)箱中，將ros在具有各種濃度的人重組玻連蛋白(4、2、1、0.5μg/ml)的mem+20％(v/v)fbs(mem20)中分別預(yù)溫育24h。在溫育之后，將ros離心而無需洗滌，重懸于mem20中并在mem5存在下喂飼給營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞以進(jìn)行吞噬測(cè)定。就對(duì)照而言，將單獨(dú)的正常rpe或單獨(dú)的營(yíng)養(yǎng)不良rpe在mem20中培養(yǎng)，然后在未經(jīng)處理的ros存在下(重懸于mem20中并喂飼給rpe細(xì)胞)更換成mem5以進(jìn)行吞噬測(cè)定。成像和定量：通過相差顯微鏡和熒光顯微鏡使用配備有落射熒光光學(xué)、熒光顯微鏡和數(shù)碼相機(jī)的倒置顯微鏡檢查活rpe細(xì)胞。與細(xì)胞表面結(jié)合的fitc-ros，攝取的fitc-ros，以及異噬溶酶體如在mclaren等人(investophthalmolvissci.，1993；34(2)：317-326.)中所定義的那樣鑒定。結(jié)合和攝取的ros的定量在蓋玻片上固定的細(xì)胞上進(jìn)行。計(jì)數(shù)采用適當(dāng)?shù)倪^濾器和網(wǎng)格(視野尺寸，40×40μm)以250×放大倍數(shù)進(jìn)行。計(jì)數(shù)各種類型細(xì)胞的代表性視野(每種培養(yǎng)物10至15個(gè))，并且將數(shù)據(jù)表示為得自2-3個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的合并值的平均值。統(tǒng)計(jì)顯著性由student的t檢驗(yàn)評(píng)估，并且認(rèn)為是p＜0.05。測(cè)定接受判據(jù)：實(shí)驗(yàn)中的絕對(duì)吞噬水平根據(jù)多個(gè)因素而變化，包括分離rpe的質(zhì)量和制備的ros。已盡力使用相同譜系的rpe(即收獲和制備的時(shí)間)，用于比較不同處理對(duì)細(xì)胞的影響。如果正常rpe的吞噬水平相比于營(yíng)養(yǎng)不良rpe的關(guān)系為約1∶0.3，則判定測(cè)定合法。相對(duì)吞噬：相對(duì)吞噬是營(yíng)養(yǎng)不良rpe相比于作為基準(zhǔn)點(diǎn)的同類系對(duì)照(正常)示出的吞噬水平。吞噬水平可表示為ros的平均數(shù)/視野，或表示為ros的平均數(shù)/細(xì)胞。rna的分離.將hutc以5,000個(gè)細(xì)胞/cm2接種并使其生長(zhǎng)于包含15％(v/v)fbs(hyclone，logan，utah)和4mml-谷氨酰胺(gibco，grandisland，ny)的dmem-lg培養(yǎng)基中24小時(shí)，接著將培養(yǎng)基更換為包含10％(v/v)fbs的dmem：f12培養(yǎng)基并再生長(zhǎng)48小時(shí)。然后收集細(xì)胞，以使用qiagenrnaeasy提取和柱上dnase試劑盒(qiagen，valencia，ca)進(jìn)行總rna提取和dna移除。使用nanodrop1000分光光度計(jì)(thermofisherscientific，′waltham，ma)和agilent2100生物分析儀(agilenttechnologies，santaclara，ca)測(cè)定樣本中rna的完整性和量。文庫(kù)制備和測(cè)序通過expressionanalysisinc.，durham，nc進(jìn)行。rna文庫(kù)使用illumina′struseqrna-seqsampleprep試劑盒根據(jù)制造商的說明書制備，并且利用illumina′shiseq2000測(cè)序。用第6.1版arraystudio軟件將測(cè)序讀取作圖到參考人類基因組(grch37patch8)上。使用每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段(fragmentsperkilobaseoftranscriptpermillionmappedreads，fpkm)計(jì)算基因表達(dá)。在分離之后，將首先rcsrpe細(xì)胞一式三份接種到96-孔板中約一周，將培養(yǎng)基更換成hutc條件培養(yǎng)基或?qū)φ张囵B(yǎng)基時(shí)的時(shí)間點(diǎn)視為0h。使用trizol(lifetechnologies，carlsbad，ca)根據(jù)制造商的方案分別在2、4、8和24h提取rna。將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)一式三份提取的rna合并為一個(gè)樣本。采用分光光度法連同260/280吸光度比測(cè)定樣本的濃度。平行測(cè)定的營(yíng)養(yǎng)不良rpe(各約2.4×104個(gè))用或不用條件培養(yǎng)基處理，如以下方案所示：結(jié)果條件培養(yǎng)基測(cè)試采用營(yíng)養(yǎng)不良rpe測(cè)試三種條件培養(yǎng)基制劑(cm1、cm2、cm3)的吞噬拯救活性并與正常rpe相比較，如方法中所描述的那樣。cm1：將cm1測(cè)試兩次(圖1a和1b)，一次使用棕褐色正常rpe，并且再一次使用著色的rpe。觀察吞噬拯救活性。應(yīng)當(dāng)指出，在圖1a中，著色的營(yíng)養(yǎng)不良rpe中的基礎(chǔ)吞噬水平幾乎為棕褐色盔狀正常rpe的水平的50％，其落在了可接受的范圍(＜30％正常吞噬水平)之外。還測(cè)試了無血清cm1培養(yǎng)基的效應(yīng)(圖2)。具有和不具有無血清cm1的營(yíng)養(yǎng)不良細(xì)胞之間的差異有統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性。cm2：測(cè)試cm2并且發(fā)現(xiàn)沒有活性(圖3)。cm3：在第1天更換培養(yǎng)基之后，cm2(無活性)的孵育時(shí)間為48h，而cm1(活性)的孵育時(shí)間為54h。為獲得活性條件培養(yǎng)基，初始細(xì)胞接種密度和培養(yǎng)基更換后的細(xì)胞孵育時(shí)間是要考慮的兩個(gè)方面。cm3通過將細(xì)胞接種密度加倍來制備，其具有相比于cm2相同的培養(yǎng)基更換后的孵育時(shí)間。將cm3測(cè)定多次以確認(rèn)活性的存在(圖4a、4b、4c)，并且其示出達(dá)至100％的吞噬拯救活性。rcsrpe中的吞噬作用在體外培養(yǎng)從rcs大鼠眼分離的rpe細(xì)胞以進(jìn)行吞噬測(cè)定。將得自正常同類系對(duì)照大鼠眼的未經(jīng)處理的rpe細(xì)胞用作對(duì)照以示出正常的吞噬水平。當(dāng)將rcsrpe與hutc共培養(yǎng)(圖4a)或用hutc條件培養(yǎng)基(cm)處理(圖4b)時(shí)，rcsrpe中有缺陷的吞噬恢復(fù)至正常rpe的水平。當(dāng)細(xì)胞用經(jīng)hutccm預(yù)溫育的os喂養(yǎng)并在不存在hutccm時(shí)經(jīng)受吞噬作用時(shí)，rcsrpe對(duì)os的吞噬得到恢復(fù)(圖4c)。如所示的hutc分泌特定因子以促進(jìn)rpe吞噬。rtk配體測(cè)定bdnf和hb-egf測(cè)定：將一式兩份的營(yíng)養(yǎng)不良rpe連同正常對(duì)照用bdnf和hb-egf處理并如方法中所述的那樣測(cè)定吞噬(圖5a，5b)。對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行十至十二次觀察。相比于正常細(xì)胞，營(yíng)養(yǎng)不良細(xì)胞趨于示出比平常更高的吞噬速率，但這并不妨礙對(duì)結(jié)果的解釋。bdnf示出比cm3更高的吞噬救援活性。pdgf-dd、肝配蛋白a4和hgf測(cè)定：每次取樣計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)以每個(gè)視野(圖6a，6c，6d)和每個(gè)細(xì)胞兩者(圖6b，6e)兩者表示。結(jié)果不受影響，因?yàn)閷?duì)每個(gè)框架計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)是恒定的。pdgf-dd(圖6a)、肝配蛋a4(圖6c)和hgf(圖6d)相比于未經(jīng)處理的對(duì)照均使?fàn)I養(yǎng)不良rpe細(xì)胞的吞噬上調(diào)。pdgf-dd示出最大救援效應(yīng)，比cm3更大。肝配蛋白b2測(cè)定：肝配蛋白b2示出比cm3更高的極高吞噬救援活性。對(duì)每個(gè)視野(圖7a)和每個(gè)細(xì)胞(圖7b)的結(jié)果均進(jìn)行測(cè)定。非rtk配體測(cè)定內(nèi)皮素-1、tgf-β1或il-6對(duì)rcsrpe吞噬作用的影響：將營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞連同正常對(duì)照用內(nèi)皮素-1、tgf-β1或il-6處理并如材料和方法中所述的那樣測(cè)定吞噬作用(圖8a-8c)。對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行十次觀察。圖8a和8b示出兩個(gè)單獨(dú)測(cè)定。圖8b中正常和營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞的基礎(chǔ)吞噬水平低于圖8a，原因是從大鼠分離的細(xì)胞變異并且ros的制備不同；測(cè)定被視為有效，因?yàn)檎＜?xì)胞相比于營(yíng)養(yǎng)不良細(xì)胞的吞噬水平的關(guān)系為1∶0.3。為與圖8a的結(jié)果比較，將圖8c中的數(shù)據(jù)歸一化成使得正常和營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞的吞噬水平與圖8a的那些相同。hutccm3增大營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞的吞噬作用，而測(cè)定中測(cè)試濃度(200ng/ml)的內(nèi)皮素-1、tgf-β1或il-6不對(duì)rcsrpe吞噬作用有影響。玻連蛋白對(duì)rcsrpe吞噬作用的影響：將營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞連同正常對(duì)照用經(jīng)各種濃度玻連蛋白預(yù)溫育的ros喂養(yǎng)并如材料和方法中所述的那樣測(cè)定吞噬作用(圖9)。對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行十次觀察。就用于研究的對(duì)照培養(yǎng)基和hutc條件培養(yǎng)基而言，對(duì)照培養(yǎng)基包含10％fbs，對(duì)照培養(yǎng)基中玻連蛋白的量為約500ng/ml。hutc條件培養(yǎng)基可包含相比于對(duì)照培養(yǎng)基更多的玻連蛋白，原因是hutc組成性分泌玻連蛋白。相比于用hutccm3預(yù)處理的ros，用對(duì)照培養(yǎng)基預(yù)處理的ros似乎對(duì)營(yíng)養(yǎng)不良rpe的吞噬作用沒有影響。所有測(cè)試濃度下的玻連蛋白具有與對(duì)照培養(yǎng)基類似的效應(yīng)。這些結(jié)果符合先前出版物(edwards等人，jcellphysiol.1986，127：293-296；miceli等人，investophthalmolvissci.，1997；38(8)：1588-1597)中報(bào)道的結(jié)果。玻連蛋白是血清的活性組分并且負(fù)責(zé)人供體眼中分離的培養(yǎng)rpe細(xì)胞經(jīng)血清刺激而攝入ros(miceli等人，1997)。然而，對(duì)于大鼠rpe細(xì)胞，血清對(duì)正常rpe的吞噬作用的影響相比于營(yíng)養(yǎng)不良rcsrpe是不同的。edwards等人示出培養(yǎng)的rcs大鼠rpe細(xì)胞和正常同類系對(duì)照rpe細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中吞噬得比相當(dāng)?shù)妮^低量ros。培養(yǎng)基中20％血清的存在顯著增大了(6倍)正常rpe細(xì)胞的吞噬作用，但并未增大rcsrpe細(xì)胞的吞噬作用(edwards等人，jcellphysiol.1986，127：293-296)?，F(xiàn)有結(jié)果指示玻連蛋白不參與rcsrpe細(xì)胞中的hutccm介導(dǎo)的吞噬增強(qiáng)。從經(jīng)條件培養(yǎng)基處理的營(yíng)養(yǎng)不良rpe中分離rna如方法中所述的那樣進(jìn)行幾輪該實(shí)驗(yàn)以獲得需要的rna樣本。使用rna樣本以通過expressionanalysis，inc進(jìn)行rna測(cè)序。對(duì)于實(shí)驗(yàn)1，樣本8和9的rin得分并不滿足rna測(cè)序判據(jù)。從序列表中除去這兩種樣本。對(duì)于實(shí)驗(yàn)2，樣本1的rin得分并不滿足rna測(cè)序判據(jù)并將其從序列表中除去(測(cè)序結(jié)果見下)。實(shí)驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)2管260/280濃度體積量rin未經(jīng)處理的對(duì)照2.11145ng/μl19μl2.8μg1.02h對(duì)照2.00153ng/μl19μl2.9μg9.12hcm32.04237ng/μl19μl4.5μg8.74h對(duì)照2.00120ng/μl19μl2.3μg8.84hcm32.05179ng/μl19μl3.4μg9.18h對(duì)照2.13158ng/μl19μl3.0μg9.08hcm32.20181ng/μl19μl3.4μg9.424h對(duì)照2.07124ng/μl19μl2.4μg8.824hcm32.20154ng/μl19μl2.9μg8.1通過以rna-seq為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜分析hutc，顯示出hutc表達(dá)rtk配體和橋分子的基因。檢測(cè)15個(gè)rtk亞族的多個(gè)rtk配體的基因表達(dá)(表1-1)?；诿壳€(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段(fpkm)值，對(duì)各個(gè)rtk亞族的rtk配體基因的表達(dá)水平進(jìn)行分類并作圖(圖10；表1-1)。也檢測(cè)了包括mfg-e8、gas6、蛋白質(zhì)s、tsp-1和tsp-2的橋分子的基因表達(dá)(表1-3)。rcsrpe中對(duì)應(yīng)rtk亞族和橋分子受體的基因表達(dá)示出rtk超級(jí)族可基于激酶結(jié)構(gòu)域序列分為20個(gè)亞族(robinsondr等人，oncogene.2000；19(49)：5548-5557)。在rcsrpe中檢測(cè)20個(gè)rtk亞族中的18個(gè)的基因表達(dá)(表1-2)。在18個(gè)中有15個(gè)rtk亞族對(duì)應(yīng)于hutc中表達(dá)的rtk配體基因。也在rcsrpe中檢測(cè)所報(bào)道的橋分子結(jié)合的受體的基因表達(dá)(kevanybm等人，physiology，2010；25(1)：8-15)(表1-4)，包括整聯(lián)蛋白avp3、avp5、ax1、tyro3、mertk和cd36。表1-1：通過rna-seq鑒定hutc中rtk配體的基因表達(dá)表1-2通過rna-seq鑒定rcsrpe細(xì)胞中rtk配體基因表達(dá)表1-3：通過rna-seq鑒定hutc中橋分子基因表達(dá)表1-4：通過rna-seq鑒定rcsrpe中橋分子受體基因表達(dá)實(shí)施例2hutc條件培養(yǎng)基中的受體酪氨酸激酶(rtk)配體測(cè)量利用rna-seq和信息數(shù)據(jù)分析，rcsrpe細(xì)胞和hutc兩者的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜示出rcsrpe細(xì)胞表達(dá)多個(gè)rtk基因，而hutc表達(dá)多個(gè)rtk配體的基因(表2-1)。與得自正常人真皮成纖維細(xì)胞(nhdf)和arpe-19細(xì)胞的那些相比，在hutc條件培養(yǎng)基中測(cè)量在hutc中的基因表達(dá)水平相對(duì)較高的七個(gè)rtk亞族的rtk配體。這些配體包括bdnf和nt3-trk家族的配體，hgf-met家族的配體，pdgf-dd和pdgf-cc-pdgf家族的配體，肝配蛋白-b2-eph家族的配體，hb-egf-erbb家族的配體，gdnf-ret家族的配體，以及集聚蛋白-musk家族的配體。表2-1：得自轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜分析的rcsrpe細(xì)胞中的rtk基因表達(dá)分類和hutc中的rtk配體基因表達(dá)分類的匯總材料和方法hutc(lotnb12898p7，由pdl20researchbank制得，第7頁(yè))、arpe-19細(xì)胞(第3代)和nhdf(第10代)用于研究。人bdnfelisa試劑盒(目錄號(hào)dbd00，批號(hào)311655，標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)范圍：62.5-4000pg/ml；靈敏度：20pg/ml)、人hgfelisa試劑盒(目錄號(hào)dhg00，批號(hào)307319，標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)范圍：125-8000pg/ml；靈敏度：＜40pg/ml)、人pdgf-ccelisa試劑盒(目錄號(hào)dcc00，批號(hào)309376，標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)范圍：62.5-4000pg/ml；靈敏度：4.08pg/ml)、人pdgf-ddelisa試劑盒(目錄號(hào)ddd00，批號(hào)310518，標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)范圍：31.3-2000pg/ml；靈敏度：1.67pg/ml)得自r&dsystems，inc.，minneapolis，mn。hb-egfelisa試劑盒(目錄號(hào)ab100531，批號(hào)gr135979-1，標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)范圍：16.4-4000pg/ml；靈敏度：20pg/ml)和nt3elisa試劑盒(目錄號(hào)ab100615，批號(hào)gr141281-1，標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)范圍：4.12-3000pg/ml；靈敏度：＜4pg/ml)得自abcam，cambridge，ma。人gdnfelisa試劑盒(目錄號(hào)rab0205，批號(hào)0919130270，標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)范圍：2.74-2000pg/ml；靈敏度：2.74pg/ml)得自sigma，st.louis，mi。人肝配蛋白-b2elisa試劑盒(目錄號(hào)mbs916324，批號(hào)r21199424，標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)范圍：15.6-1000pg/ml；靈敏度：15.6pg/ml)和集聚蛋白elisa試劑盒(目錄號(hào)mbs454684，批號(hào)edl201310110，標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)范圍：31.2-2000pg/ml；靈敏度：＜13.6pg/ml)得自mybiosource，inc.，sandiego，ca。hutc、arpe-19和nhdf條件培養(yǎng)基的制備：在第1天，將hutc、arpe-19和nhdf分別以10,000個(gè)活細(xì)胞/cm2接種于t75細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶的15mlhutc生長(zhǎng)培養(yǎng)基(dmem低葡萄糖+15％v/vfbs+4mml-谷氨酰胺)中。將細(xì)胞在37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。在第2天，吸出培養(yǎng)基并補(bǔ)充21ml的dmem/f12完全培養(yǎng)基(dmem/f12培養(yǎng)基+10％v/vfbs+50u/ml青霉素/50μg/ml鏈霉素)。將細(xì)胞再培養(yǎng)48小時(shí)。另外單獨(dú)將對(duì)照培養(yǎng)基(dmem/f12完全培養(yǎng)基)培養(yǎng)48h。在第4天，收集細(xì)胞培養(yǎng)上層清液和對(duì)照培養(yǎng)基并以250g在4℃下離心5min，以0.5ml/管等分至冷凍管中，并且立即冷凍于-70℃冷凍機(jī)中。將冷凍樣本解凍并用于elisa。結(jié)果hutc條件培養(yǎng)基中測(cè)量的所選rtk配體的水平匯總于表2-2中。表2-2：hutc條件培養(yǎng)基中bdnf、nt3、hgf、pdgf-cc、pdgf-dd、gdnf、肝配蛋白-b2、hb-egf和集聚蛋白的濃度也將hutc條件培養(yǎng)基中測(cè)量的所選rtk配體的水平與得自nhdf和arpe-19條件培養(yǎng)基的那些比較(如歸一化為pg/ml/1×106個(gè)細(xì)胞)。相比于nhdf和arpe-19每48h每百萬個(gè)細(xì)胞分別分泌20.4pg/ml和16.2pg/ml的bdnf，hutc每48h每百萬個(gè)細(xì)胞分泌72.7pg/ml的bdnf(圖11a)。對(duì)照培養(yǎng)基中bdnf的量不可檢測(cè)(圖11g)。hutc和nhdf分泌較低量的nt3(圖11b)。arpe-19條件培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中nt3的量不可檢測(cè)。相比于分別得自nhdf和arpe-19的3.9pg/ml和0.4pg/ml，hutc每48h每百萬個(gè)細(xì)胞分泌23.7pg/ml的hgf(圖11c)。對(duì)照培養(yǎng)基中hgf的量不可檢測(cè)(圖11g)。hutccm中pdgf-cc和pdgf-dd的量相比于nhdf和arpe-19cm中的那些示于圖11d和圖11e中。分別在對(duì)照培養(yǎng)基中檢測(cè)到0.3pg/ml的pdgf-cc和3.1pg/ml的pdgf-dd。相比于得自nhdf的8.5pg/ml的gdnf，hutc每48h每百萬個(gè)細(xì)胞分泌9.5pg/ml的gdnf。arpe-19每48h每百萬個(gè)細(xì)胞僅釋放1.3pg/ml的痕量gdnf(圖11f)。對(duì)照培養(yǎng)基中g(shù)dnf的量不可檢測(cè)(圖11g)。hutc、nhdf和arpe-19條件培養(yǎng)基中肝配蛋白-b2和hb-egf的水平低于elisa的檢測(cè)限(分別為15.6pg/ml和20pg/ml)。hutc、nhdf和arpe-19條件培養(yǎng)基中集聚蛋白的水平類似于對(duì)照培養(yǎng)基。使用200ng/ml的劑量在rcsrpe吞噬測(cè)定中所測(cè)試的bdnf、hgf、pdgf-dd、肝配蛋白-b2和hb-egf的效應(yīng)均示出對(duì)拯救rcsrpe細(xì)胞的吞噬有積極效果(實(shí)施例1)。然而，條件培養(yǎng)基中hutc分泌的這些配體的實(shí)際濃度似乎低于測(cè)試水平。實(shí)施例3hutc條件培養(yǎng)基中的橋分子rcsrpe細(xì)胞和hutc兩者的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜均示出rcsrpe細(xì)胞表達(dá)在凋亡細(xì)胞上識(shí)別“吞噬我”信號(hào)的受體的基因(erwigl-p，celldeathanddifferentiation2008；15：243-250)。這些受體包括清道夫受體(sr-a、lox-1、cd68、cd36、cd14)、整聯(lián)蛋白(αvβ3和αvβ5)、ax1和tyro3的受體酪氨酸激酶、lrp-1/cd91、以及ps受體stabilin1。此外，hutc表達(dá)多個(gè)橋分子基因，包括tsp-1、tsp-2、表面活性劑蛋白d(sp-d)、mfg-e8、gas6、載脂蛋白h和膜聯(lián)蛋白1。檢測(cè)hutc條件培養(yǎng)基中橋分子的分泌并將水平與得自arpe-19和正常人真皮成纖維細(xì)胞(nhdf)的那些比較。材料和方法將hutc(pdl20，母本細(xì)胞文庫(kù)號(hào)25126057)、arpe-19細(xì)胞(第3代)(atcc，manassas，va)和nhdf(第11代)(lonza，southplainfield，nj)用于研究。人gas6elisa試劑盒(目錄號(hào)sk00098-01，批號(hào)20111218)和人sp-delisa試劑盒(目錄號(hào)sk00457-01，批號(hào)20111135)得自aviscerabioscience，santaclara，ca。人gas6elisa試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)范圍為62.5-8000pg/ml，靈敏度為31pg/ml。人sp-delisa試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)范圍為78-5000pg/ml，靈敏度為30pg/ml。人mfg-e8elisa試劑盒(目錄號(hào)dfge80，批號(hào)307254，標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)范圍：62.5-4000pg/ml；靈敏度：4.04pg/ml)、人tsp-1elisa試劑盒(目錄號(hào)dtsp10，批號(hào)307182，標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)范圍：7.81-500ng/ml；靈敏度：0.355ng/ml)、以及人tsp-2elisa試劑盒(目錄號(hào)dtsp10，批號(hào)307266，標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)范圍：0.31-20ng/ml；靈敏度：0.025ng/ml)得自r&dsystems，inc.，minneapolis，mn。載脂蛋白helisa試劑盒(目錄號(hào)ab108814，批號(hào)gr126938，標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)范圍：0.625-40ng/ml，靈敏度：0.6ng/ml)得自abcam，cambridge，ma。人膜聯(lián)蛋白i(anx-i)elisa試劑盒(目錄號(hào)mbs704042，批號(hào)n10140947，標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)范圍：0.312-20ng/ml；靈敏度：0.078ng/ml)得自mybiosource，inc.，sandiego，ca。表3-1吞噬細(xì)胞受體、橋分子和凋亡細(xì)胞上吞噬細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的匯總需注意酪氨酸激酶tyro3和ax1也為ps-橋分子受體并與gas6結(jié)合。hutc、arpe-19和nhdf條件培養(yǎng)基的制備：在第1天，將hutc、arpe-19和nhdf分別以10,000個(gè)活細(xì)胞/cm2接種于t75細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶的15mlhutc生長(zhǎng)培養(yǎng)基(dmem低葡萄糖+15％fbs+4mml-谷氨酰胺)中。在37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。在第2天，吸出培養(yǎng)基并補(bǔ)充18ml的dmem/f12完全培養(yǎng)基(dmem：f12培養(yǎng)基+10％fbs+青霉素(50u/ml)/鏈霉素(50μg/ml))。將細(xì)胞再培養(yǎng)48小時(shí)。另外單獨(dú)將對(duì)照培養(yǎng)基(dmem：f12培養(yǎng)基+10％fbs+青霉素(50u/ml)/鏈霉素(50μg/ml))培養(yǎng)48h。在第4天，收集細(xì)胞培養(yǎng)上層清液和對(duì)照培養(yǎng)基并以250g在4℃下離心5min，以0.5ml/管等分至冷凍管中，并立即冷凍于-70℃冷凍機(jī)中。將冷凍樣本解凍并用于elisa。結(jié)果相比于分別得自arpe-19和nhdf的每48h每百萬個(gè)細(xì)胞的7.6ng和17.5ng的mfg-e8，hutc每48h每百萬個(gè)細(xì)胞分泌77.2ng的mfg-e8(圖12a)。hutc條件培養(yǎng)基中mfg-e8的濃度為15.5ng/ml。對(duì)照培養(yǎng)基中mfg-e8的量不可檢測(cè)(圖12e)。相比于得自arpe-19的183.9pg和得自nhdf的1101pg，hutc每48h每百萬個(gè)細(xì)胞分泌352.8pg的gas6(圖12b)。hutc條件培養(yǎng)基中g(shù)as6的濃度為70.6pg/ml。對(duì)照培養(yǎng)基中g(shù)as6的量不可檢測(cè)(圖11g)相比于得自arpe-19的每48h每百萬個(gè)細(xì)胞的4744.68ng的tsp-1和得自nhdf的2487.55ng，hutc每48h每百萬個(gè)細(xì)胞分泌759.2ng的tsp-1(圖12c)。hutc條件培養(yǎng)基中tsp-1的濃度為151.8ng/ml。在對(duì)照培養(yǎng)基中檢測(cè)到4.0ng/ml的tsp-1(圖12e)。相比于得自nhdf的30ng的tsp-2，hutc每48h每百萬個(gè)細(xì)胞分泌44.2ng的tsp-2。arpe-19每48h每百萬個(gè)細(xì)胞釋放0.08ng的可忽略量的tsp-2(圖12d)。hutc條件培養(yǎng)基中tsp-2的濃度為8.8ng/ml。在對(duì)照培養(yǎng)基中檢測(cè)到痕量的tsp-2(0.02ng/ml)(圖12e)。hutc、arpe-19和nhdf條件培養(yǎng)基中載脂蛋白h的水平類似于對(duì)照培養(yǎng)基(6.8ng/ml)。hutc、arpe-19和nhdf條件培養(yǎng)基以及對(duì)照培養(yǎng)基中sp-d和膜聯(lián)蛋白i的水平低于elisa的檢測(cè)限(分別＜30pg/ml和＜78pg/ml)。細(xì)胞不分泌這兩種蛋白質(zhì)，或者該水平低于檢測(cè)限。hutc條件培養(yǎng)基中檢測(cè)的橋分子及其濃度的匯總列于表3-2中。表3-2：hutc條件培養(yǎng)基中檢測(cè)的橋分子的匯總在所測(cè)量的橋分子中，mfg-e8、gas6、tsp-1和tsp-2為參與rcsrpe細(xì)胞中hutc-介導(dǎo)的吞噬拯救的橋分子候選。橋分子調(diào)理的ros的結(jié)合將激活整聯(lián)蛋白和rtk信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，這將補(bǔ)償mertk轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的缺乏，并且導(dǎo)致吞噬拯救。實(shí)施例4hutc條件培養(yǎng)基和橋分子對(duì)rcsrpe細(xì)胞吞噬視桿細(xì)胞外節(jié)盤膜(ros)的影響通過將rcsrpe細(xì)胞用經(jīng)hutc條件培養(yǎng)基預(yù)溫育的ros飼喂來檢測(cè)hutc條件培養(yǎng)基對(duì)ros吞噬的直接影響(us2010/0272803)。營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞的吞噬作用被完全拯救。此處，研究hutc條件培養(yǎng)基中存在或分泌的橋分子的效應(yīng)。目前，ros上鑒定的唯一“吞噬我”信號(hào)為磷脂酰絲氨酸(ps)(finnemann等人，pnas，2012；109(21)：8145-8148)。材料和方法在實(shí)施例1中描述了rpe分離、rpe細(xì)胞的初級(jí)培養(yǎng)、rpe細(xì)胞的磺酰羅丹明染色、大鼠ros的分離、ros的fitc染色、吞噬測(cè)定、成像和定量、測(cè)定接受判據(jù)以及相對(duì)吞噬水平的方法。hutc條件培養(yǎng)基(cm)：hutccm3用于研究。在第1天，將hutc以10,000個(gè)活細(xì)胞/em2接種于t75細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶中的hutc生長(zhǎng)培養(yǎng)基(dmem低葡萄糖+15％fbs+4mml-谷氨酰胺)中。在37℃5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。在第2天，吸出培養(yǎng)基并補(bǔ)充21ml的dmem/f12完全培養(yǎng)基(dmem：f12培養(yǎng)基+10％fbs+青霉素(50u/ml)/鏈霉素(50μg/ml))。將細(xì)胞再培養(yǎng)48小時(shí)。另外單獨(dú)將對(duì)照培養(yǎng)基(dmem：f12培養(yǎng)基+10％fbs+青霉素(50u/ml)/鏈霉素(50μg/ml))溫育48h。在第4天，收集細(xì)胞培養(yǎng)上層清液和對(duì)照培養(yǎng)基并以250g在室溫下離心5min，以3ml/管等分至冷凍管中，并且立即冷凍于-70℃冷凍機(jī)中。重組人橋分子：重組人mfg-e8(目錄號(hào)2767-mf-050，批號(hào)mpp2012061)、重組人gas6(目錄號(hào)885-gs-050，批號(hào)gnt5013011)、重組人tsp-1(目錄號(hào)3074-th-050，批號(hào)mvf3613041)、重組人tsp-2(目錄號(hào)1635-t2-050，批號(hào)huz1713021)均獲自于r&dsystems，inc.，minneapolis，mn。單個(gè)蛋白質(zhì)原液的重構(gòu)遵循供應(yīng)商的數(shù)據(jù)表：重組人mfg-e8、tsp-1和tsp-2分別以100μg/ml重構(gòu)于無菌pbs中。重組人gas6以100μg/ml重構(gòu)于無菌水中。將重構(gòu)原液等分并冷凍于-70℃的冷凍機(jī)中。橋分子對(duì)rcsrpe細(xì)胞吞噬作用的影響：將ros用對(duì)照培養(yǎng)基(dmem+10％fbs)或cm3在37℃的co2細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)箱中預(yù)溫育24h。平行地，在37℃的co2細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)箱中，將ros在具有各種濃度的人重組mfg-e8、gas6、tsp-1或tsp-2的對(duì)照培養(yǎng)基中預(yù)溫育24h。在溫育之后，將ros離心而無需洗滌，重懸于mem5中并在mem5存在下喂飼給營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞以進(jìn)行吞噬測(cè)定。就對(duì)照而言，將單獨(dú)的正常rpe或單獨(dú)的營(yíng)養(yǎng)不良rpe在mem20中培養(yǎng)，然后在未經(jīng)處理的ros存在下(重懸于mem20中并喂飼給rpe細(xì)胞)更換成mem5以進(jìn)行吞噬測(cè)定。rtk配體對(duì)rcspre細(xì)胞吞噬作用的影響：將rcsrpe用重組人bdnf、hgf和gdnf各自溫育24小時(shí)，然后添加os進(jìn)行吞噬測(cè)定。將用hutccm孵育的rcsrpe用作陽(yáng)性對(duì)照。sirna敲低：on-targetplus人sirna-smartpools(針對(duì)bdnf、hgf、gdnf、mfg-e8、gas6、tsp-1和tsp-2)以及on-targetplusnon-targetingpool(混雜sirna庫(kù))購(gòu)自gedharmacon(lafayette，co)。使用dharmafect轉(zhuǎn)染試劑(gedharmacon)分別將25nm的各個(gè)sirna庫(kù)引入hutc中。用于免疫熒光染色的抗體：橋分子(人mfg-e8、gas6、tsp-1和tsp-2)的未綴合的單克隆抗體以及小鼠igg2a和igg2b同種型對(duì)照抗體獲自于r&dsystems，inc.，minneapolis，mn。通過lifetechnologies將這些抗體與talexafluor488熒光團(tuán)(eugene，or)綴合。通過lifetechnologies(eugene，or)將未綴合的單克隆抗視紫紅質(zhì)抗體(emdmilliporecorp.，temeculaca)與alexafluor568綴合。未綴合的小鼠igg2b、x同種型對(duì)照抗體單克隆獲自于biolegendinc.(sandiego，ca)并通過liftechnologies(eugene，or)與alexafluor488熒光團(tuán)綴合。將其用作alexafluor568綴合的抗視紫紅質(zhì)抗體的同種型對(duì)照抗體。將alexafluor488綴合的小鼠igg2a用作alexafluor488綴合的抗人mfg-e8、gas6或tsp-2抗體的同種型對(duì)照抗體。將alexafluor488綴合的小鼠igg2b用作alexafluor488綴合的人tsp-1抗體的同種型對(duì)照抗體。免疫熒光：使10×106個(gè)os在37℃下于1ml的hutccm、1ml的對(duì)照培養(yǎng)基、或1ml的包含124ng/mlmfg-e8、8.75ng/mlgas6、1.2μg/mltsp-1或238ng/mltsp-2的對(duì)照培養(yǎng)基中溫育24個(gè)小時(shí)。使os沉淀，洗滌并包埋在于tissue-teko.c.t化合物(sakurafinetekusa，inc.，torrance，ca)中。使用冰凍切片機(jī)(leicacm1950，leicamicrosystems，inc.，buffalogrove，illinois)獲得10iam系列切片。將切片轉(zhuǎn)移到載玻片上以用于免疫熒光染色。將具有os切片的環(huán)狀點(diǎn)樣用封閉液(10％(v/v)山羊血清、1％(v/v)bsa和0.1％(v/v)triton×100，在pbs中)在室溫下處理1小時(shí)，然后用alexafluor568綴合的抗視紫紅質(zhì)抗體和alexafluor488綴合的抗-mfg-e8、抗-gas6、抗-tsp-1、抗-tsp-2、或小鼠igg2a或igg2b同種型對(duì)照抗體在4℃下雙重染色2小時(shí)。在用pbs洗滌三次之后，將切片封固于vectashield封固劑(vectorlaboratories，inc.，burlingame，ca)中并用配備有熒光顯微鏡的zeissphotomicroscopeiii(carlzeiss，oberkochen，germany)進(jìn)行評(píng)估。圖像用kodak290數(shù)字相機(jī)捕集并用kodakmicroscopydocumentationsystem290photoshop圖像分析軟件(eastmankodak，rochester，ny)分析。圖像以250×放大倍數(shù)利用適當(dāng)?shù)倪^濾器得到。結(jié)果如圖13a和13b(實(shí)驗(yàn)1)以及圖13c和13d(實(shí)驗(yàn)2)所示，未經(jīng)處理的營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞相比于正常rpe細(xì)胞吞噬減少。在測(cè)定期間不存在hutc條件培養(yǎng)基的情況下，用hutc條件培養(yǎng)基預(yù)孵育的營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞完全拯救了吞噬。無論營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞是否用hutc條件培養(yǎng)基預(yù)處理，在整個(gè)吞噬測(cè)定中存在hutc條件培養(yǎng)基時(shí)均觀察到吞噬更為強(qiáng)勁的增強(qiáng)。用經(jīng)hutc條件培養(yǎng)基預(yù)處理的ros喂養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞在測(cè)定期間不存在hutc條件培養(yǎng)基時(shí)顯示出吞噬的恢復(fù)。營(yíng)養(yǎng)不良rpe細(xì)胞用經(jīng)各種濃度的mfg-e8(15.5ng/ml；31ng/ml；62ng/ml；124ng/ml)、gas6(70pg/ml；350pg/ml；1750pg/ml；8750pg/ml)、tsp-1(152ng/ml；304ng/ml；608ng/ml；1216ng/ml)或tsp-28.8ng/ml；26.4ng/ml；79.2ng/ml；237.6ng/ml)預(yù)溫育的ros喂養(yǎng)并測(cè)定吞噬作用(圖14a-14d)。對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行十次觀察。ros的吞噬作用通過用經(jīng)mfg-e8、gas6、tsp-1或tsp-2預(yù)溫育的ros喂養(yǎng)rcsrpe細(xì)胞得到拯救。mfg-e8、gas6、tsp-1和tsp-2中的每者劑量依賴性地增大rcsrpe細(xì)胞中的吞噬水平(圖14e-14h)。相似地，bdnf、hgf和gdnf以劑量依賴性增大rcsrpe細(xì)胞中的吞噬水平，hgf的效應(yīng)即使在劑量最低時(shí)也是最強(qiáng)的。當(dāng)以較高濃度施用時(shí)，rbdnf、hgf和gdnf能夠拯救rcsrpe中的吞噬作用(圖14i-j)。這些結(jié)果示出，重組的rtk配體和橋分子蛋白可模擬hutccm的作用并恢復(fù)rcsrpe的吞噬作用，并且參與rcsrpe中的hutc-介導(dǎo)的吞噬拯救。bdnf、hgf、gdnf、mfg-e8、gas6、tsp-1和tsp-2通過sirna介導(dǎo)的基因沉默而在hutc中敲低。將不靶向任何基因的混雜sirna庫(kù)用作敲低對(duì)照。通過測(cè)量從經(jīng)sirna轉(zhuǎn)染的hutc中收集的細(xì)胞培養(yǎng)上層清液中各個(gè)因子的水平，檢測(cè)各個(gè)因子的敲低效率(圖15a)。模擬或混雜sirna轉(zhuǎn)染對(duì)hutc分泌這些因子沒有影響。定向mfg-e8、tsp-1、tsp-2和hgf的sirna得到幾乎100％的敲低效率；bdnf和gdnf分別觀察到80％和65％的敲低(圖15a)。hutc中定向gas6的sirna不發(fā)揮作用(數(shù)據(jù)未示出)。cm由sirna-轉(zhuǎn)染的hutc產(chǎn)生并將其施用于rcsrpe以鑒定rtk配體和橋分子敲低的效應(yīng)。rcsrpe用經(jīng)定向bdnf、hgf或gdnf的sirna轉(zhuǎn)染的hutc所產(chǎn)生的cm培養(yǎng)(圖15b)，或者用經(jīng)定向mfg-e8、tsp-1或tsp-2的sirna轉(zhuǎn)染的hutc所產(chǎn)生的cm預(yù)處理的os喂養(yǎng)(圖15c)。將由未轉(zhuǎn)染的hutc和混雜sirna轉(zhuǎn)染的hutc制得的cm用作敲低對(duì)照cm。與敲低對(duì)照cm相比，各個(gè)rtk配體的單獨(dú)敲低消除了hutccm對(duì)吞噬拯救的影響(圖15b)。各個(gè)橋分子的敲低減少了rcsrpe對(duì)os的吞噬(圖15c)。這些rtk配體和橋分子為rcsrpe中hutc-介導(dǎo)的吞噬拯救所需。每種單獨(dú)橋分子和視紫紅質(zhì)的雙重染色確保了對(duì)os評(píng)估。視紫紅質(zhì)是定位于感光細(xì)胞os中的視色素并且是os染色的標(biāo)志(szabok等人celltissueres.2014；356(1)：49-63)。與單獨(dú)重組人橋分子一起預(yù)溫育的視紫紅質(zhì)染色的(alexafluor568綴合的，紅色)微粒對(duì)四種橋分子抗體(alexafluor488綴合的，綠色)中的每者均呈正染，但不對(duì)alexafluor488綴合的小鼠igg2a或igg2b同種型對(duì)照抗體染色呈正染(圖16a)。類似的結(jié)果獲自用hutccm溫育的os(圖16b)，而就對(duì)照培養(yǎng)基溫育的os而言并未觀察到任何橋分子的染色(圖16c)?？挂曌霞t質(zhì)抗體的特異性通過用alexafluor568綴合的抗視紫紅質(zhì)抗體和alexafluor488綴合的小鼠igg2b、x同種型對(duì)照抗體對(duì)os微粒雙重染色加以證實(shí)。os僅對(duì)抗視紫紅質(zhì)抗體呈正染(圖16d)。hutccm中橋分子mfg-e8、gas6、tsp-1和tsp-2與os上的視紫紅質(zhì)共同定位展示出橋分子結(jié)合于os。實(shí)施例5hutc保護(hù)rpe免受氧化性損傷氧化應(yīng)激反應(yīng)可損害視網(wǎng)膜色素上皮的健康。研究hutc和hutc條件培養(yǎng)基改善暴露于氧化性損傷的rpe細(xì)胞的健康的效應(yīng)。材料和方法過氧化氫(h2o2)、結(jié)晶紫和噻唑藍(lán)溴化四唑(mtt)獲自于sigma-aldrich(stlouis，mo)。ham的f10培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液(5000單位/ml青霉素/5000μg/ml鏈霉素)、胰蛋白酶-edta溶液(0.05％)、低葡萄糖dmem、l-谷氨酰胺200mm獲自于lifetechnologies。hyclonefbs和甲醛購(gòu)自thermoscientific。異丙醇、冰醋酸和鹽酸購(gòu)自fisherscientific(pittsburgh，pa)。乙醇獲得于deconlabsinc.(kingofprussia，pa)。pbs獲自于lonza(southplainfield，nj)。arpe生長(zhǎng)培養(yǎng)基：使含有4.5g/l葡萄糖和丙酮酸鈉而無l-谷氨酰胺和酚紅的dmem(mediatech，inc.acorningsubsidiary，manassas，va)補(bǔ)充5％或10％加熱滅活的胎牛血清(fbs，lifetechnologies，grandisland，ny)、1x極限必需培養(yǎng)基-非必需氨基酸(mem-neaa，lifetechnologies)和0.01mg/ml慶大霉素試劑溶液(lifetechnologies)。包含10μma2e的5％arpe生長(zhǎng)培養(yǎng)基：使dmem(mediatech，inc.)補(bǔ)充5％加熱滅活的fbs(lifetechnologies)、1xmem-neaa(lifetechnologies)、0.01mg/ml慶大霉素試劑溶液(lifetechnologies)和10μma2e(由dr.janetsparrow的實(shí)驗(yàn)室制備)。hutc完全培養(yǎng)基：使dmem低葡萄糖(lifetechnologies)補(bǔ)充15％fbs(thermoscientific，logan，utah)和4mml-谷氨酰胺(lifetechnologies)。hutcfbs培養(yǎng)基：使dmem(mediatech，inc.)補(bǔ)充5％或10％加熱滅活的fbs(lifetechnologies)、1xmem-neaa(lifetechnologies)、0.01mg/ml慶大霉素試劑溶液(lifetechnologies)和4mml-谷氨酰胺(mediatech，inc.)。hutc條件培養(yǎng)基：在37℃和5％co2下，將hutc(researchbanknb12898p6，pdl20)以5000個(gè)細(xì)胞/cm2接種于2個(gè)t75培養(yǎng)燒瓶的hutc完全培養(yǎng)基(15ml)中。在接種后24小時(shí)，從各個(gè)燒瓶中移除培養(yǎng)基并用15ml1xdulbecco′s磷酸鹽緩沖鹽水(dpbs)洗滌3次。在第三次洗滌之后，將15ml的5％或10％fbshutc培養(yǎng)基添加到各個(gè)燒瓶中。也將15ml的5％或10％fbshutc培養(yǎng)基添加到2個(gè)空的t75燒瓶中并充當(dāng)對(duì)照。使所有燒瓶返到37℃和5％co2條件共48小時(shí)。在48小時(shí)之后，從各個(gè)燒瓶移除培養(yǎng)基并以250xg在4℃下離心5分鐘。將培養(yǎng)基置于冰上并然后等分試樣并在-80℃下保存。用于a2e研究的arpe-19細(xì)胞培養(yǎng)物：在第1天，將arpe-19細(xì)胞以40,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于8-孔nunctmlab-tektmii室玻片(nalgenuncinternationalcorporation，rochester，ny)中的最終體積為300μl的10％arpe生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。在接種后第24小時(shí)(第2天)，移除細(xì)胞上的培養(yǎng)基并用300μl5％arpe生長(zhǎng)培養(yǎng)基替代。在一周后(第9天)，再次移除培養(yǎng)基并用新鮮的5％arpe生長(zhǎng)培養(yǎng)基替代。在第14天，移除培養(yǎng)基并用包含10μma2e的新鮮的5％arpe生長(zhǎng)培養(yǎng)基替代。在第17和21天，再次移除培養(yǎng)基并用新鮮的包含a2e的培養(yǎng)基替代。在第24天，移除包含a2e的培養(yǎng)基并用新鮮的5％arpe生長(zhǎng)培養(yǎng)基替代，并且使細(xì)胞靜置五天。在第29天，從各個(gè)孔移除培養(yǎng)基并用250μl的5或10％hutc條件或?qū)φ张囵B(yǎng)基(5％和10％fbshutc培養(yǎng)基未暴露于細(xì)胞)替代。在第32和35天，從細(xì)胞中移除條件和對(duì)照培養(yǎng)基并用新鮮的條件或?qū)φ张囵B(yǎng)基替代。在第36天，從各個(gè)孔移除所有的培養(yǎng)基并將細(xì)胞用1xdpbs洗滌1次。隨后將200μl新鮮dpbs添加到各個(gè)孔中，并且使細(xì)胞暴露于鎢鹵源傳送的430nm光照中20分鐘。在光暴露之后，移除dpbs并進(jìn)行細(xì)胞生存力測(cè)定。用于a2e研究的mtt測(cè)定：細(xì)胞毒性通過代謝性(mtt，(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物)比色微量滴定測(cè)定(rochediagnosticscorporation，indianapolis，in)來測(cè)量。為進(jìn)行mtt測(cè)定，將20μl的mtt標(biāo)記試劑(rochediagnosticscorporation)加入各個(gè)孔的0.2ml的5％培養(yǎng)基中。在溫育4小時(shí)之后，再將200μl的增溶溶液添加到各個(gè)孔中溫育過夜。在以13,000rpm離心2分鐘之后，通過分光光度法在570nm處測(cè)量上清液(spectamaxmj，moleculardevices，sunnyvale，ca)。減少的mtt在570nm處吸光度的減小表示細(xì)胞生存力減弱。數(shù)據(jù)用prism軟件分析。用于a2e研究的死亡紅(deadredassay)測(cè)定：在通過熒光排斥法測(cè)定(fluorescenceexclusionassay)標(biāo)記之后定量未存活的細(xì)胞，該熒光排斥法測(cè)定因在細(xì)胞死亡后期階段期間質(zhì)膜的完整性喪失而允許標(biāo)記凋亡的核。在光照暴露之后，使細(xì)胞返回到5％arpe生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。在藍(lán)光暴露后八小時(shí)，將死亡細(xì)胞的核用不可滲透膜的染料死亡紅(deadred，lifetechnologies；1/500稀釋，15min溫育)染色并將所有核用4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚(dapi)(lifetechnologies)染色。簡(jiǎn)而言之，將細(xì)胞用預(yù)溫?zé)岬?37℃)hank平衡鹽溶液(1x)hbss(lifetechnologies)洗滌兩次。在室溫下將250μl的死亡紅工作液(8μl死亡紅原液+4mlhbss)添加到各個(gè)孔中15分鐘。在15分鐘之后，將細(xì)胞用hbss洗滌兩次。在室溫下，將制備的300μl的4％甲醛(1xdpbs)添加到各個(gè)孔中30分鐘。將細(xì)胞用1xdpbs洗滌3次并在室溫下用dapi(1xdpbs中制備的1∶300)工作液孵育5分鐘。將細(xì)胞用1xdpbs洗滌3次。將玻片固定并蓋上載玻片，并且通過計(jì)數(shù)各個(gè)孔中照明區(qū)域內(nèi)至少5個(gè)顯微鏡視野中的dapi-染色的和死亡紅染色的核進(jìn)行重復(fù)分析。值表示為死亡紅染色的核/dapi染色的核×100。用于h2o2研究的細(xì)胞培養(yǎng)物：在37℃和5％co2下，使arpe-19細(xì)胞(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(americantypeculturecollection)；manassas，va)在t75燒瓶的包含10％fbs和50單位/ml青霉素/50μg/ml鏈霉素的ham的f10培養(yǎng)基中作為單層生長(zhǎng)。對(duì)于與hutc的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，使arpe19細(xì)胞在t-75燒瓶中生長(zhǎng)至80-90％匯合度并隨后接種于24-孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。當(dāng)將培養(yǎng)基更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(ham的f10培養(yǎng)基，補(bǔ)充有2％fbs和50單位/ml青霉素/50μg/ml鏈霉素)時(shí)，使arpe-19細(xì)胞在10％fbs生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)直至接種后第3天。在hutc完全生長(zhǎng)(低葡萄糖dmem，補(bǔ)充有15％fbs和4mml-谷氨酰胺)中，將hutc以5000個(gè)細(xì)胞/em2接種到細(xì)胞培養(yǎng)插入物(孔徑1μm)上24小時(shí)。將插入物轉(zhuǎn)移至在細(xì)胞培養(yǎng)板上生長(zhǎng)的arpe-19細(xì)胞72小時(shí)并在hutc完全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。移除插入物并用在無血清ham的f10培養(yǎng)基中制備的h2o2(0-1500μm)處理arpe-19細(xì)胞9小時(shí)。用于h2o2研究的結(jié)晶紫細(xì)胞生存力測(cè)定：通過結(jié)晶紫攝取測(cè)定相對(duì)細(xì)胞生存力。在處理之后，將細(xì)胞固定于含4％低聚甲醛的pbs中并在0.1％結(jié)晶紫、10％乙醇的溶液中染色。在用水洗滌之后，將剩余的染色劑溶解于10％乙酸中并用微板讀數(shù)器測(cè)量550nm處的吸光度。用于h2o2型究的mtt測(cè)定：將細(xì)胞在37℃下用含0.25mg/mlmtt的無血清培養(yǎng)基孵育3小時(shí)。然后移除培養(yǎng)基并添加酸性異丙醇(1μl濃hcl/1ml異丙醇)以增溶產(chǎn)生的藍(lán)甲(mtt代謝產(chǎn)物)。使用微板讀數(shù)器，利用630nm處的背景波長(zhǎng)測(cè)量550nm處的藍(lán)甲密度。結(jié)果hutc條件培養(yǎng)基使載有a2e的rpe細(xì)胞免受藍(lán)光誘導(dǎo)的損傷。通過用膜不透性染料死亡紅標(biāo)記細(xì)胞并用dapi標(biāo)記所有核來評(píng)估照射后arpe-19的生存力。數(shù)字圖像中計(jì)數(shù)的核提供活細(xì)胞和非活細(xì)胞的百分比(圖17a-17b)。在不存在430nm光照時(shí)，10μma2e對(duì)arpe-19生存力沒有影響。用對(duì)照培養(yǎng)基孵育且經(jīng)受430nm光照的細(xì)胞顯示出高水平的非活細(xì)胞(約50％)。相比之下，用hutc條件培養(yǎng)基處理導(dǎo)致非活細(xì)胞的數(shù)目降低(約20％)。細(xì)胞生存力也通過mtt測(cè)定進(jìn)行測(cè)量，所述mtt測(cè)定基于健康細(xì)胞將黃色四唑嗡鹽mtt裂解成紫色甲晶體的能力(圖17c-17d)。甲產(chǎn)物與培養(yǎng)中的活細(xì)胞數(shù)目成比例。用對(duì)照培養(yǎng)基處理且暴露于光照的arpe-19細(xì)胞顯示出相比于載有10μma2e且未暴露于光照的arpe-19細(xì)胞生存力降低。用5或10％hutc條件培養(yǎng)基處理的細(xì)胞顯示出比暴露于對(duì)照培養(yǎng)基的那些更高的生存力。在全部h2o2處理之后，通過結(jié)晶紫和mtt測(cè)定來測(cè)定arpe19細(xì)胞生存力(圖17e-17f)。與hutc共培養(yǎng)的arpe-19細(xì)胞相比于未經(jīng)處理的對(duì)照細(xì)胞示出在用1500μmh2o2處理之后生存力提高。實(shí)施例6從產(chǎn)后組織中衍生細(xì)胞該實(shí)施例描述由胎盤和臍帶組織制備的產(chǎn)后衍生細(xì)胞。產(chǎn)后臍帶和胎盤在足月或者早產(chǎn)妊娠出生時(shí)獲得。從五個(gè)獨(dú)立的臍和胎盤組織的供體收獲得到細(xì)胞。測(cè)試不同的細(xì)胞分離方法得到如下細(xì)胞的能力：1)分化成具有不同表型的細(xì)胞的潛力(干細(xì)胞的共同特征)；或者2)提供可用于其它細(xì)胞和組織的營(yíng)養(yǎng)因子的潛力。方法及材料臍細(xì)胞分離：臍帶得自nationaldiseaseresearchinterchange(ndr1，philadelphia，pa.)。在正常分娩后獲得所述組織。在層流罩中無菌地進(jìn)行細(xì)胞分離方案。為移除血液和碎片，將臍帶在抗真菌劑和抗生素(100單位/毫升青霉素，100微克/毫升鏈霉素，0.25微克/毫升兩性霉素b)存在下于磷酸鹽緩沖鹽水(dpbs，invitrogen，carlsbad，calif.)中洗滌。然后將組織在50毫升培養(yǎng)基(dmem-低葡萄糖或dmem-高葡萄糖；invitrogen)存在下于150cm2組織培養(yǎng)板中進(jìn)行機(jī)械離解，直至組織切碎成細(xì)漿。將切碎的組織轉(zhuǎn)移到50毫升錐形管(約每管5克組織)。然后在dmem-低葡萄糖培養(yǎng)基或dmem-高葡萄糖培養(yǎng)基(每種均含有如上所述的抗真菌劑和抗生素)中消化組織。在一些實(shí)驗(yàn)中，使用膠原酶和分散酶的酶混合物(“c:d”，膠原酶(sigma，stlouis，mo.)，500單位/毫升；和分散酶(invitrogen)，50單位/毫升，dmem-低葡萄糖培養(yǎng)基中)。在其它實(shí)驗(yàn)中，使用膠原酶、分散酶和透明質(zhì)酸酶(“c:d:h”)的混合物(膠原酶，500單位/毫升；分散酶，50單位/毫升；和透明質(zhì)酸酶(sigma)，5單位/毫升，dmem-低葡萄糖中)。將包含組織、培養(yǎng)基和消化酶的錐形管在37℃下于225rpm的軌道式震蕩器(environ，brooklyn，n.y.)中溫育2小時(shí)。消化后，將組織在150xg下離心5分鐘，并吸出上清液。將沉淀物重懸于20毫升的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(dmem-低葡萄糖(invitrogen)、15％(v/v)胎牛血清(fbs；特級(jí)牛血清；目錄號(hào)and18475；hyclone，logan，utah)、0.001％(v/v)2-巰基乙醇(sigma)、1毫升/100毫升抗生素和/或抗真菌劑，如上所述)。使細(xì)胞懸液通過70微米尼龍細(xì)胞濾網(wǎng)(bdbiosciences)過濾。使另外5毫升包含生長(zhǎng)培養(yǎng)基的漂洗液通過濾網(wǎng)。然后使細(xì)胞懸液通過40微米尼龍細(xì)胞濾網(wǎng)(bdbiosciences)，隨后使另外5毫升生長(zhǎng)培養(yǎng)基的漂洗液通過。將濾液重懸于生長(zhǎng)培養(yǎng)基(總體積為50毫升)中，并在150xg下離心5分鐘。吸出上清液，并將細(xì)胞重懸于50毫升新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。該過程再重復(fù)兩次。在最后一次離心后，吸出上清液，并將細(xì)胞沉淀物重懸于5毫升新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。使用臺(tái)盼藍(lán)染色確定活細(xì)胞數(shù)量。然后在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)細(xì)胞。將從臍帶分離的細(xì)胞以5,000個(gè)細(xì)胞/cm2接種到明膠包被的t-75cm2燒瓶(corninginc.，coming，n.y.)的含如上所述抗生素/抗真菌劑的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。2天后(在各實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞孵育2-4天)，從燒瓶中吸出消耗培養(yǎng)基。用pbs洗滌細(xì)胞三次，以去除碎片和血源性細(xì)胞。然后為細(xì)胞補(bǔ)充生長(zhǎng)培養(yǎng)基，使細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合(從0代至1代需約10天)。在后續(xù)的傳代中(從1代至2代，以此類推)，細(xì)胞在4-5天內(nèi)達(dá)到近匯合(75-85％匯合)。對(duì)于這些后續(xù)的傳代，細(xì)胞以5000個(gè)細(xì)胞/cm2接種。將細(xì)胞在5％二氧化碳和大氣氧、37℃下培養(yǎng)于濕化培養(yǎng)箱中。胎盤細(xì)胞分離：胎盤組織獲自于ndri(philadelphia，pa.)。組織來自于孕婦并在正常手術(shù)分娩時(shí)獲得。胎盤細(xì)胞如臍細(xì)胞分離所述的那樣分離。以下實(shí)施例應(yīng)用從胎盤組織分離的母體衍生的細(xì)胞和新生兒衍生的細(xì)胞的獨(dú)立群體。在層流罩中無菌地進(jìn)行細(xì)胞分離方案。將胎盤組織在抗真菌劑和抗生素(如上所述)存在下于磷酸鹽緩沖鹽水(dpbs，invitrogen，carlsbad，calif.)中洗滌以移除血液和碎片。然后將胎盤組織解剖成三個(gè)部分：頂部系(新生兒側(cè)或區(qū)段)；中間系(新生兒和母體的混合細(xì)胞分離物)和底部系(母體側(cè)或區(qū)段)。將分離的部分各自用含抗生素/抗真菌劑的pbs洗滌數(shù)次，以進(jìn)一步移除血液和碎片。然后將各部分在50毫升的dmem-低葡萄糖存在下于150cm2組織培養(yǎng)板中進(jìn)行機(jī)械離解至細(xì)漿。將整個(gè)漿轉(zhuǎn)移到50毫升錐形管。各個(gè)管包含約5克的組織。將組織在dmem-低葡萄糖或dmem-高葡萄糖培養(yǎng)基中消化，所述培養(yǎng)基包含抗真菌劑和抗生素(100u/毫升的青霉素、100微克/毫升的鏈霉素、0.25微克/毫升的兩性霉素b)和消化酶。在一些實(shí)驗(yàn)中，使用膠原酶和分散酶的酶混合物(“c:d”)，該混合物包含dmem-低葡萄糖培養(yǎng)基中的500單位/毫升的膠原酶(sigma，stlouis，mo.)和50單位/毫升的分散酶(invitrogen)。在其它實(shí)驗(yàn)中，使用膠原酶、分散酶和透明質(zhì)酸酶(c:d:h)的混合物(膠原酶，500單位/毫升；分散酶，50單位/毫升；和透明質(zhì)酸酶(sigma)，5單位/毫升，dmem-低葡萄糖中)。將包含組織、培養(yǎng)基和消化酶的錐形管在37℃下于225rpm的軌道式震蕩器(environ，brooklyn，n.y.)中溫育2h。消化后，將組織在150xg下離心5分鐘，抽走所得的上清液。使沉淀物重懸于20毫升的具有青霉素/鏈霉素/兩性霉素b的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。使細(xì)胞懸液通過70微米尼龍細(xì)胞濾網(wǎng)(bdbiosciences)，隨后使具有另外5毫升生長(zhǎng)培養(yǎng)基的漂洗液通過。使全部細(xì)胞懸液通過40微米尼龍細(xì)胞濾網(wǎng)(bdbiosciences)，隨后使另外5毫升生長(zhǎng)培養(yǎng)基作為漂洗液通過。將濾液重懸于生長(zhǎng)培養(yǎng)基(總體積為50毫升)中，并在150xg下離心5分鐘。吸出上清液，并將細(xì)胞沉淀物重懸于50毫升新鮮培養(yǎng)基中。該過程再重復(fù)兩次。在最后一次離心后，吸出上清液，并將細(xì)胞沉淀物重懸于5毫升新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。使用臺(tái)盼藍(lán)染色排除測(cè)試來測(cè)定細(xì)胞計(jì)數(shù)。然后在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)細(xì)胞。釋放酶細(xì)胞分離：將細(xì)胞從具有釋放酶(boehringermannheimcorp.，indianapolis，ind.)(2.5毫克/毫升，blendzyme3；rocheappliedsciences，indianapolis，ind.)和透明質(zhì)酸酶(5單位/毫升，sigma)的dmem-低葡萄糖培養(yǎng)基中的臍組織分離。組織消化和細(xì)胞分離如上文對(duì)于其它蛋白酶消化描述的，使用釋放酶/透明質(zhì)酸酶混合物代替c:d或c:d:h酶混合物。用liberase的組織消化導(dǎo)致從產(chǎn)后組織中分離容易擴(kuò)增的細(xì)胞群。使用其它酶組合進(jìn)行細(xì)胞分離：比較使用不同酶組合從臍帶中分離細(xì)胞的操作。用于消化比較的酶包括：i)膠原酶；ii)分散酶；iii)透明質(zhì)酸酶；iv)膠原酶：分散酶混合物(c:d)；v)膠原酶：透明質(zhì)酸酶混合物(c:h)；vi)分散酶：透明質(zhì)酸酶混合物(d:h)；以及vii)膠原酶：分散酶：透明質(zhì)酸酶混合物(c:d:h)。觀察到利用這些不同的酶消化條件在細(xì)胞分離中的差異(表6-1)。細(xì)胞從臍帶中的殘留血液中分離：作出通過不同方法從臍帶中分離細(xì)胞庫(kù)的其它嘗試。在一個(gè)例子中，將臍帶切片并用生長(zhǎng)培養(yǎng)基洗滌，以去除血塊和凝膠狀材料。收集血液、凝膠狀材料和生長(zhǎng)培養(yǎng)基的混合物，并且以150xg離心。將沉淀物重懸并接種到明膠包被的燒瓶上的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)，分離容易擴(kuò)增的細(xì)胞群。細(xì)胞從臍帶血中分離：細(xì)胞還已從得自ndr1的臍帶血液樣本中分離。此處使用的分離方案為ho等人的國(guó)際專利申請(qǐng)wo2003/025149的方案(ho，t.w.等人，“cellpopulationswhichco-expresscd49candcd90，”申請(qǐng)pct/us02/29971)。將臍帶血液樣本(分別為50毫升和10.5毫升)(ndr1，philadelphiapa.)與裂解緩沖液(過濾滅菌的155mm氯化銨、10毫摩爾每升碳酸氫鉀、0.1毫摩爾每升edta緩沖至ph7.2(所有組分均來自sigma，st.louis，mo.))混合。細(xì)胞以1∶20臍帶血與裂解緩沖液的比率進(jìn)行裂解。將所得的細(xì)胞懸浮液渦旋5秒，并且在環(huán)境溫度下溫育2分鐘。將裂解產(chǎn)物離心(以200xg10分鐘)。將細(xì)胞沉淀物重懸于完全極限必需培養(yǎng)基(gibco，carlsbad，calif.)，所述培養(yǎng)基含有10％胎牛血清(hyclone，loganutah)、4毫摩爾每升谷氨酰胺(mediatech，herndon，va.)、每100毫升100單位的青霉素和每100毫升100微克的鏈霉素(gibco，carlsbad，calif.)。將重懸的細(xì)胞離心(以200xg10分鐘)，抽吸上清液，并且在完全培養(yǎng)基中洗滌細(xì)胞沉淀物。將細(xì)胞直接接種到t75燒瓶(corning，n.y.)、t75層粘連蛋白包被的燒瓶、或t175纖粘蛋白包被的燒瓶(兩者均來自bectondickinson，bedford，mass.)內(nèi)。使用不同酶組合和生長(zhǎng)條件分離細(xì)胞：為了測(cè)定細(xì)胞群是否可在不同條件下分離并在分離后立即在多種條件下擴(kuò)增，根據(jù)上文提供的操作，使用c:d:h的酶組合，將細(xì)胞在含有或不含0.001％(v/v)2-巰基乙醇(sigma，st.louis，mo.)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中消化。在各種條件下接種如此分離的胎盤衍生的細(xì)胞。使所有細(xì)胞均在青霉素/鏈霉素的存在下生長(zhǎng)(表6-2)。使用不同酶組合和生長(zhǎng)條件分離細(xì)胞：在所有條件下，細(xì)胞在第0代和第1代之間均良好貼壁并擴(kuò)增(表6-2)。在條件5-8和13-16中的細(xì)胞證實(shí)在接種后良好增殖最多至4次傳代，在這時(shí)它們進(jìn)行冷凍保存并存庫(kù)。結(jié)果使用不同酶組合進(jìn)行細(xì)胞分離：c:d:h的組合提供在分離后的最佳細(xì)胞收率，并且生成在培養(yǎng)中比其它條件擴(kuò)增更多代的細(xì)胞(表6-1)?？蓴U(kuò)增的細(xì)胞群無法使用單獨(dú)的膠原酶或透明質(zhì)酸酶獲得。不作出測(cè)定該結(jié)果是否特定于測(cè)試的膠原的嘗試。表6-1：使用多種酶組合從臍帶組織中分離細(xì)胞關(guān)鍵：+＝良好；++＝非常良好，+++＝優(yōu)異，x＝未成功使用不同酶組合和生長(zhǎng)條件分離細(xì)胞：細(xì)胞在對(duì)于酶消化和生長(zhǎng)的測(cè)試的所有條件下在第0代和第1代之間均良好貼壁并擴(kuò)增(表6-2)。在實(shí)驗(yàn)條件5-8和13-16中的細(xì)胞在接種后良好增殖最多至4次傳代，在這時(shí)它們進(jìn)行冷凍保存。所有細(xì)胞均冷凍保存用于進(jìn)一步探索。表6-2：多種條件下的產(chǎn)后細(xì)胞的分離和培養(yǎng)擴(kuò)增從臍帶的殘留血液中分離細(xì)胞：有核細(xì)胞快速貼壁并生長(zhǎng)。這些細(xì)胞通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析，并且類似于通過酶消化獲得的細(xì)胞。從臍帶血中分離細(xì)胞：所述制劑含有紅血細(xì)胞和血小板。在前3周過程中有核細(xì)胞未貼壁并分裂。在接種后3周更換培養(yǎng)基，并且未觀察到細(xì)胞貼壁并生長(zhǎng)?？偨Y(jié)：細(xì)胞群可使用酶組合膠原酶(基質(zhì)金屬蛋白酶)、分散酶(中性蛋白酶)和透明質(zhì)酸酶(分解透明質(zhì)酸的粘液溶解酶)有效地來源于臍帶和胎盤組織。也可使用釋放酶(blendzyme)。具體地，blendzyme3為膠原酶(4wunsch單位/g)和嗜熱菌蛋白酶(1714酪蛋白單位/g)，也連同透明質(zhì)酸酶一起用于分離細(xì)胞。當(dāng)在經(jīng)明膠包被的塑料上的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，這些細(xì)胞容易地經(jīng)過多次傳代擴(kuò)增。細(xì)胞還從臍帶中的殘留血液而不是臍帶血中分離。從組織中洗滌的血塊中的細(xì)胞的存在可能是由于在解剖過程期間釋放的細(xì)胞，所述血塊中的細(xì)胞在使用的條件下貼壁并生長(zhǎng)。實(shí)施例7產(chǎn)后衍生細(xì)胞的染色體核型分析在細(xì)胞療法中使用的細(xì)胞系優(yōu)選是同質(zhì)的并且不含任何污染細(xì)胞類型。在細(xì)胞療法中使用的細(xì)胞應(yīng)具有正常的染色體數(shù)目(46)和結(jié)構(gòu)。為了鑒定胎盤和臍衍生的細(xì)胞系是同質(zhì)的并且不含非產(chǎn)后組織起源的細(xì)胞，分析細(xì)胞樣本的核型。方法及材料將來自男性新生兒的產(chǎn)后組織的ppdc在包含青霉素/鏈霉素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。選擇來自男性新生兒(x，y)的產(chǎn)后組織，以允許區(qū)別新生兒衍生的細(xì)胞和母體衍生的細(xì)胞(x，x)。細(xì)胞以5,000個(gè)細(xì)胞/平方厘米接種到t25燒瓶(corninginc.，corning，n.y.)中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，并且擴(kuò)增至80％匯合。含有細(xì)胞的t25燒瓶用生長(zhǎng)培養(yǎng)基填充至頸部。通過快遞將樣本遞送至臨床細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室(估計(jì)的實(shí)驗(yàn)室至實(shí)驗(yàn)室運(yùn)輸時(shí)間為一小時(shí))。細(xì)胞在中期過程中進(jìn)行分析，在所述中期時(shí)染色體是最佳顯現(xiàn)的。在計(jì)數(shù)的處于中期的二十個(gè)細(xì)胞中，五個(gè)就正常同質(zhì)核型數(shù)目(二)進(jìn)行分析。如果觀察到兩個(gè)核型，則細(xì)胞樣本表征為同質(zhì)的。如果觀察到超過兩個(gè)核型，則細(xì)胞樣本表征為異質(zhì)的。當(dāng)鑒定異質(zhì)核型數(shù)目(四)時(shí)，計(jì)數(shù)并分析另外的中期細(xì)胞。結(jié)果送往染色體分析的所有細(xì)胞樣本均被解釋為顯示出正常外觀。分析的16種細(xì)胞系中的三種顯示出異質(zhì)表型(xx和xy)，指示來源于新生兒和母體起源的細(xì)胞的存在(表7-1)。組織胎盤-n衍生的細(xì)胞從胎盤的新生兒區(qū)段分離。在第零代，該細(xì)胞系似乎為同質(zhì)xy。然而，在第九代，細(xì)胞系為異質(zhì)(xx/xy)，指示先前未檢測(cè)到母體起源的細(xì)胞的存在。表7-1：ppdc的核型結(jié)果關(guān)鍵：n-新生兒側(cè)；v-絨狀區(qū)域；m-母體側(cè)；c-克隆總結(jié)：染色體分析鑒定胎盤和臍衍生的細(xì)胞，如由臨床細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室解釋的，所述細(xì)胞的核型看起來是正常的。核型分析還鑒定不含母體細(xì)胞的細(xì)胞系，如由同質(zhì)核型測(cè)定的。實(shí)施例8通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估人產(chǎn)后衍生細(xì)胞表面標(biāo)志物通過流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞表面蛋白或“標(biāo)志物”的表征可用于測(cè)定細(xì)胞系的身份。表達(dá)的一致性可由多個(gè)供體以及在暴露于不同處理和培養(yǎng)條件的細(xì)胞中進(jìn)行測(cè)定。從胎盤和臍中分離的產(chǎn)后衍生細(xì)胞(ppdc)系(通過流式細(xì)胞術(shù))進(jìn)行表征，提供用于鑒定這些細(xì)胞系的譜。方法及材料培養(yǎng)基和培養(yǎng)容器：將細(xì)胞培養(yǎng)于含青霉素/鏈霉素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(gibcocarlsbad，calif.)中。將細(xì)胞培養(yǎng)于等離子處理的t75、t150和t225組織培養(yǎng)燒瓶(corninginc.，corning，n.y.)直至匯合。通過在室溫下溫育2％(w/v)明膠(sigma，st.louis，mo.)20分鐘，使燒瓶的生長(zhǎng)表面包被有明膠?？贵w染色和流式細(xì)胞術(shù)分析：在pbs中洗滌燒瓶中的貼壁細(xì)胞，并用胰蛋白酶/edta分離。將細(xì)胞收獲、離心并以每毫升1×107個(gè)的細(xì)胞濃度重懸于pbs中的3％(v/v)fbs中。根據(jù)制造商說明書，將所關(guān)注的細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體(見下)添加到一百微升細(xì)胞懸液中，并將混合物在4℃下于黑暗中孵育30分鐘。在孵育之后，將細(xì)胞用pbs洗滌并離心以移除未結(jié)合的抗體。將細(xì)胞重懸于500微升pbs中，并通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。用facscaliburtm儀器(bectondickinson，sanjose，calif.)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。表8-1列出所用細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體。表8-1：用于表征細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體。胎盤和臍比較：將胎盤衍生的細(xì)胞與臍衍生的細(xì)胞在第8代時(shí)進(jìn)行比較。代與代的比較：胎盤和臍衍生的細(xì)胞在第8、15和20代時(shí)進(jìn)行分析。供體與供體的比較：為比較供體間的差異，將得自不同供體的胎盤衍生的細(xì)胞進(jìn)行互相比較，并且將得自不同供體的臍衍生的細(xì)胞進(jìn)行互相比較。表面被覆物比較：將在明膠包被的燒瓶上培養(yǎng)的胎盤衍生的細(xì)胞與在未經(jīng)包被的燒瓶上培養(yǎng)的胎盤衍生的細(xì)胞進(jìn)行比較。將在明膠包被的燒瓶上培養(yǎng)的臍衍生的細(xì)胞與在未經(jīng)包被的燒瓶上培養(yǎng)的臍衍生的細(xì)胞進(jìn)行比較。消化酶比較：比較了用于細(xì)胞分離和制備的四種處理。比較通過用以下項(xiàng)處理從胎盤中分離的細(xì)胞：1)膠原酶；2)膠原酶/分散酶；3)膠原酶/透明質(zhì)酸酶；以及4)膠原酶/透明質(zhì)酸酶/分散酶。胎盤層比較：將胎盤組織的母體區(qū)段衍生的細(xì)胞與胎盤組織的絨狀區(qū)域衍生的細(xì)胞和胎盤的新生胎兒側(cè)衍生的細(xì)胞進(jìn)行比較。結(jié)果胎盤和臍的比較：通過流式細(xì)胞術(shù)分析的胎盤和臍衍生的細(xì)胞顯示cd10、cd13、cd44、cd73、cd90、pdgfr-α和hla-a、b、c的陽(yáng)性表達(dá)，如由相對(duì)于igg對(duì)照增加的熒光值所指示的那樣。這些細(xì)胞對(duì)于cd31、cd34、cd45、cd117、cd141和hla-dr、dp、dq的可檢測(cè)表達(dá)是陰性的，如與igg對(duì)照相當(dāng)?shù)臒晒庵邓甘?。考慮了陽(yáng)性曲線的熒光值的變化。陽(yáng)性曲線的平均值(即cd13)和范圍(即cd90)顯示一些變化，但該曲線呈正態(tài)，證明是同質(zhì)群體。兩種曲線各自顯示大于igg對(duì)照的值。代與代的比較-胎盤衍生的細(xì)胞：通過流式細(xì)胞術(shù)分析的第8、15和20代的胎盤衍生的細(xì)胞對(duì)于cd10、cd13、cd44、cd73、cd90、pdgfr-α和hla-a、b、c的表達(dá)均呈陽(yáng)性，如相對(duì)于igg對(duì)照增加的熒光值所反映的那樣。細(xì)胞對(duì)于cd31、cd34、cd45、cd117、cd141和hla-dr、dp、dq的表達(dá)呈陰性，具有與igg對(duì)照一致的熒光值。代與代間的比較-臍衍生的細(xì)胞：通過流式細(xì)胞術(shù)分析的在第8、15和20代時(shí)的臍衍生的細(xì)胞均表達(dá)cd10、cd13、cd44、cd73、cd90、pdgfr-α和hla-a、b、c(由相對(duì)于igg對(duì)照增加的熒光指示)。這些細(xì)胞對(duì)于cd31、cd34、cd45、cd117、cd141和hla-dr、dp、dq是陰性的，如與igg對(duì)照一致的熒光值所指示。供體與供體間的比較-胎盤衍生的細(xì)胞：通過流式細(xì)胞術(shù)分析的從獨(dú)立供體分離的胎盤衍生的細(xì)胞各自表達(dá)cd10、cd13、cd44、cd73、cd90、pdgfr-α和hla-a、b、c，熒光值相對(duì)于igg對(duì)照增加。細(xì)胞對(duì)于cd31、cd34、cd45、cd117、cd141和hla-dr、dp、dq的表達(dá)是陰性的，如與igg對(duì)照一致的熒光值所指示的那樣。供體與供體間的比較-臍衍生的細(xì)胞：通過流式細(xì)胞術(shù)分析的從獨(dú)立供體分離的臍衍生的細(xì)胞各自顯示cd10、cd13、cd44、cd73、cd90、pdgfr-α和hla-a、b、c的陽(yáng)性表達(dá)(在相對(duì)于igg對(duì)照增加的熒光值中反映)。這些細(xì)胞對(duì)于cd31、cd34、cd45、cd117、cd141和hla-dr、dp、dq的表達(dá)是陰性的，其中熒光值與igg對(duì)照一致。具有明膠的表面被覆物對(duì)胎盤衍生的細(xì)胞的影響：通過流式細(xì)胞術(shù)分析的在經(jīng)明膠包被或未經(jīng)包被的燒瓶上擴(kuò)增的胎盤衍生的細(xì)胞均表達(dá)cd10、cd13、cd44、cd73、cd90、pdgfr-α和hla-a、b、c(在相對(duì)于igg對(duì)照增加的熒光值中反映)。這些細(xì)胞對(duì)于cd31、cd34、cd45、cd117、cd141和hla-dr、dp、dq的表達(dá)是陰性的，如與igg對(duì)照一致的熒光值所指示。具有明膠的表面被覆物對(duì)臍衍生的細(xì)胞的影響：通過流式細(xì)胞術(shù)分析的在經(jīng)明膠包被的燒瓶和未經(jīng)包被的燒瓶上擴(kuò)增的臍衍生的細(xì)胞對(duì)于cd10、cd13、cd44、cd73、cd90、pdgfr-α和hla-a、b、c的表達(dá)均呈陽(yáng)性，具有相對(duì)于igg對(duì)照增加的熒光值。這些細(xì)胞對(duì)于cd31、cd34、cd45、cd117、cd141和hla-dr、dp、dq的表達(dá)是陰性的，其中熒光值與igg對(duì)照一致。用于制備細(xì)胞的酶消化法對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物分布的影響：通過流式細(xì)胞術(shù)分析的用各種消化酶分離的胎盤衍生的細(xì)胞均表達(dá)cd10、cd13、cd44、cd73、cd90、pdgfr-α和hla-a、b、c，如由相對(duì)于igg對(duì)照增加的熒光值所指示的。這些細(xì)胞對(duì)于cd31、cd34、cd45、cd117、cd141和hla-dr、dp、dq的表達(dá)是陰性的，如與igg對(duì)照一致的熒光值所指示的。胎盤層比較：由流式細(xì)胞術(shù)分析的分別從胎盤的母體、絨毛和新生兒層分離的細(xì)胞顯示cd10、cd13、cd44、cd73、cd90、pdgfr-α和hla-a、b、c的陽(yáng)性表達(dá)，如由相對(duì)于igg對(duì)照增加的熒光值所指示的。這些細(xì)胞對(duì)于cd31、cd34、cd45、cd117、cd141和hla-dr、dp、dq的表達(dá)是陰性的，如與igg對(duì)照一致的熒光值所指示的?？偨Y(jié)：通過流式細(xì)胞術(shù)分析胎盤和臍衍生的細(xì)胞已確定這些細(xì)胞系的身份。胎盤和臍衍生的細(xì)胞對(duì)于cd10、cd13、cd44、cd73、cd90、pdgfr-α、hla-a、b、c是陽(yáng)性的，并且對(duì)于cd31、cd34、cd45、cd117、cd141和hla-dr、dp、dq是陰性的。該身份與變量中的變化一致，所述變化包括供體、傳代、培養(yǎng)容器表面涂層、消化酶和胎盤層。觀察到單獨(dú)熒光值直方曲線平均值和范圍中的一些變化，但在所測(cè)試的所有條件下的所有陽(yáng)性曲線均為正態(tài)的并且顯示熒光值大于igg對(duì)照，由此證實(shí)了細(xì)胞包含具有標(biāo)志物的陽(yáng)性表達(dá)的同質(zhì)群體。實(shí)施例9產(chǎn)后組織表型的免疫組織化學(xué)表征通過免疫組織化學(xué)分析在人產(chǎn)后組織(即臍帶和胎盤)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞的表型。方法及材料組織制備：收獲得到人臍帶和胎盤組織并在4℃下浸沒于4％(w/v)低聚甲醛中固定過夜。使用針對(duì)以下的表位的抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析：波形蛋白(1∶500；sigma，st.louis，mo.)、結(jié)蛋白(1∶150，針對(duì)兔產(chǎn)生；sigma；或1∶300，針對(duì)小鼠產(chǎn)生；chemicon，temecula，calif.)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(sma；1∶400；sigma)、細(xì)胞角蛋白18(ck18；1∶400；sigma)、血管性血友病因子(vwf；1∶200；sigma)以及cd34(人cd34iii類；1∶100；dakocytomation，carpinteria，calif)。此外，測(cè)試以下標(biāo)志物，抗人groα--pe(1∶100；bectondickinson，franklinlakes，n.j)、抗人gcp-2(1∶100；santacruzbiotech，santacruz，calif)、抗人氧化ldl受體1(ox-ldlr1；1∶100；santacruzbiotech)、以及抗人nogo-a(1∶100；santacruzbiotech)。將固定的標(biāo)本用外科手術(shù)刀修剪并置于包含乙醇的干冰浴上的oct包埋的化合物(tissue-tekoct；sakura，torrance，calif)內(nèi)。然后使用標(biāo)準(zhǔn)冰凍切片機(jī)(徠卡顯微系統(tǒng)(leicamicrosystems))對(duì)冰凍塊進(jìn)行切片(10μm厚)，并安裝于載玻片上進(jìn)行染色。免疫組織化學(xué)：免疫組織化學(xué)類似于以前研究進(jìn)行(例如messina等人，2003，exper.neurol.184：816-829)。用磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)清洗組織切片后，將其與含pbs、4％(v/v)的山羊血清(chemicon，temecula，calif)和0.3％(v/v)的triton(tritonx-100；sigma)的蛋白質(zhì)阻斷溶液接觸1小時(shí)以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)抗原。在所關(guān)注表位位于細(xì)胞表面上(cd34、ox-ldlr1)的情況下，在流程的所有步驟中省略triton以防止表位丟失。此外，在一抗通過免疫山羊制備(gcp-2、ox-ldlr1、nogo-a)的情況下，在整個(gè)流程中使用3％(v/v)驢血清替代山羊血清。一抗在阻斷溶液中稀釋后，施加到切片上并在室溫下保持4小時(shí)。去除一抗溶液，并且在施加含阻斷劑連同山羊抗-小鼠igg--德克薩斯紅(1∶250；molecularprobes，eugene，oreg.)和/或山羊抗兔igg--alexa488(1∶250；molecularprobes)或驢抗山羊igg--fitc(1∶150；santacruzbiotech)的二抗溶液(室溫下1小時(shí))之前用pbs洗滌培養(yǎng)物。洗滌培養(yǎng)物，并且施加10微摩爾dapi(molecularprobes)10分鐘，使細(xì)胞核顯色。經(jīng)過免疫染色后，使用適當(dāng)?shù)膴W林巴斯倒置表面熒光顯微鏡(olympus，melville，n.y.)觀察熒光。陽(yáng)性染色表示為超過對(duì)照染色的熒光信號(hào)。使用彩色數(shù)碼攝像機(jī)和imagepro軟件(mediacybernetics，carlsbad，calif.)捕獲代表性圖像。對(duì)于三柒樣本，每幅圖像每次僅用一個(gè)濾光片拍攝。使用adobephotoshop軟件(adobe，sanjose，calif.)制作分層剪輯。結(jié)果臍帶表征：波形蛋白、結(jié)蛋白、sma、cki8、vwf和cd34標(biāo)志物在臍帶內(nèi)存在的細(xì)胞亞群中表達(dá)。具體地，vwf和cd34表達(dá)局限于臍帶內(nèi)所含的血管。cd34+細(xì)胞位于最內(nèi)層(內(nèi)腔側(cè))。在臍帶的所有基質(zhì)和血管中存在波形蛋白表達(dá)。sma限制于基質(zhì)以及動(dòng)脈和靜脈的外壁上，但不包含在血管自身內(nèi)。ck18和結(jié)蛋白僅在血管中觀察到，結(jié)蛋白局限于中層和外層。胎盤表征：波形蛋白、結(jié)蛋白、sma、cki8、vwf和cd34均在胎盤內(nèi)觀察到并且是區(qū)域特異性的。groalpha、gcp-2、ox-ldlri和nogo-a組織表達(dá)：這些標(biāo)志物無一在臍帶或胎盤組織內(nèi)觀察到?？偨Y(jié)：波形蛋白、結(jié)蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、細(xì)胞角蛋白18、血管性血友病因子和cd34在人臍帶和胎盤內(nèi)的細(xì)胞中表達(dá)。實(shí)施例10使用寡核苷酸陣列分析產(chǎn)后組織衍生的細(xì)胞使用affymetrixgenechip陣列，對(duì)臍和胎盤衍生的細(xì)胞與成纖維細(xì)胞、人間充質(zhì)干細(xì)胞和源自人骨髓的另一種細(xì)胞系的基因表達(dá)譜進(jìn)行比較。該分析提供了產(chǎn)后衍生細(xì)胞和這些細(xì)胞經(jīng)鑒定的獨(dú)特分子標(biāo)志物的表征。方法及材料細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：經(jīng)患者同意在正常足月分娩后從國(guó)家疾病研究交流會(huì)(ndri，philadelphia，pa.)獲得人臍帶和胎盤。收到組織后，如實(shí)施例6所述的那樣分離細(xì)胞。將細(xì)胞培養(yǎng)于明膠包被的組織培養(yǎng)塑料瓶上的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(使用dmem-lg)中。將培養(yǎng)物在37℃和5％co2下孵育。人真皮成纖維細(xì)胞購(gòu)自cambrexincorporated(walkersville，md.；批號(hào)9f0844)和atcccrl-1501(ccd39sk)。將兩種細(xì)胞系均培養(yǎng)于含10％(v/v)胎牛血清(hyclone)和青霉素/鏈霉素(invitrogen)的dmem/f12培養(yǎng)基(invitrogen，carlsbad，calif.)中。細(xì)胞生長(zhǎng)于標(biāo)準(zhǔn)組織處理的塑料制品上。人間充質(zhì)干細(xì)胞(hmsc)購(gòu)自cambrexincorporated(walkersville，md.；批號(hào)2f1655、2f1656和2f1657)并根據(jù)制造商說明書在mscgm培養(yǎng)基(cambrex)中培養(yǎng)。細(xì)胞在37℃和5％co2下生長(zhǎng)于標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)塑料制品上。經(jīng)患者同意，從ndri接收人髂嵴骨髓。骨髓根據(jù)ho等人(w003/025149)概括的方法處理。以1份骨髓對(duì)20份裂解緩沖液的比率，將骨髓與裂解緩沖液(155mmnh4cl、10mmkhco3和0.1mmedta，ph7.2)混合。對(duì)細(xì)胞懸浮液進(jìn)行渦旋，在環(huán)境溫度下溫育2分鐘，并在500xg下離心10分鐘。棄去上清液，將細(xì)胞沉淀物重懸于補(bǔ)充有10％(v/v)胎牛血清和4mm谷氨酰胺的極限必需培養(yǎng)基α(invitrogen)中。再次離心細(xì)胞，并將細(xì)胞沉淀物重懸于新鮮培養(yǎng)基中。使用臺(tái)盼藍(lán)染色排除法(sigma，st.louis，mo.)計(jì)算存活的單核細(xì)胞。將單核細(xì)胞以5×104個(gè)細(xì)胞/cm2接種于組織培養(yǎng)塑料瓶中。在標(biāo)準(zhǔn)大氣o2或5％o2下，并于37℃和5％co2下孵育細(xì)胞。將細(xì)胞培養(yǎng)5天而不更換培養(yǎng)基。在培養(yǎng)5天后，除去培養(yǎng)基和非貼壁細(xì)胞。在培養(yǎng)中維持貼壁細(xì)胞。mrna的分離和genechip分析：使用細(xì)胞刮刀將活躍生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物從燒瓶移除到冷pbs中。以300xg將細(xì)胞離心5分鐘。除去上清液，并將細(xì)胞重懸浮于新鮮pbs中，再次離心。除去上清液，并將細(xì)胞沉淀物立即凍存于-80℃。提取細(xì)胞mrna，將其轉(zhuǎn)錄成cdna，再轉(zhuǎn)錄成crna并用生物素標(biāo)記。將生物素標(biāo)記的crna與hg-u133a基因芯片寡核苷酸陣列(affymetrix，santaclaracalif.)雜交。根據(jù)制造商說明書進(jìn)行雜交和數(shù)據(jù)收集。使用“微陣列顯著性分析”(sam)1.21版計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行分析(stanforduniversity；tusher，v.g.等人，2001，proc.natl.acad.sci.usa98：5116-5121)。結(jié)果分析十四個(gè)不同細(xì)胞群。細(xì)胞連同傳代信息、培養(yǎng)基底和培養(yǎng)基一起列于表10-1中。表10-1：微陣列研究分析的細(xì)胞。細(xì)胞系通過其識(shí)別碼連同在分析時(shí)的傳代、細(xì)胞生長(zhǎng)基底和生長(zhǎng)培養(yǎng)基一起列出。細(xì)胞群傳代基底培養(yǎng)基臍(022803)2明膠dmem，15％fbs，2-me臍(042103)3明膠dmem，15％fbs，2-me臍(071003)4明膠dmem，15％fbs，2-me胎盤(042203)12明膠dmem，15％fbs，2-me胎盤(042903)4明膠dmem，15％fbs，2-me胎盤(071003)3明膠dmem，15％fbs，2-meicbm(070203)(5％o2)3塑料mem10％fbsicbm(062703)(標(biāo)準(zhǔn)o2)5塑料mem10％fbsicbm(062703)(5％o2)5塑料mem10％fbshmsc(lot2f1655)3塑料制品mscgmhmsc(lot2f1656)3塑料mscgmhmsc(lot2f1657)3塑料mscgm人成纖維細(xì)胞(9f0844)9塑料dmem-f12，10％fbs人成纖維細(xì)胞(ccd39sk)4塑料dmem-f12，10％fbs通過主成分分析對(duì)細(xì)胞中差異表達(dá)的290個(gè)基因進(jìn)行分析，從而評(píng)估數(shù)據(jù)。該分析可以對(duì)群體間相似性進(jìn)行相對(duì)比較。表10-2示出了計(jì)算用于比較細(xì)胞對(duì)的歐氏距離。歐氏距離基于按照不同細(xì)胞類型間差異表達(dá)的290個(gè)基因得出的細(xì)胞比較結(jié)果。歐氏距離與290個(gè)基因的表達(dá)間的相似性成反比(即，距離越大，存在越小的相似性)。表10-2：細(xì)胞對(duì)的歐氏距離。表10-3、10-4和10-5示出了在胎盤衍生的細(xì)胞中增加的基因表達(dá)(表10-3)、在臍衍生的細(xì)胞中增加的基因表達(dá)(表10-4)、以及在臍和胎盤衍生的細(xì)胞中減少的基因表達(dá)(表10-5)。名稱為“探針組id”的一列是指位于芯片特定位置上的若干寡核苷酸探針的組的制造商識(shí)別碼，這些探針雜交于指定的基因(“基因名稱”列)，所述基因包含可以指定登錄號(hào)(“ncbi登錄號(hào)”列)在ncbi(基因庫(kù))數(shù)據(jù)庫(kù)中找到的序列。表10-3：表現(xiàn)出與測(cè)定的其它細(xì)胞系相比在胎盤衍生的細(xì)胞中具有特定增加的表達(dá)量的基因。表10-4：表現(xiàn)出與測(cè)定的其它細(xì)胞系相比在臍衍生的細(xì)胞中具有特定增加的表達(dá)量的基因。表10-5：表現(xiàn)出與測(cè)定的其它細(xì)胞系相比在臍和胎盤衍生的細(xì)胞中具有減小的表達(dá)量的基因。表10-6、10-7和10-8示出了在人成纖維細(xì)胞(表10-6)、icbm細(xì)胞(表10-7)和msc(表10-8)中增加的基因表達(dá)。表10-6：表現(xiàn)出與測(cè)定的其它細(xì)胞系相比在成纖維細(xì)胞中具有增加的表達(dá)量的基因。表10-7：表現(xiàn)出與測(cè)定的其它細(xì)胞系相比在icbm來源細(xì)胞中具有增加的表達(dá)量的基因。表10-8：表現(xiàn)出與測(cè)定的其它細(xì)胞系相比在msc細(xì)胞中具有增加的表達(dá)量的基因?？偨Y(jié)：進(jìn)行本檢測(cè)以提供源于臍帶和胎盤的產(chǎn)后細(xì)胞的分子表征。該分析包括源于三個(gè)不同臍帶和三個(gè)不同胎盤的細(xì)胞。該檢測(cè)還包括兩個(gè)不同的表皮成纖維細(xì)胞系、三種間充質(zhì)干細(xì)胞系和三種髂嵴骨髓細(xì)胞系。使用包含22,000個(gè)基因的探針的寡核苷酸陣列分析這些細(xì)胞表達(dá)的mrna。結(jié)果表明290個(gè)基因在這五個(gè)不同細(xì)胞類型中差異表達(dá)。這些基因包括在胎盤衍生的細(xì)胞中特異性增加的十種基因和在臍帶衍生的細(xì)胞中特異性增加的七種基因。發(fā)現(xiàn)五十四個(gè)基因與其它細(xì)胞類型相比在胎盤和臍帶中具有特定降低的表達(dá)水平。所選基因的表達(dá)已通過pcr加以證實(shí)(參見之后的實(shí)施例)。這些結(jié)果證實(shí)例如與骨髓來源細(xì)胞和成纖維細(xì)胞相比，產(chǎn)后衍生細(xì)胞具有獨(dú)特基因表達(dá)譜。實(shí)施例11產(chǎn)后衍生細(xì)胞中的細(xì)胞標(biāo)志物在前述實(shí)施例中，從胎盤和人臍帶衍生的細(xì)胞的相似性和差異性通過將其基因表達(dá)譜與其它來源衍生的細(xì)胞的那些進(jìn)行比較(使用寡核苷酸陣列)來評(píng)估。鑒定六個(gè)“標(biāo)簽”基因：氧化ldl受體1、白介素-8、凝乳酶、漿膜蛋白、趨化因子受體配體3(cxc配體3)和粒細(xì)胞趨化蛋白2(gcp-2)。這些“標(biāo)簽”基因在產(chǎn)后衍生細(xì)胞中以相對(duì)較高的水平表達(dá)。進(jìn)行該實(shí)施例中所述的程序以驗(yàn)證微陣列數(shù)據(jù)并尋找基因和蛋白表達(dá)之間的一致/不一致，以及建立一系列可靠測(cè)定法，用于檢測(cè)胎盤和臍衍生的細(xì)胞的唯一識(shí)別符。方法及材料細(xì)胞：使胎盤衍生的細(xì)胞(三種分離物，包括主要為新生兒的一種分離物，如由染色體核型分析所鑒定)、臍衍生的細(xì)胞(四種分離物)、以及正常人真皮成纖維細(xì)胞(nhdf；新生兒和成人)生長(zhǎng)于經(jīng)明膠包被的t75燒瓶的含有青霉素/鏈霉素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。間充質(zhì)干細(xì)胞(mscs)生長(zhǎng)于間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基套裝(mscgm；cambrex，walkerville，md.)。對(duì)于il-8方案，將細(xì)胞從液氮解凍，并以5,000個(gè)細(xì)胞/cm2鋪平板于經(jīng)明膠包被的燒瓶中，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)48小時(shí)，并隨后在10毫升血清饑餓培養(yǎng)基[dmem-低葡萄糖(gibco，carlsbad，calif.)，青霉素/鏈霉素(gibco，carlsbad，calif.)和0.1％(w/v)牛血清白蛋白(bsa；sigma，st.louis，mo.)]中再生長(zhǎng)8小時(shí)。該處理之后，提取rna并將上清液以150xg離心5分鐘以去除細(xì)胞碎片。然后將上清液在-80℃下冷凍，以進(jìn)行elisa分析。用于elisa測(cè)定的細(xì)胞培養(yǎng)物：將來源于胎盤和臍的產(chǎn)后細(xì)胞以及來源于人新生兒包皮的人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于明膠包被的t75燒瓶的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。在液氮中冷凍11代的細(xì)胞。將細(xì)胞解凍并轉(zhuǎn)移到15毫升離心管中。在150xg下離心5分鐘后，棄去上清液。將細(xì)胞重懸于4毫升培養(yǎng)基中并計(jì)數(shù)。將細(xì)胞以375,000個(gè)細(xì)胞/燒瓶在含有15毫升生長(zhǎng)培養(yǎng)基的75cm2燒瓶中培養(yǎng)24小時(shí)。將培養(yǎng)基更換為血清饑餓培養(yǎng)基并培養(yǎng)8小時(shí)。在溫育結(jié)束時(shí)收集血清饑餓培養(yǎng)基，以14,000xg離心5分鐘(并保存于-20℃下)。為了估算每個(gè)燒瓶中細(xì)胞的數(shù)量，在每個(gè)燒瓶中添加2毫升胰蛋白酶/edta(gibco，carlsbad，calif)。將細(xì)胞從燒瓶中分離后，用8毫升生長(zhǎng)培養(yǎng)基中和胰蛋白酶活性。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15毫升離心管中并以150xg離心5分鐘。去除上清液，并將1毫升生長(zhǎng)培養(yǎng)基添加至每管中以重懸細(xì)胞。使用血球計(jì)估算細(xì)胞數(shù)量。elisa測(cè)定：使用elisa測(cè)定法(r&dsystems，minneapolis，minn.)分析由細(xì)胞分泌到血清饑餓培養(yǎng)基中的il-8的量。根據(jù)制造商提供的使用說明，測(cè)試所有測(cè)定法?？俽na分離：從匯合的產(chǎn)后衍生細(xì)胞和成纖維細(xì)胞提取rna，或?qū)τ趇l-8表達(dá)，由如上所述處理的細(xì)胞提取rna。根據(jù)制造商的說明書(小量提取試劑盒；qiagen，valencia，calif)用350微升包含β-巰基乙醇的緩沖液rlt(sigma，st.louis，mo.)裂解細(xì)胞。根據(jù)制造商的說明書(小量提取試劑盒；qiagen，valencia，calif)提取rna并使其經(jīng)受dnase處理(2.7u/樣本)(sigmast.louis，mo.)。用50微升經(jīng)depc處理的水洗脫rna并在-80℃下保存。逆轉(zhuǎn)錄：也從人胎盤和臍中提取rna。將組織(30毫克)懸浮于700微升含有2-巰基乙醇的緩沖液rlt中。將樣本進(jìn)行機(jī)械勻漿，并根據(jù)制造商說明書進(jìn)行rna提取。rna用50微升經(jīng)depc處理的水提取并保存于-80℃下。使用隨機(jī)六聚體和逆轉(zhuǎn)錄試劑(appliedbiosystems，fostercity，calif.)以25℃下10分鐘、37℃下60分鐘和95℃下10分鐘，對(duì)rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。將樣本保存于-20℃下。使用實(shí)時(shí)和常規(guī)pcr進(jìn)一步研究cdna微陣列識(shí)別為產(chǎn)后細(xì)胞中獨(dú)特調(diào)控的基因(標(biāo)簽基因——包括氧化ldl受體、白介素-8、凝乳酶和漿膜蛋白)。實(shí)時(shí)pcr：pcr使用基因表達(dá)產(chǎn)品在cdna樣本上進(jìn)行：根據(jù)制造商的說明書(appliedbiosystems，fostercity，calif.)使用具有abiprism7000sds軟件(appliedbiosystems，fostercity，calif.)的7000序列檢測(cè)系統(tǒng)將氧化ldl受體(hs00234028)；凝乳酶(hs00166915)；漿膜蛋白(hs00382515)；cxc配體3(hs00171061)；gcp-2(hs00605742)；il-8(hs00174103)；以及gapdh(appliedbiosystems，fostercity，calif.)與cdna和通用pcr主混合物混合。熱循環(huán)條件為初始50℃下2分鐘和95℃下10分鐘，隨后為95℃下15秒和60℃下1分鐘的40個(gè)循環(huán)。根據(jù)制造商的說明書(使用者手冊(cè)#2，得自appliedbiosystems，abiprism7700序列檢測(cè)系統(tǒng))分析pcr數(shù)據(jù)。常規(guī)pcr：使用abiprism7700(perkinelmerappliedbiosystems，boston，mass.，usa)進(jìn)行常規(guī)pcr以驗(yàn)證實(shí)時(shí)pcr得出的結(jié)果。使用2微升的cdna溶液、1xamplitaqgold通用混合物pcr反應(yīng)緩沖液(appliedbiosystems，fostercity，calif.)和94℃5分鐘的最初變性進(jìn)行pcr。針對(duì)每個(gè)引物對(duì)優(yōu)化擴(kuò)增。對(duì)于il-8、cxc配體3和漿膜蛋白(94℃下15秒，55℃下15秒和72℃下30秒，30個(gè)循環(huán))；對(duì)于凝乳酶(94℃下15秒，53℃下15秒和72℃下30秒，38個(gè)循環(huán))；對(duì)于氧化ldl受體1和gapdh(94℃下15秒，55℃下15秒和72℃下30秒，33個(gè)循環(huán))。用于擴(kuò)增的引物列于表11-1中。最終pcr反應(yīng)物中引物濃度為1微摩爾，不同的是gapdh，其為0.5微摩爾。gapdh引物與實(shí)時(shí)pcr相同，不同的是未將制造商的探針添加于最終pcr反應(yīng)物中。將樣本在2％(w/v)瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，并用溴化乙錠(sigma，st.louis，mo.)染色。用667universaltwinpack膠片(vwrinternational，southplainfield，n.j.)和焦距寶麗來(polaroid)照相機(jī)(vwrinternational，southplainfield，n.j.)采集圖像。表11-1：使用的引物免疫熒光：使用冷4％(w/v)多聚甲醛(sigma-aldrich，st.louis，mo.)在室溫下固定ppdc10分鐘。使用臍和胎盤衍生的細(xì)胞在第0代(po)(在分離后直接)和第11代(p11)各一個(gè)分離物(胎盤衍生的細(xì)胞的兩個(gè)分離物，臍衍生的細(xì)胞的兩個(gè)分離物)和成纖維細(xì)胞(p11)。使用針對(duì)以下表位的抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析：波形蛋白(1∶500，sigma，st.louis，mo.)、結(jié)蛋白(1∶150；sigma--針對(duì)兔產(chǎn)生；或1∶300；chemicon，temecula，calif--針對(duì)小鼠產(chǎn)生)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(sma；1∶400；sigma)、細(xì)胞角蛋白18(ck18；1∶400；sigma)、血管性血友病因子(vwf；1∶200；sigma)以及cd34(人cd34iii類；1∶100；dakocytomation，carpinteria，calif)。此外，在第11代產(chǎn)后細(xì)胞上測(cè)試以下標(biāo)志物：抗人groα--pe(1：100；bectondickinson，franklinlakes，n.j.)、抗人gcp-2(1：100；santacruzbiotech，santacruz，calif)、抗人氧化ldl受體1(ox-ldlr1；1∶100；santacruzbiotech)、以及抗人noga-a(1∶100；santacruzbiotech)。將培養(yǎng)物用磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)洗滌，并暴露于含pbs、4％(v/v)山羊血清(chemicon，temecula，calif)和0.3％(v/v)的triton(tritonx-100；sigma，st.louis，mo.)的蛋白質(zhì)阻斷溶液30分鐘以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)抗原。在所關(guān)注表位位于細(xì)胞表面上(cd34、ox-ldlr1)的情況下，在流程的所有步驟中省略tritonx-100以防止表位丟失。此外，在一抗通過免疫山羊制備(gcp-2、ox-ldlr1、nogo-a)的情況下，在整個(gè)過程中使用3％(v/v)驢血清替代山羊血清。一抗在阻斷溶液中稀釋后，加到培養(yǎng)物上在室溫下保持1小時(shí)。去除一抗溶液，并且在施加含阻斷劑連同山羊抗-小鼠igg--德克薩斯紅(1∶250；molecularprobes，eugene，oreg.)和/或山羊抗兔igg--alexa488(1∶250；molecularprobes)或驢抗山羊igg--fitc(1∶150；santacruzbiotech)的二抗溶液(室溫下1小時(shí))之前用pbs洗滌培養(yǎng)物。然后洗滌培養(yǎng)物，并且施加10微摩爾dapi(molecularprobes)10分鐘，使細(xì)胞核顯色。經(jīng)過免疫染色后，使用在倒置表面熒光顯微鏡(olympus，melville，n.y.)上的適當(dāng)熒光濾光器顯現(xiàn)熒光。在所有情況下，陽(yáng)性染色表示超過對(duì)照染色的熒光信號(hào)，其中除了施用一抗溶液外遵循上述所有流程。使用彩色數(shù)碼攝像機(jī)和軟件(mediacybernetics，carlsbad，calif)捕獲代表性圖像。對(duì)于三染樣本，每幅圖像每次僅用一個(gè)濾光片拍攝。使用adobe軟件(adobe，sanjose，calif)制作分層剪輯。制備細(xì)胞以進(jìn)行facs分析：在磷酸鹽緩沖鹽水溶液(pbs)(gibco，carlsbad，calif)中洗滌燒瓶中的貼壁細(xì)胞，并用胰蛋白酶/edta(gibco，carlsbad，calif)脫離。將細(xì)胞收獲、離心并以每毫升1×107個(gè)的細(xì)胞濃度重懸于pbs中的3％(v/v)fbs中。將一百微升等分試樣遞送至錐形管中。使用perm/wash緩沖液(bdpharmingen，sandiego，calif)對(duì)已對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗原染色的細(xì)胞進(jìn)行透化處理。根據(jù)制造商的說明書，將抗體加入等分試樣中，并將細(xì)胞在4℃下在黑暗中孵育30分鐘。在孵育之后，將細(xì)胞用pbs洗滌并離心以移除過量的抗體。將需要二抗的細(xì)胞重懸于100微升3％fbs中。根據(jù)制造商的說明書添加二抗并將細(xì)胞在4℃下在黑暗中孵育30分鐘。在孵育之后，將細(xì)胞用pbs洗滌并離心以移除過量的二抗。將洗滌后的細(xì)胞重懸于0.5毫升pbs中并用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。使用以下抗體：氧化ldl受體1(sc-5813；santacruz，biotech)、groa(555042；bdpharmingen，bedford，mass.)、小鼠igg1κ(p-4685和m-5284；sigma)、驢抗山羊igg(sc-3743；santacruz，biotech.)。用facscaliburtm(bectondickinson，sanjose，calif.)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。結(jié)果對(duì)源于人胎盤、成人和新生兒成纖維細(xì)胞以及間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)的細(xì)胞的cdna進(jìn)行的用于所選“標(biāo)簽”基因的實(shí)時(shí)pcr結(jié)果指示，與其它細(xì)胞相比較，氧化ldl受體和凝乳酶兩者以更高的水平在胎盤衍生的細(xì)胞中表達(dá)。通過aact方法分析得自實(shí)時(shí)pcr的數(shù)據(jù)并以對(duì)數(shù)尺度表示。漿膜蛋白和氧化ldl受體表達(dá)的水平在臍衍生的細(xì)胞中比其它細(xì)胞中更高。在產(chǎn)后衍生細(xì)胞與對(duì)照之間未發(fā)現(xiàn)cxc配體3和gcp-2的表達(dá)水平的顯著差異。通過常規(guī)pcr驗(yàn)證實(shí)時(shí)pcr的結(jié)果。pcr產(chǎn)物的測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證了這些觀察結(jié)果。使用上表11-1列出的常規(guī)pcrcxc配體3引物，在產(chǎn)后衍生細(xì)胞與對(duì)照之間未發(fā)現(xiàn)cxc配體3的表達(dá)水平的顯著差異。產(chǎn)后細(xì)胞中細(xì)胞因子il-8的產(chǎn)量在生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)的和血清饑餓的產(chǎn)后來源細(xì)胞中升高。所有實(shí)時(shí)pcr數(shù)據(jù)用常規(guī)pcr并通過測(cè)序pcr產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證。當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞的上清液中檢測(cè)il-8的存在性時(shí)，在來源于臍帶細(xì)胞和胎盤細(xì)胞的一些分離株的培養(yǎng)基中檢測(cè)到最高量(表11-2)。在來源于人表皮成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基中未檢測(cè)到il-8。表11-2：通過elisa測(cè)量的il-8蛋白質(zhì)表達(dá)nd：未檢測(cè)到還通過facs針對(duì)氧化ldl受體、gcp-2和groα的產(chǎn)生檢測(cè)胎盤衍生的細(xì)胞。所測(cè)細(xì)胞對(duì)gcp-2呈陽(yáng)性。該方法并未檢測(cè)到氧化ldl受體和gro。還通過免疫細(xì)胞化學(xué)分析針對(duì)所選蛋白質(zhì)的產(chǎn)生測(cè)試胎盤衍生的細(xì)胞。在剛分離(第0代)之后，將人胎盤衍生的細(xì)胞用4％低聚甲醛固定并暴露于六種蛋白質(zhì)的抗體：血管性血友病因子、cd34、細(xì)胞角蛋白18、結(jié)蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和波形蛋白。細(xì)胞對(duì)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和波形蛋白兩者呈正柒。該模式在整個(gè)11代均得以保持。僅少數(shù)第0代細(xì)胞(＜5％)對(duì)細(xì)胞角蛋白18呈正染。通過免疫細(xì)胞化學(xué)分析，針對(duì)所選蛋白質(zhì)的產(chǎn)生探測(cè)在第0代時(shí)源于人臍帶的細(xì)胞。在剛分離(第0代)之后，將細(xì)胞用4％低聚甲醛固定并暴露于六種蛋白質(zhì)的抗體：血管性血友病因子、cd34、細(xì)胞角蛋白18、結(jié)蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和波形蛋白。臍衍生的細(xì)胞對(duì)于α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和波形蛋白是陽(yáng)性的，其中染色模式直到第11代是一致的?？偨Y(jié)：通過微陣列和pcr(實(shí)時(shí)和常規(guī)兩種)已確定如下四種基因的基因表達(dá)水平之間的一致性：氧化ldl受體1、凝乳酶、漿膜蛋白和il-8。這些基因的表達(dá)在ppdc的mrna水平受到差異調(diào)控，且il-8在蛋白水平也受到差異調(diào)控。在源于胎盤的細(xì)胞中，并未通過facs分析在蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)到氧化ldl受體的存在。gcp-2和cxc配體3的差異表達(dá)并未在mrna水平上得到證實(shí)，然而，通過facs在胎盤衍生的細(xì)胞中在蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)到gcp-2。盡管該結(jié)果并未由最初得自微陣列實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)反映出，但這可能是由于方法靈敏度中的差異。在剛分離(第0代)之后，人胎盤衍生的細(xì)胞對(duì)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和波形蛋白兩者呈正染。也在第11代觀察到該模式。波形蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)可在生長(zhǎng)培養(yǎng)基和在這些過程中利用的條件下隨傳代進(jìn)行而在細(xì)胞中得以維持。針對(duì)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和波形蛋白的表達(dá)，探測(cè)在第0代時(shí)源于人臍帶的細(xì)胞，并且該細(xì)胞對(duì)于α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和波形蛋白均是陽(yáng)性的。染色模式在整個(gè)11代均得以保持。實(shí)施例12產(chǎn)后衍生細(xì)胞的體外免疫學(xué)評(píng)價(jià)體外評(píng)價(jià)產(chǎn)后來源細(xì)胞(ppdc)的免疫學(xué)特性，以便預(yù)測(cè)在體內(nèi)移植時(shí)這些細(xì)胞是否會(huì)引發(fā)任何免疫反應(yīng)。通過流式細(xì)胞術(shù)分析ppdc是否存在hla-dr、hla-dp、hla-dq、cd80、cd86和b7-h2。這些蛋白由抗原遞呈細(xì)胞(ape)表達(dá)并且是初始cd4+t細(xì)胞的直接刺激所需的(abbas&lichtman，cellularandmolecularimmunology，第5版(2003)saunders，philadelphia，第171頁(yè))。還通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞系對(duì)hla-g(abbas&lichtman，2003，supra)、cd178(coumans等人，(1999)journalofimmunologicalmethods224，185-196)和pd-l2(abbas&lichtman，2003，同上；brown等人(2003)thejournalofimmunology，170：1257-1266)的表達(dá)。存在于胎盤組織中的細(xì)胞對(duì)這些蛋白的表達(dá)被認(rèn)為介導(dǎo)子宮內(nèi)胎盤組織的免疫豁免狀態(tài)。為了預(yù)測(cè)胎盤和臍衍生的細(xì)胞系在體內(nèi)引發(fā)免疫應(yīng)答的程度，在單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mlr)中測(cè)試所述細(xì)胞系。方法及材料細(xì)胞培養(yǎng)：在包被有2％明膠(sigma，st.louis，mo.)的t75燒瓶(corninginc.，corning，n.y.)中的含有青霉素/鏈霉素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，將細(xì)胞培養(yǎng)至匯合?？贵w染色：在磷酸鹽緩沖鹽水溶液(pbs)(gibco，carlsbad，calif.)中洗滌細(xì)胞，并用胰蛋白酶/edta(gibco，carlsbad，mo.)脫離。將細(xì)胞收獲、離心并以每毫升1×107個(gè)的細(xì)胞濃度重懸于pbs中的3％(v/v)fbs中。根據(jù)制造商的說明書，將抗體(表12-1)加入一百微升的細(xì)胞懸浮液中并在4℃下于黑暗中孵育30分鐘。在孵育之后，將細(xì)胞用pbs洗滌并離心以移除未結(jié)合的抗體。將細(xì)胞重懸浮于五百微升pbs中，并使用facscaliburtm儀器(bectondickinson，sanjose，calif.)通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。表12-1：抗體抗體制造商目錄號(hào)hla-drdpdqbdpharmingen(sandiego，ca)555558cd80bdpharmingen(sandiego，ca)557227cd86bdpharmingen(sandiego，ca)555665b7-h2bdpharmingen(sandiego，ca)552502hla-gabcam(cambridgeshire，uk)ab7904-100cd178santacruz(sancruz，ca)sc-19681pd-l2bdpharmingen(sandiego，ca)557846小鼠igg2asigma(st.louis，mo)f-6522小鼠igg1κsigma(st.louis，mo)p-4685混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)：將標(biāo)記為細(xì)胞系a的10代臍衍生的細(xì)胞和標(biāo)記為細(xì)胞系b的11代胎盤衍生的細(xì)胞的凍存小瓶放在干冰上運(yùn)送至ctbr(ctbr(senneville，quebec)，以使用ctbrsopno.cac-031進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。從多個(gè)男性和女性志愿捐獻(xiàn)者收集外周血單核細(xì)胞(pbmc)。用絲裂霉素c處理刺激物(供體)同種異體pbmc、自體pbmc和產(chǎn)后細(xì)胞系。將自體和絲裂霉素c處理的刺激細(xì)胞添加至應(yīng)答(受體)pbmc并培養(yǎng)4天。孵育后，將[3h]胸腺嘧啶核苷添加至每種樣本并培養(yǎng)18小時(shí)。收獲細(xì)胞后，提取放射性標(biāo)記的dna并使用閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定[3h]-胸腺嘧啶核苷結(jié)合。將同種異體供體(siad)的刺激指數(shù)計(jì)算為接受者加絲裂霉素c處理的同種異體供體的平均增殖再除以接受者的基線增殖。將ppdc的刺激指數(shù)計(jì)算為接受者加絲裂霉素c處理的產(chǎn)后細(xì)胞系的平均增殖率再除以接受者的基線增殖率。結(jié)果混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)--胎盤衍生的細(xì)胞：篩選七名人志愿獻(xiàn)血者，以鑒定出在與其它六名獻(xiàn)血者的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中顯示出強(qiáng)增殖應(yīng)答的單個(gè)同種異體供體。將該供體選擇為同種異體陽(yáng)性對(duì)照供體。將剩余的六名獻(xiàn)血者選擇為受體。將異源陽(yáng)性對(duì)照供體和胎盤衍生的細(xì)胞系用絲裂霉素c處理并培養(yǎng)于混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)物中使其與六種單獨(dú)的異源受體反應(yīng)。使用具有三種受體/板的兩個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板，一式三份進(jìn)行反應(yīng)(表12-2)。平均刺激指數(shù)在1.3(板2)至3(板1)的范圍內(nèi)，并且同種異體供體陽(yáng)性對(duì)照在46.25(板2)至279(板1)的范圍內(nèi)(表12-3)。表12-2：混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)數(shù)據(jù)-細(xì)胞系b(胎盤)板id：板2表12-3：在與六種單獨(dú)的同種異體接受者的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中胎盤細(xì)胞和同種異體供體的平均刺激指數(shù)。混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)--臍衍生的細(xì)胞：篩查六名人志愿獻(xiàn)血者，以鑒定出在與其它五名獻(xiàn)血者的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中將表現(xiàn)穩(wěn)健增殖反應(yīng)的單個(gè)異源供體。將該供體選擇為同種異體陽(yáng)性對(duì)照供體。將剩余的五名獻(xiàn)血者選擇為受體。將異源陽(yáng)性對(duì)照供體和胎盤細(xì)胞系用絲裂霉素處理并培養(yǎng)于混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)物中使其與五種單獨(dú)的異源接受者反應(yīng)。使用具有三種接受者/板的兩個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板，一式三份進(jìn)行反應(yīng)(表12-4)。平均刺激指數(shù)在6.5(板1)至9(板2)的范圍內(nèi)，并且同種異體供體陽(yáng)性對(duì)照在42.75(板1)至70(板2)的范圍內(nèi)(表12-5)。表12-4：混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)數(shù)據(jù)-細(xì)胞系a(臍帶)增殖測(cè)定法的dpm板id：板1板id：板2表12-5：在與五種單獨(dú)的異源接受者的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中臍帶衍生的細(xì)胞和異源供體的平均刺激指數(shù)。受體臍帶板1(接受者1-4)42.756.5板2(接受者5)709抗原遞呈細(xì)胞標(biāo)志物-胎盤衍生的細(xì)胞：流式細(xì)胞術(shù)分析的胎盤衍生的細(xì)胞的直方圖示出了hla-dr、dp、dq、cd80、cd86和b7-h2的陰性表達(dá)，如與igg對(duì)照一致的熒光值所指出的，這表明胎盤細(xì)胞系缺少直接刺激cd4+t細(xì)胞所需的細(xì)胞表面分子。免疫調(diào)節(jié)標(biāo)志物-胎盤衍生的細(xì)胞：流式細(xì)胞術(shù)分析的胎盤衍生的細(xì)胞的直方圖示出了pd-l2的陽(yáng)性表達(dá)，如相對(duì)于igg對(duì)照熒光值增加所指出的，并說明了cd178和hla-g的陰性表達(dá)，如與igg對(duì)照一致的熒光值所指出的?？乖f呈細(xì)胞標(biāo)志物-臍衍生的細(xì)胞：流式細(xì)胞術(shù)分析的臍衍生的細(xì)胞的直方圖示出了hla-dr、dp、dq、cd80、cd86和b7-h2的陰性表達(dá)，如與igg對(duì)照一致的熒光值所指出的，這表明臍細(xì)胞系缺少直接刺激cd4+t細(xì)胞所需的細(xì)胞表面分子。免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞標(biāo)志物-臍衍生的細(xì)胞：流式細(xì)胞術(shù)分析的臍衍生的細(xì)胞的直方圖示出了pd-l2的陽(yáng)性表達(dá)，如相對(duì)于igg對(duì)照熒光值增加所指出的，并說明了cd178和hla-g的陰性表達(dá)，如與igg對(duì)照一致的熒光值所指出的?？偨Y(jié)：在用胎盤衍生的細(xì)胞系進(jìn)行的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中，平均刺激指數(shù)在1.3至3的范圍內(nèi)，并且同種異體陽(yáng)性對(duì)照的平均刺激指數(shù)在46.25至279的范圍內(nèi)。在用臍衍生的細(xì)胞系進(jìn)行的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中，平均刺激指數(shù)在6.5至9的范圍內(nèi)，并且同種異體陽(yáng)性對(duì)照的平均刺激指數(shù)在42.75至70的范圍內(nèi)。胎盤和臍衍生的細(xì)胞系對(duì)于刺激蛋白hla-dr、hla-dp、hla-dq、cd80、cd86和b7-h2的表達(dá)是陰性的，如通過流式細(xì)胞術(shù)所測(cè)定的。胎盤和臍衍生的細(xì)胞系對(duì)于免疫調(diào)節(jié)蛋白hla-g和cd178的表達(dá)是陰性的，并且對(duì)于pd-l2的表達(dá)是陽(yáng)性的，如通過流式細(xì)胞術(shù)所測(cè)定的。異源供體pbmc包含表達(dá)hla-dr、dq、cd8、cd86和b7-h2的抗原遞呈細(xì)胞，從而允許刺激初始cd4+t細(xì)胞。胎盤和臍衍生的細(xì)胞上缺少初始cd4+t細(xì)胞直接刺激所需的抗原遞呈細(xì)胞表面分子以及存在免疫調(diào)節(jié)蛋白pd-l2，可導(dǎo)致與異源對(duì)照相比這些細(xì)胞在mlr中表現(xiàn)出低刺激指數(shù)。實(shí)施例13產(chǎn)后衍生細(xì)胞分泌的營(yíng)養(yǎng)因子測(cè)定所選營(yíng)養(yǎng)因子從胎盤和臍衍生的細(xì)胞的分泌。選擇用于檢測(cè)的因子包括：(1)已知具有血管生成活性的那些，例如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hgf)(rosen等人(1997)cibafound.symp.212：215-26)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(mcp-1)(salcedo等人(2000)blood96；34-40)、白介素-8(il-8)(li等人(2003)j.immunol.170：3369-76)、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(kgf)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bfgf)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)(hughes等人.(2004)ann.thorac.surg.77：812-8)、基質(zhì)金屬蛋白酶1(timp1)、促血管生成素2(ang2)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(pdgf-bb)、促血小板生成素(tpo)、肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子(hb-egf)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α(sdf-1α)；(2)已知具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)/神經(jīng)保護(hù)活性的那些，例如腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(bdnf)(cheng等人(2003)dev.biol.258；319-33)、白介素-6(il-6)、粒細(xì)胞趨化蛋白-2(gcp-2)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(tgfβ2)；以及(3)已知具有趨化因子活性的那些，例如巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α(mip1a)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白1β(mip1b)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(mcp-1)、rantes(調(diào)節(jié)激活正常t細(xì)胞表達(dá)和分泌)、i309、胸腺活化調(diào)節(jié)趨化因子(tare)、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子、巨噬細(xì)胞衍生趨化因子(mdc)、il-8。方法及材料細(xì)胞培養(yǎng)：將得自胎盤和臍的ppdc以及源于人新生兒包皮的人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于明膠包被的t75燒瓶中的含有青霉素/鏈霉素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。凍存第11代的細(xì)胞并保存在液氮中。細(xì)胞解凍后，將生長(zhǎng)培養(yǎng)基添加至所述細(xì)胞，接著轉(zhuǎn)移到15毫升離心管中并以150xg將細(xì)胞離心5分鐘。棄去上清液。將細(xì)胞沉淀物重懸于4毫升生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。將細(xì)胞以375,000個(gè)細(xì)胞/75cm2含有15毫升生長(zhǎng)培養(yǎng)基的燒瓶接種，并培養(yǎng)24小時(shí)。將培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基(dmem-低葡萄糖(gibco)，0.1％(w/v)牛血清白蛋白(sigma)，青霉素/鏈霉素(gibco))并培養(yǎng)8小時(shí)。在溫育結(jié)束時(shí)通過在14,000xg下離心5分鐘收集條件無血清培養(yǎng)基，并保存于-20℃下。為了估算每個(gè)燒瓶中的細(xì)胞數(shù)量，用pbs洗滌細(xì)胞，并使用2毫升胰蛋白酶/edta分離。通過添加8毫升生長(zhǎng)培養(yǎng)基來抑制胰蛋白酶活性。以150xg將細(xì)胞離心5分鐘。去除上清液，并將細(xì)胞重懸于1毫升生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。使用血球計(jì)估算細(xì)胞數(shù)量。elisa測(cè)定：使細(xì)胞在37℃下于5％二氧化碳和大氣氧中生長(zhǎng)。也將胎盤來源細(xì)胞(批號(hào)101503)培養(yǎng)于5％氧氣或β-巰基乙醇(bme)中。通過elisa測(cè)定法(r&dsystems，minneapolis，minn.)測(cè)定每個(gè)細(xì)胞樣本產(chǎn)生的mcp-1、il-6、vegf、sdf-1α、gcp-2、il-8和tgf-β2的量。所有測(cè)定法均根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行。searchlighttm多路elisa測(cè)定：使用searchlighttm蛋白質(zhì)組陣列(piercebiotechnologyinc.)測(cè)定趨化因子(mip1a、mip1b、mcp-1、rantes、1309、tarc、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子、mdc、il8)、bdnf和血管生成因子(hgf、kgf、bfgf、vegf、timp1、ang2、pdgf-bb、tpo、hb-egf)。蛋白質(zhì)組陣列為用于定量測(cè)定每孔2至16種蛋白的多重夾心elisa。通過以2×2、3×3或4×4的模式將4至16種不同捕獲抗體點(diǎn)樣于96孔板的每孔中，來產(chǎn)生陣列。夾心elisa流程后，對(duì)整塊板拍照以采集板的每孔內(nèi)每個(gè)點(diǎn)樣處產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。每個(gè)點(diǎn)樣中產(chǎn)生的信號(hào)量與原標(biāo)準(zhǔn)品或樣本中的靶蛋白的量成比例。結(jié)果elisa測(cè)定：mcp-1和il-6由胎盤和臍衍生的細(xì)胞和表皮成纖維細(xì)胞分泌(表13-1)。sdf-1α由5％o2中培養(yǎng)的胎盤衍生的細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌。gcp-2和il-8由在bme或5％o2存在下所培養(yǎng)的臍衍生的細(xì)胞和胎盤衍生的細(xì)胞分泌。gcp-2也由人成纖維細(xì)胞分泌。elisa測(cè)定法不可檢測(cè)tgf-β2。表13-1：elisa結(jié)果：營(yíng)養(yǎng)因子的檢測(cè)關(guān)鍵：nd：未檢測(cè)到，＝/-semsearchlighttm多路elisa測(cè)定法：timp1、tpo、kgf、hgf、fgf、hbegf、bdnf、mip1b、mcp1、rantes、i309、tarc、mdc和il-8由臍衍生的細(xì)胞分泌(表13-2和13-3)。timp1、tpo、kgf、hgf、hbegf、bdnf、mip1a、mcp-1、rantes、tarc、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子和il-8由胎盤衍生的細(xì)胞分泌(表13-2和13-3)。未檢測(cè)到ang2、vegf或pdgf-bb。表13-2：searchlight多路elisa測(cè)定結(jié)果關(guān)鍵：hfb(人成纖維細(xì)胞)，p1(胎盤衍生的細(xì)胞(042303))，u1(臍衍生的細(xì)胞(022803))，p3(胎盤衍生的細(xì)胞(071003))，u3(臍衍生的細(xì)胞(071003))。nd：未檢測(cè)到。表13-3：searchlight多路elisa測(cè)定結(jié)果關(guān)鍵：hfb(人成纖維細(xì)胞)，p1(胎盤衍生的ppdc(042303))，u1(臍衍生的ppdc(022803))，p3(胎盤衍生的ppdc(071003))，u3(臍衍生的ppdc(071003))。nd：未檢測(cè)到。實(shí)施例14產(chǎn)后衍生細(xì)胞的短期神經(jīng)分化檢測(cè)胎盤和臍衍生的細(xì)胞(共稱為產(chǎn)后衍生細(xì)胞或ppdc)分化成神經(jīng)譜系細(xì)胞的能力。方法及材料產(chǎn)后細(xì)胞的分離和擴(kuò)增：分離得自胎盤和臍組織的ppdc并如實(shí)施例6所述的那樣擴(kuò)增。改進(jìn)的woodbury-black方案(a)：該測(cè)定改編自最初實(shí)施以測(cè)試骨髓基質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)誘導(dǎo)潛力的測(cè)定(1)。解凍臍衍生的細(xì)胞(022803)p4和胎盤衍生的細(xì)胞(042203)p3并使培養(yǎng)物在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中以5,000個(gè)細(xì)胞/cm2擴(kuò)增直至達(dá)到近匯合(75％)。然后使細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶消化并以6,000個(gè)細(xì)胞/孔接種于titretekii載玻片(vwrinternational，bristol，conn.)。作為對(duì)照，也在相同條件下接種間充質(zhì)干細(xì)胞(p3；1f2155；cambrex，walkersville，md.)、成骨細(xì)胞(p5；cc2538；cambrex)、脂肪衍生的細(xì)胞(artecel，美國(guó)專利6,555,374b1)(p6；供體2)和新生人表皮成纖維細(xì)胞(p6；cc2509；cambrex)。將所有細(xì)胞最初在包含15％(v/v)胎牛血清(fbs；hyclone，logan，utah)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bfgf；20納克/毫升；peprotech，rockyhill，n.j.)、表皮生長(zhǎng)因子(egf；20納克/毫升；peprotech)和青霉素/鏈霉素(invitrogen)的dmem/f12培養(yǎng)基(invitrogen，carlsbad，calif.)中擴(kuò)增4天。在四天后，將細(xì)胞在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs；invitrogen)中沖洗并隨后在dmem/f12培養(yǎng)基+20％(v/v)fbs+青霉素/鏈霉素中培養(yǎng)24小時(shí)。在24小時(shí)之后，將細(xì)胞用pbs沖洗。然后將細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-6小時(shí)，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基由包含200mm丁基化羥基苯甲醚、10μm氯化鉀、5毫克/毫升胰島素、10μm毛喉素、4μm丙戊酸和2μm皮質(zhì)醇(所有化學(xué)品均得自sigma，st.louis，mo.)的dmem/fi2(無血清)組成。接著將細(xì)胞固定于100％冰冷的甲醇中并進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)分析(參見下文方法)以評(píng)估人巢蛋白的表達(dá)。改進(jìn)的woodbury-black方案(b)：解凍ppdc(臍(022803)p11；胎盤(042203)p11和成人真皮成纖維細(xì)胞(1f1853，p11)并使培養(yǎng)物在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中以5,000個(gè)細(xì)胞/cm2擴(kuò)增直至達(dá)到近匯合(75％)。然后使細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶消化并以類似于(a)的密度接種，但是接種到(1)24孔組織培養(yǎng)物處理的板(tcp，falconbrand，vwrinternational)，(2)tcp孔+室溫下吸附1小時(shí)的2％(w/v)明膠，或者(3)tcp孔+20μg/毫升的吸附的小鼠層粘連蛋白(在37℃下吸附最低2小時(shí)；invitrogen)上。正如(a)中的情況，使細(xì)胞初始擴(kuò)增并在前述時(shí)間段替換培養(yǎng)基。如前所述在第5天6小時(shí)的時(shí)候固定一組培養(yǎng)物，此時(shí)用冰冷的4％(w/v)多聚甲醛(sigma)在室溫下固定10分鐘。在第二組培養(yǎng)物中，移除培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)換成神經(jīng)祖細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基(npe)，該神經(jīng)祖細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基由包含b27(b27補(bǔ)充劑；invitrogen)、l-谷氨酰胺(4mm)和青霉素/鏈霉素(invitrogen)的neurobasal-a培養(yǎng)基(invitrogen)組成。npe培養(yǎng)基進(jìn)一步補(bǔ)充有視黃酸(ra；1μm；sigma)。4天之后移除該培養(yǎng)基并將培養(yǎng)物用冰冷的4％(w/v)多聚甲醛(sigma)在室溫下固定10分鐘，并且染色以進(jìn)行巢蛋白、gfap和tuj1蛋白質(zhì)表達(dá)(參見表14-1)。表14-1：所用一抗匯總兩階段分化方案：解凍ppdc(臍(042203)p11，胎盤(022803)p11)、成人真皮成纖維細(xì)胞(p11；1f1853；cambrex)并使培養(yǎng)物在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中以5,000個(gè)細(xì)胞/cm2擴(kuò)增直至達(dá)到近匯合(75％)。然后使細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶消化并以2,000個(gè)細(xì)胞/cm2接種，但在補(bǔ)充有bfgf(20納克/毫升；peprotech，rockyhill，n.j.)和egf(20納克/毫升；peprotech)的npe培養(yǎng)基[整個(gè)培養(yǎng)基組合物被進(jìn)一步稱為npe+f+e]的存在下接種到經(jīng)層粘連蛋白包被的24孔板(bdbiosciences，franklinlakes，n.j.)上。同時(shí)，也將從海馬(p4；062603)分離的成鼠神經(jīng)祖細(xì)胞鋪到24孔層粘連蛋白包被的板的npe+f+e培養(yǎng)基中。將所有培養(yǎng)物在此類條件下維持6天時(shí)間(在該時(shí)間內(nèi)喂養(yǎng)細(xì)胞一次)，此時(shí)將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換成表14-2所列的分化條件再進(jìn)行7天。將培養(yǎng)物用冰冷的4％(w/v)多聚甲醛(sigma)在室溫下固定10分鐘，并且染色以進(jìn)行人或大鼠巢蛋白、gfap和tuj1蛋白質(zhì)表達(dá)。表14-2：用于兩階段分化的條件匯總多生長(zhǎng)因子方案：解凍臍衍生的細(xì)胞(p11；(042203))并使培養(yǎng)物在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中以5,000個(gè)細(xì)胞/cm2擴(kuò)增直至達(dá)到近匯合(75％)。然后使細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶消化并在npe+f(20納克/毫升)+e(20納克/毫升)存在下以2,000個(gè)細(xì)胞/cm2接種到24孔層粘連蛋白包被的板(bdbiosciences)上。此外，一些孔包含npe+f+e+2％fbs或10％fbs。在“預(yù)分化”條件四天后，移除所有培養(yǎng)基并將樣本轉(zhuǎn)換到補(bǔ)充有音猬因子(shh；200納克/毫升；sigma，st.louis，mo.)、fgf8(100納克/毫升；peprotech)、bdnf(40納克/毫升；sigma)、gdnf(20納克/毫升；sigma)和視黃酸(1μm；sigma)的npe培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)基更換后七天，將培養(yǎng)物用冰冷的4％(w/v)多聚甲醛(sigma)在室溫下固定10分鐘，并且染色以進(jìn)行人巢蛋白、gfap和tuj1、結(jié)蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)。神經(jīng)祖細(xì)胞共培養(yǎng)方案：將成鼠海馬祖細(xì)胞(062603)作為神經(jīng)球或單細(xì)胞(10,000個(gè)細(xì)胞/孔)鋪板到層粘連蛋白包被的24孔皿(bdbiosciences)的npe+f(20納克/毫升)+e(20納克/毫升)中。單獨(dú)地，解凍臍衍生的細(xì)胞(042203)p11和胎盤衍生的細(xì)胞(022803)p11并使培養(yǎng)物在npe+f(20納克/毫升)+e(20納克/毫升)中以5,000個(gè)細(xì)胞/cm2擴(kuò)增48小時(shí)。然后使細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶消化并以2,500個(gè)細(xì)胞/孔接種到神經(jīng)祖細(xì)胞的現(xiàn)有培養(yǎng)物上。此時(shí)，將現(xiàn)有培養(yǎng)基替換為新鮮培養(yǎng)基。在四天后，將培養(yǎng)物用冰冷的4％(w/v)多聚甲醛(sigma)在室溫下固定10分鐘，并且針對(duì)人核蛋白(hnuc；chemicon)(上表14-1)染色以鑒定ppdc。免疫細(xì)胞化學(xué)分析：免疫細(xì)胞化學(xué)使用表14-1列出的抗體進(jìn)行。將培養(yǎng)物用磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)洗滌，并暴露于含pbs、4％(v/v)山羊血清(chemicon，temecula，calif)和0.3％(v/v)的triton(tritonx-100；sigma)的蛋白質(zhì)阻斷溶液30分鐘以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)抗原。一抗在阻斷溶液中稀釋后，加到培養(yǎng)物上在室溫下保持1小時(shí)。接著，去除一抗溶液，并且在施加含阻斷溶液連同山羊抗-小鼠igg--德克薩斯紅(1∶250；molecularprobes，eugene，oreg.)和山羊抗兔igg--alexa488(1∶250；molecularprobes)的二抗溶液(室溫下1小時(shí))之前用pbs洗滌培養(yǎng)物。然后洗滌培養(yǎng)物，并且施加10微摩爾dapi(molecularprobes)10分鐘，使細(xì)胞核顯色。經(jīng)過免疫染色后，使用適當(dāng)?shù)膴W林巴斯倒置表面熒光顯微鏡(olympus，melville，n.y.)觀察熒光。在所有情況下，陽(yáng)性染色表示超過對(duì)照染色的熒光信號(hào)，其中除了施用一抗溶液外遵循上述所有流程。使用彩色數(shù)碼攝像機(jī)和imagepro軟件(mediacybernetics，carlsbad，calif)捕獲代表性圖像。對(duì)于三染樣本，每幅圖像每次僅用一個(gè)濾光片拍攝。使用adobephotoshop軟件(adobe，sanjose，calif)制作分層剪輯。結(jié)果改進(jìn)的woodbury-black方案(a)：在該神經(jīng)誘導(dǎo)組合物中孵育時(shí)，所有細(xì)胞類型轉(zhuǎn)化成具有兩極形態(tài)和延伸突起的細(xì)胞。還觀察到其它更大的非兩極形態(tài)。此外，誘導(dǎo)的細(xì)胞群對(duì)巢蛋白即多能神經(jīng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞的標(biāo)志物呈正染。改進(jìn)的woodbury-black方案(b)：當(dāng)在組織培養(yǎng)塑料(tcp)皿上重復(fù)時(shí)，除非層粘連蛋白被預(yù)吸附到培養(yǎng)物表面，否則觀察不到巢蛋白表達(dá)。為進(jìn)一步評(píng)估表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞是否可隨后繼續(xù)產(chǎn)生成熟神經(jīng)元，將ppdc和成纖維細(xì)胞暴露于npe+ra(1μm)，即已知誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞分化成此類細(xì)胞的培養(yǎng)基組合物(2，3，4)。針對(duì)未成熟和成熟神經(jīng)元的標(biāo)志物tujl、星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物gfap和巢蛋白對(duì)細(xì)胞染色。在檢測(cè)不到tujl的條件下，觀察不到神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)胞。此外，ppdc不再表達(dá)巢蛋白和gfap，如由免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定。兩階段分化：將臍和胎盤ppdc分離物(以及分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞類型的人成纖維細(xì)胞和嚙齒動(dòng)物神經(jīng)祖細(xì)胞)鋪板到粘連蛋白(神經(jīng)促進(jìn))包被的皿上并暴露于已知促進(jìn)神經(jīng)祖細(xì)胞分化成神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的13種不同的生長(zhǎng)條件(和兩種對(duì)照條件)。此外，加入兩種條件以檢測(cè)gdf5和bmp7對(duì)ppdc分化的影響。一般來講，采用兩步分化方案，其中首先將細(xì)胞置于神經(jīng)祖細(xì)胞擴(kuò)增條件6天，隨后于完全分化條件7天。在形態(tài)學(xué)上，臍和胎盤衍生的細(xì)胞兩者在該過程的整個(gè)時(shí)程中均表現(xiàn)出細(xì)胞形態(tài)的根本性變化。然而，除在對(duì)照條件、神經(jīng)祖細(xì)胞鋪板的條件中之外，未觀察到神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞狀的細(xì)胞。對(duì)人巢蛋白、tuj1和gfap呈陰性的免疫細(xì)胞化學(xué)分析證實(shí)了形態(tài)學(xué)觀察。多種生長(zhǎng)因子：在暴露于多種神經(jīng)分化劑一周后，針對(duì)表示神經(jīng)祖細(xì)胞(人巢蛋白)、神經(jīng)元(tuj1)和星形膠質(zhì)細(xì)胞(gfap)的標(biāo)志物對(duì)細(xì)胞染色。在不含血清的培養(yǎng)基中第一階段生長(zhǎng)的細(xì)胞具有與在含血清(2％或10％)的培養(yǎng)基中的那些細(xì)胞不同的形態(tài)學(xué)，這指示潛在的細(xì)胞分化。具體地，在使臍衍生的細(xì)胞暴露于egf和bfgf，隨后暴露于shh、fgf8、gdnf、bdnf和視黃酸的兩步過程之后，細(xì)胞示出類似于培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的較長(zhǎng)延伸的突起。當(dāng)分化的第一階段中包括2％fbs或10％fbs時(shí)，細(xì)胞數(shù)目增加并且細(xì)胞形態(tài)與高密度的對(duì)照培養(yǎng)物相同。潛在的神經(jīng)分化并未通過對(duì)人巢蛋白、tuj1或gfap的免疫細(xì)胞化學(xué)分析加以證實(shí)。神經(jīng)祖細(xì)胞和ppdc共培養(yǎng)：將ppdc鋪板到比神經(jīng)擴(kuò)增條件(npe+f+e)早兩天接種的大鼠神經(jīng)祖細(xì)胞的培養(yǎng)物中。雖然鋪板ppdc的視覺的證實(shí)證明了這些細(xì)胞作為單細(xì)胞鋪板，但是在鋪板后4天的人特異性核染色(hnuc)(共6天)示出其趨于成球形并避免與神經(jīng)祖細(xì)胞接觸。此外，在ppdc貼壁的情況下，這些細(xì)胞展開并似乎受大鼠起源的分化神經(jīng)元神經(jīng)支配，這表明ppdc可分化成肌細(xì)胞。該觀察在相差顯微術(shù)下以形態(tài)為基礎(chǔ)。另一個(gè)觀察在于通常較大細(xì)胞體(大于神經(jīng)祖細(xì)胞)具有類似于神經(jīng)祖細(xì)胞的形態(tài)學(xué)，在多個(gè)方向上生出較薄突起。hnuc染色(存在于二分之一細(xì)胞核中)示出在一些情況下這些人細(xì)胞可與大鼠祖細(xì)胞融合且假定其表型。僅包含神經(jīng)祖細(xì)胞的對(duì)照具有比包含臍或胎盤ppdc的共培養(yǎng)物孔更少的總祖細(xì)胞和表觀分化細(xì)胞，這進(jìn)一步表明臍和胎盤衍生的細(xì)胞兩者通過釋放趨化因子和細(xì)胞因子或通過接觸介導(dǎo)的效應(yīng)影響神經(jīng)祖細(xì)胞的分化和行為。總結(jié)：實(shí)施多個(gè)方案以測(cè)定ppdc分化成神經(jīng)譜系細(xì)胞的短期潛力。這些包括將形態(tài)的相差顯微鏡成像與巢蛋白、tuj1和gfap的免疫細(xì)胞化學(xué)分析結(jié)合，所述巢蛋白、tuj1和gfap分別是與多能神經(jīng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞、未成熟和成熟神經(jīng)元、以及星形膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)。實(shí)施例15產(chǎn)后衍生細(xì)胞的長(zhǎng)期神經(jīng)分化評(píng)估臍和胎盤衍生的細(xì)胞(共稱為產(chǎn)后衍生細(xì)胞或ppdc)經(jīng)受長(zhǎng)期分化成神經(jīng)譜系細(xì)胞的能力。方法及材料ppdc的分離和擴(kuò)增：分離ppdc并如前面實(shí)施例所述的那樣擴(kuò)增。ppdc細(xì)胞解凍和鋪板：將先前在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的冷凍的ppdc等分試樣(臍(022803)p11；(042203)p11；(071003)p12；胎盤(101503)p7)解凍并以5,000個(gè)細(xì)胞/cm2鋪到經(jīng)層粘連蛋白包被的t-75燒瓶(bd，franklinlakes，n.j.)的neurobasal-a培養(yǎng)基(invitrogen，carlsbad，calif.)中，所述neurobasal-a培養(yǎng)基包含b27(b27補(bǔ)充劑，invitrogen)、l-谷氨酰胺(4mm)和青霉素/鏈霉素(10毫升)，該組合在本文稱為神經(jīng)祖細(xì)胞擴(kuò)增(npe)培養(yǎng)基。使npe培養(yǎng)基進(jìn)一步補(bǔ)充bfgf(20納克/毫升，peprotech，rockyhill，n.j.)和egf(20納克/毫升，peprotech，rockyhill，n.j.)，本文稱之為npe+bfgf+egf。對(duì)照細(xì)胞鋪板：此外，解凍成人真皮成纖維細(xì)胞(p11，cambrex，walkersville，md.)和間充質(zhì)干細(xì)胞(p5，cambrex)并以相同的細(xì)胞接種密度鋪板于經(jīng)層粘連蛋白包被的t-75燒瓶的npe+bfgf+egf中。作為進(jìn)一步對(duì)照，使成纖維細(xì)胞、臍和胎盤ppdc生長(zhǎng)于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中(對(duì)所有培養(yǎng)物而言時(shí)間是特異的)。細(xì)胞擴(kuò)增：將所有培養(yǎng)物的培養(yǎng)基用新鮮的培養(yǎng)基每周替代一次并觀察細(xì)胞的擴(kuò)增。一般來講，每種培養(yǎng)物因在npe+bfgf+egf中生長(zhǎng)受限而在一個(gè)月的時(shí)間內(nèi)傳代一次。免疫細(xì)胞化學(xué)分析：在一個(gè)月的時(shí)間之后，將所有燒瓶用冷4％(w/v)多聚甲醛(sigma-aldrich)在室溫下固定10分鐘。使用針對(duì)tuj1(biii微管蛋白；1∶500；sigma，st.louis，mo.)和gfap(膠質(zhì)原纖維酸性蛋白；1∶2000；dakocytomation，carpinteria，calif.)的抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)分析。簡(jiǎn)而言之，用磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)清洗培養(yǎng)物后，將其與含pbs、4％(v/v)的山羊血清(chemicon，temecula，calif.)和0.3％(v/v)的triton(tritonx-100；sigma)的蛋白質(zhì)阻斷溶液接觸30分鐘以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)抗原。一抗在阻斷溶液中稀釋后，加到培養(yǎng)物上在室溫下保持1小時(shí)。接著，去除一抗溶液，并且在施加含阻斷劑連同山羊抗-小鼠igg--德克薩斯紅(1∶250；molecularprobes，eugene，oreg.)和山羊抗兔igg--alexa488(1∶250；molecularprobes)的二抗溶液(室溫下1小時(shí))之前用pbs洗滌培養(yǎng)物。然后洗滌培養(yǎng)物，并且施加10微摩爾dapi(molecularprobes)10分鐘，使細(xì)胞核顯色。經(jīng)過免疫染色后，使用適當(dāng)?shù)膴W林巴斯倒置表面熒光顯微鏡(olympus，melville，n.y.)觀察熒光。在所有情況下，陽(yáng)性染色表示超過對(duì)照染色的熒光信號(hào)，其中除了施用一抗溶液外遵循上述所有流程。使用彩色數(shù)碼攝像機(jī)和imagepro軟件(mediacybernetics，carlsbad，calif.)捕獲代表性圖像。對(duì)于三染樣本，每幅圖像每次僅用一個(gè)濾光片拍攝。使用adobephotoshop軟件(adobe，sanjose，calif.)制作分層剪輯。表15-1：所用一抗匯總結(jié)果npe+bfgf+egf培養(yǎng)基減緩ppdc的增殖并改變其形態(tài)。在剛鋪板之后，使ppdc亞群貼壁于經(jīng)層粘連蛋白包被的培養(yǎng)燒瓶中。這可能是由于細(xì)胞死亡隨凍/融過程而變化或是因?yàn)樾碌纳L(zhǎng)條件。貼壁的細(xì)胞采用不同于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中觀察的那些的形態(tài)。臍衍生的細(xì)胞的克隆表達(dá)神經(jīng)元蛋白質(zhì)：在解凍/鋪板后一個(gè)月固定培養(yǎng)物并針對(duì)神經(jīng)元蛋白質(zhì)tuj1和gfap(星形膠質(zhì)細(xì)胞中所見的中間絲狀體)進(jìn)行染色。雖然發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的所有對(duì)照培養(yǎng)物以及npe+bfgf+egf培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的人成纖維細(xì)胞和msc為tuj1-/gfap-，但是卻在臍和胎盤ppdc中檢測(cè)到tuj1。在具有和不具有神經(jīng)元樣形態(tài)的細(xì)胞中觀察表達(dá)。并未在任一種培養(yǎng)物中觀察到gfap的表達(dá)。具有神經(jīng)元樣形態(tài)的表達(dá)tuj1的細(xì)胞的百分比小于或等于全部群體的1％(n＝3測(cè)試的臍衍生的細(xì)胞分離物)。雖然并未定量，但是臍衍生的細(xì)胞培養(yǎng)物中不具有神經(jīng)元形態(tài)的tuj1+細(xì)胞的百分比高于胎盤衍生的細(xì)胞培養(yǎng)物。這些結(jié)果似乎是特異的，因?yàn)樯L(zhǎng)培養(yǎng)基中年齡匹配的對(duì)照不表達(dá)tuj1?？偨Y(jié)：開發(fā)了用于從臍衍生的細(xì)胞產(chǎn)生分化神經(jīng)元(基于tuj1表達(dá)和神經(jīng)元形態(tài))的方法。雖然在一個(gè)月前并未在體外檢測(cè)到tuj1的表達(dá)，但是很明顯至少一個(gè)較小的臍衍生的細(xì)胞群可在暴露于補(bǔ)充有l(wèi)-谷氨酰胺、堿性fgf和egf的基本培養(yǎng)基一個(gè)月之后通過默認(rèn)分化或通過長(zhǎng)期誘導(dǎo)而產(chǎn)生神經(jīng)元。實(shí)施例16用于神經(jīng)祖細(xì)胞支持的ppdc營(yíng)養(yǎng)因子檢查臍和胎盤衍生的細(xì)胞(共稱為產(chǎn)后衍生細(xì)胞或ppdc)通過非接觸依賴性(營(yíng)養(yǎng))機(jī)制對(duì)成體神經(jīng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞存活和分化的影響。方法及材料成體神經(jīng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞分離：通過在co2窒息后斷頸處死fisher344成鼠。使用咬骨鉗將全腦完整移除，并且基于腦部運(yùn)動(dòng)區(qū)和軀體感覺區(qū)后方的冠狀切口解剖海馬組織(paxinos，g.&watson，c.1997.theratbraininstereotaxiccoordinates)。將組織在neurobasal-a培養(yǎng)基(invitrogen，carlsbad，calif.)中洗滌，所述neurobasal-a培養(yǎng)基包含b27(b27補(bǔ)充劑；invitrogen)、l-谷氨酰胺(4mm；invitrogen)和青霉素/鏈霉素(invitrogen)，該組合在本文稱為神經(jīng)祖細(xì)胞擴(kuò)增(npe)培養(yǎng)基。使npe培養(yǎng)基進(jìn)一步補(bǔ)充bfgf(20納克/毫升，peprotech，rockyhill，n.j.)和egf(20納克/毫升，peprotech，rockyhill，n.j.)，本文稱之為npe+bfgf+egf。在洗滌之后，移除上覆腦膜，并用外科手術(shù)刀將組織切碎。收集組織糜并將胰蛋白酶/edta(invitrogen)作為75％的總體積添加。另外添加dnase(100微升/8毫升總體積，sigma，st.louis，mo.)。接著，使組織/培養(yǎng)基依序經(jīng)過18號(hào)規(guī)格針、20號(hào)規(guī)格針，最終25號(hào)規(guī)格針各一次(所有的針得自bectondickinson，franklinlakes，n.j.)。將混合物以250g離心3分鐘。移除上清液，添加新鮮的npe+bfgf+egf并使沉淀物重懸。所得的細(xì)胞懸浮液經(jīng)過40微米細(xì)胞濾網(wǎng)(bectondickinson)，鋪板到經(jīng)層粘連蛋白包被的t-75燒瓶(bectondickinson)或24-孔低簇板(bectondickinson)，并生長(zhǎng)于npe+bfgf+egf培養(yǎng)基中直至獲得足夠的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行列出的研究。ppdc鋪板：將先前生長(zhǎng)于生長(zhǎng)培養(yǎng)基的產(chǎn)后衍生細(xì)胞(臍(022803)p12、(042103)p12、(071003)p12；胎盤(042203)p12)以5,000個(gè)細(xì)胞/跨孔插件(按24孔板定制尺寸)鋪板并在插件的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一周以實(shí)現(xiàn)匯合。成體神經(jīng)祖細(xì)胞鋪板：將作為神經(jīng)球或作為單細(xì)胞生長(zhǎng)的神經(jīng)祖細(xì)胞以約2,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到經(jīng)層粘連蛋白包被的24孔板的npe+bfgf+egf中一天以促進(jìn)細(xì)胞貼附。一天之后，根據(jù)以下方案加入包含產(chǎn)后細(xì)胞的跨孔插件：a.跨孔(生長(zhǎng)培養(yǎng)基中臍衍生的細(xì)胞，200微升)+神經(jīng)祖細(xì)胞(npe+bfgf+egf，1毫升)b.跨孔(生長(zhǎng)培養(yǎng)基中胎盤衍生的細(xì)胞，200微升)+神經(jīng)祖細(xì)胞(npe+bfgf+egf，1毫升)c.跨孔(成人真皮成纖維細(xì)胞[1f1853；cambrex，walkersville，md.]p12，生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，200微升)+神經(jīng)祖細(xì)胞(npe+bfgf+egf，1毫升)d.對(duì)照：?jiǎn)为?dú)神經(jīng)祖細(xì)胞(npe+bfgf+egf，1毫升)e.對(duì)照：?jiǎn)为?dú)神經(jīng)祖細(xì)胞(僅npe，1毫升)免疫細(xì)胞化學(xué)分析：在共培養(yǎng)7天之后，用冷4％(w/v)多聚甲醛(sigma-aldrich)在室溫下固定所有條件10分鐘。使用針對(duì)下表14-1列出的表位的抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)分析。簡(jiǎn)而言之，將培養(yǎng)物用磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)洗滌，并暴露于含pbs、4％(v/v)的山羊血清(chemicon，temecula，calif.)和0.3％(v/v)的triton(tritonx-100；sigma)的蛋白質(zhì)阻斷溶液30分鐘以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)抗原。一抗在阻斷溶液中稀釋后，加到培養(yǎng)物上在室溫下保持1小時(shí)。接著，去除一抗溶液，并且在施加含阻斷溶液連同山羊抗-小鼠igg--德克薩斯紅(1∶250；molecularprobes，eugene，oreg.)和山羊抗兔igg--alexa488(1∶250；molecularprobes)的二抗溶液(室溫下1小時(shí))之前用pbs洗滌培養(yǎng)物。然后洗滌培養(yǎng)物，并且施加10微摩爾dapi(molecularprobes)10分鐘，使細(xì)胞核顯色。經(jīng)過免疫染色后，使用適當(dāng)?shù)膴W林巴斯倒置表面熒光顯微鏡(olympus，melville，n.y.)觀察熒光。在所有情況下，陽(yáng)性染色表示超過對(duì)照染色的熒光信號(hào)，其中除了施用一抗溶液外遵循上述所有流程。使用彩色數(shù)碼攝像機(jī)和imagepro軟件(mediacybernetics，carlsbad，calif.)捕獲代表性圖像。對(duì)于三染樣本，每幅圖像每次僅用一個(gè)濾光片拍攝。使用adobephotoshop軟件(adobe，sanjose，calif.)制作分層剪輯。表16-1：所用一抗匯總神經(jīng)祖細(xì)胞分化的定量分析：對(duì)海馬神經(jīng)祖細(xì)胞分化的量化進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)條件下計(jì)數(shù)最少1000個(gè)細(xì)胞，或者如果更少，在該條件下觀察細(xì)胞總數(shù)。對(duì)給定染色劑呈陽(yáng)性的細(xì)胞的百分比通過用陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)除以如由dapi(核)染色確定的細(xì)胞總數(shù)來評(píng)估。質(zhì)譜分析和2d凝膠電泳：為鑒定因共培養(yǎng)而獨(dú)特分泌的因子，將在培養(yǎng)物固定之前取得的條件培養(yǎng)基樣本在-80℃下冷凍過夜。然后將樣本施加至超濾旋轉(zhuǎn)裝置(mw截?cái)?0kd)。將保留物施加于免疫親和色譜上(抗-hu-白蛋白；igy)(免疫親和不從樣本中移除白蛋白)。通過maldi分析濾液。將流過物施加于cibachronblue親和色譜。通過sds-page和2d凝膠電泳分析樣本。結(jié)果ppdc共培養(yǎng)刺激成體神經(jīng)祖細(xì)胞分化：在與臍或胎盤衍生的細(xì)胞一起培養(yǎng)之后，源于成體大鼠海馬的共培養(yǎng)的神經(jīng)祖細(xì)胞表現(xiàn)出沿中樞神經(jīng)系統(tǒng)的所有三個(gè)主要譜系方向均顯著分化。該效應(yīng)在共培養(yǎng)中五天后明顯觀察到，多個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)變成有復(fù)雜突起并且損失其分裂中祖細(xì)胞的亮相位(phasebright)特征性特性。相反地，在不存在bfgf和egf時(shí)單獨(dú)生長(zhǎng)的神經(jīng)祖細(xì)胞似乎不健康并且存活受到限制。在所述過程完成之后，針對(duì)表示未分化干細(xì)胞和祖細(xì)胞(巢蛋白)、未成熟和成熟神經(jīng)元(tuj1)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(gfap)和成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞(mbp)的標(biāo)志物對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行染色。當(dāng)對(duì)照條件未表現(xiàn)出顯著分化時(shí)沿所有三種譜系方向的分化得到確認(rèn)，如由大多數(shù)細(xì)胞中保持巢蛋白陽(yáng)性染色所證實(shí)的那樣。雖然臍和胎盤衍生的細(xì)胞兩者誘導(dǎo)細(xì)胞分化，但在具有胎盤衍生的細(xì)胞的共培養(yǎng)物中所有三種譜系的分化程度比具有臍衍生的細(xì)胞的共培養(yǎng)物更小。在與臍衍生的細(xì)胞共培養(yǎng)之后，對(duì)分化的神經(jīng)祖細(xì)胞的百分比進(jìn)行定量(表16-2)。臍衍生的細(xì)胞顯著增強(qiáng)成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞(mbp)的數(shù)目(在兩種對(duì)照條件中，24.0％vs.0％)。此外，共培養(yǎng)增強(qiáng)了培養(yǎng)物中g(shù)fap+星形膠質(zhì)細(xì)胞和tuj1+神經(jīng)元的數(shù)目(分別為47.2％和8.7％)。這些結(jié)果通過巢蛋白染色加以確認(rèn)，指示出在共培養(yǎng)之后祖細(xì)胞狀態(tài)損失(在對(duì)照條件4中，13.4％vs.71.4％)。雖然分化還似乎受成人成纖維細(xì)胞影響，但此類細(xì)胞不能促進(jìn)成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化或者其不能產(chǎn)生可觀量的神經(jīng)元。雖然未定量，然而成纖維細(xì)胞卻似乎增強(qiáng)了神經(jīng)祖細(xì)胞的存活。表16-2：對(duì)照和相對(duì)于臍衍生的細(xì)胞跨孔共培養(yǎng)中祖細(xì)胞分化的量化(e＝egf，f＝bfgf)獨(dú)特化合物的鑒定：檢測(cè)得自臍和胎盤衍生的共培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基連同適當(dāng)?shù)膶?duì)照(npe培養(yǎng)基±1.7％血清，得自與成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)物的培養(yǎng)基)的差異。鑒定潛在獨(dú)特的化合物并從其對(duì)應(yīng)2d凝膠中切離。總結(jié)：成體神經(jīng)祖細(xì)胞與臍或胎盤ppdc的共培養(yǎng)導(dǎo)致那些細(xì)胞分化。該實(shí)施例示出的結(jié)果指示，在與臍衍生的細(xì)胞共培養(yǎng)之后成體神經(jīng)祖細(xì)胞的分化尤為突出。具體地，在臍衍生的細(xì)胞共培養(yǎng)物中產(chǎn)生顯著百分比的成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞。實(shí)施例17產(chǎn)后衍生細(xì)胞的移植產(chǎn)后臍和胎盤衍生的細(xì)胞可用于再生治療。對(duì)利用可生物降解材料將產(chǎn)后衍生細(xì)胞(ppdc)所產(chǎn)生的組織向scid小鼠中移植進(jìn)行評(píng)估。所評(píng)估的材料為vicryl非織造材料、35/65pcl/pga泡沫和rad16自組裝肽水凝膠。方法及材料細(xì)胞培養(yǎng)：使臍和胎盤衍生的細(xì)胞生長(zhǎng)于經(jīng)明膠包被的燒瓶的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(dmem-低葡萄糖(gibco，carlsbadcalif.)、15％(v/v)胎牛血清(目錄號(hào)sh30070.03；hyclone，logan，utah)、0.001％(v/v)β巰基乙醇(sigma，st.louis，mo.)、青霉素/鏈霉素(gibco))中。樣本制備：將一百萬個(gè)活細(xì)胞接種到5mm直徑、2.25mm厚的vicryl非織造支架(64.33毫克/cc；批號(hào)3547-47-1)或5mm直徑35/65pcl/pga泡沫(批號(hào)3415-53)上的15微升生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。在添加更多生長(zhǎng)培養(yǎng)基以覆蓋支架之前，使細(xì)胞貼壁兩小時(shí)。使細(xì)胞在支架上生長(zhǎng)過夜。另外將不具有細(xì)胞的支架在培養(yǎng)基中溫育。rad16自組裝肽(3dmatrix，cambridge，ma)作為無菌1％(w/v)水溶液獲得，其在臨用前以1∶1與含10％(w/v)蔗糖(sigma，stlouis，mo.)、10mmhepes的dulbecco′s改良培養(yǎng)基(dmem；gibco)中的1×106個(gè)細(xì)胞混合。rad16水凝膠中細(xì)胞的最終濃度為1×106個(gè)細(xì)胞/100微升。測(cè)試材料(n＝4/rx)a.vicryl非織造材料+1×106個(gè)臍衍生的細(xì)胞b.35/65pcl/pga泡沫+1×106個(gè)臍衍生的細(xì)胞c.rad16自組裝肽+1×106個(gè)臍衍生的細(xì)胞d.vicryl非織造材料+1×106個(gè)胎盤衍生的細(xì)胞e.35/65pcl/pga泡沫+1×106個(gè)胎盤衍生的細(xì)胞f.rad16自組裝肽+1×106個(gè)胎盤衍生的細(xì)胞g.35/65pcl/pga泡沫h(huán).vicryl非織造材料動(dòng)物準(zhǔn)備：根據(jù)動(dòng)物福利法案(animalwelfareact)的現(xiàn)行要求處理和維持動(dòng)物。遵守以上公法通過秉承動(dòng)物福利規(guī)定(9cfr)并遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南(guideforthecareanduseoflaboratoryanimals)第7版頒布的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)來實(shí)現(xiàn)。小鼠(小家鼠)/foxchasescid/雄性(harlanspraguedawley，inc.，indianapolis，ind.)，5周齡：scid小鼠的所有處理在罩子下方進(jìn)行。將小鼠各自稱重并利用腹膜內(nèi)注射60毫克/kgketaset(ketaminehydrochloride，avecoco.，inc.，fortdodge，iowa)和10毫克/kgrompun(xylazine，mobaycorp.，shawnee，kans.)和鹽水的混合物來麻醉。在誘導(dǎo)麻醉后，使用電動(dòng)動(dòng)物剪將動(dòng)物從頸背部區(qū)域到背腰骶區(qū)域的整個(gè)背部的毛發(fā)剪光。然后用二醋酸氯己定擦洗該區(qū)域，用醇沖洗，干燥，并涂抹1％有效碘的碘伏水溶液。將眼用軟膏施用到眼以防止麻醉期間該組織干燥。皮下植入技術(shù)：在小鼠的背部制作每個(gè)長(zhǎng)度約為1.0cm的四個(gè)皮膚切口。兩個(gè)顱部位橫向位于背部側(cè)胸區(qū)域上方所觸摸到的肩胛下緣尾向約5mm處，一個(gè)處于脊柱左邊且一個(gè)處于右邊。另兩個(gè)橫向位于尾骶腰部水平的臀肌區(qū)域上方所觸摸到的髂嵴尾向約5mm處，中線的每一側(cè)各有一個(gè)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將植入物隨機(jī)置入這些部位。將皮膚和下層結(jié)締組織分離以形成小袋，并將植入物放置(或者對(duì)于rad16注射)在切口的尾向約1-em處。將適當(dāng)?shù)臏y(cè)試材料植入到皮下間隙中。然后用金屬夾閉合皮膚傷口。動(dòng)物畜舍：在整個(gè)研究過程中，在64°f-79°f的溫度范圍和30％至70％的相對(duì)濕度內(nèi)，將小鼠各自圈養(yǎng)在小隔離籠子中，并維持約12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的循環(huán)。將溫度和相對(duì)濕度盡可能最大程度地維持在規(guī)定范圍之內(nèi)。飲食由irradiatedpicomousechow5058(purinaco.)和不限量飼喂的水組成。小鼠以其指定間隔吸入二氧化碳處以安樂死。切下覆蓋其皮膚的皮下植入部位并冷凍以進(jìn)行組織學(xué)分析。組織學(xué)：將具有植入物的切離的皮膚用10％中性緩沖的福爾馬林(richard-allankalamazoo，mich.)固定。中心對(duì)切具有上覆組織和相鄰組織的樣本，并使用常規(guī)方法在切割面上經(jīng)石蠟處理和包埋。五微米的組織切片通過顯微切片機(jī)獲得并使用常規(guī)方法用蘇木精和伊紅(polyscientificbayshore，n.y.)進(jìn)行染色。結(jié)果30天后，組織最小限度的向內(nèi)生長(zhǎng)到scid小鼠皮下植入的泡沫(無細(xì)胞)中。相比之下，大量組織填充到植入有臍衍生的細(xì)胞或胎盤衍生的細(xì)胞的泡沫中。在vicryl非織造支架中觀察到一些組織向內(nèi)生長(zhǎng)。接種有臍或胎盤衍生的細(xì)胞的非織造支架示出基質(zhì)沉積和成熟血管增加?？偨Y(jié)：用人臍或胎盤衍生的細(xì)胞接種合成的可吸收非織造/泡沫盤(5.0mm直徑×1.0mm厚度)或自組裝肽水凝膠并經(jīng)皮下雙側(cè)地植入scid小鼠的背棘區(qū)域中。結(jié)果展示產(chǎn)后衍生細(xì)胞可顯著增加可生物降解支架中良好質(zhì)量的組織形成。實(shí)施例18臍衍生細(xì)胞中的端粒酶表達(dá)端粒酶的功能是合成端粒重復(fù)序列，端粒重復(fù)序列用于保護(hù)染色體完整性并延長(zhǎng)細(xì)胞的復(fù)制壽命(liu，k等人，pnas，1999；96：5147-5152)。端粒酶由兩種組分組成：端粒酶rna模板(hter)和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(htert)。端粒酶的調(diào)控通過htert而非hter的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行測(cè)定。因此htertmrna的實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)為用于測(cè)定細(xì)胞的端粒酶活性的可接受方法。細(xì)胞分離.進(jìn)行實(shí)時(shí)pcr實(shí)驗(yàn)以測(cè)定人臍帶組織衍生的細(xì)胞的端粒酶產(chǎn)生。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)制備人臍帶組織來源細(xì)胞。一般來講，在正常分娩后洗滌從國(guó)家疾病研究交流會(huì)(philadelphia，pa.)獲得的臍帶以去除血液和細(xì)胞碎片，并進(jìn)行機(jī)械離解。然后將組織用包括膠原酶、分散酶和透明質(zhì)酸酶的消化酶在37℃下于培養(yǎng)基中孵育。人臍帶組織衍生的細(xì)胞根據(jù)以上實(shí)施例所列的方法進(jìn)行培養(yǎng)。從cambrex(walkersville，md)獲得間充質(zhì)干細(xì)胞和正常表皮成纖維細(xì)胞(cc-2509批號(hào)9f0844)。多能人睪丸胚胎性癌(畸胎瘤)細(xì)胞系ntera-2細(xì)胞(ntera-2cl.dl)(參見plaia等人，stemcells，2006；24(3)：531-546)購(gòu)自atcc(manassas，va.)并根據(jù)以上所列方法進(jìn)行培養(yǎng)?？俽na的分離.使用試劑盒(qiagen，valencia，ca.)從細(xì)胞提取rna。用50微升經(jīng)depc處理的水洗脫rna并在-80℃下保存。使用隨機(jī)六聚體引物和逆轉(zhuǎn)錄試劑(appliedbiosystems，fostercity，ca.)，將rna逆轉(zhuǎn)錄，在25℃下10分鐘，在37℃下60分鐘并且在95℃下10分鐘。將樣本保存于-20℃下。實(shí)時(shí)pcr.根據(jù)制造商的說明書(appliedbiosystems)，使用appliedbiosystemsassays-on-demandtm(也稱為geneexpressionassays)，對(duì)cdna樣本進(jìn)行pcr。這種商業(yè)試劑盒廣泛用于測(cè)定人細(xì)胞中的端粒酶。簡(jiǎn)而言之，使用具有abiprism7000sds軟件(appliedbiosystems)的7000序列檢測(cè)系統(tǒng)，將htert(人端粒酶基因)(hs00162669)和人gapdh(內(nèi)對(duì)照)與cdna和universalpcr預(yù)混液混合。熱循環(huán)條件為初始50℃下2分鐘和95℃下10分鐘，隨后為95℃下15秒和60℃下1分鐘的40個(gè)循環(huán)。根據(jù)制造商的說明書分析pcr數(shù)據(jù)。就htert和18srna測(cè)定人臍帶組織衍生的細(xì)胞(atcc登錄號(hào)pta-6067)、成纖維細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。如表18-1所示，htert和因此的端粒酶未在人臍帶組織衍生的細(xì)胞中檢出。測(cè)定人臍帶組織衍生的細(xì)胞(分離物022803，atcc登錄號(hào)pta-6067)和ntera-2細(xì)胞，并且結(jié)果顯示兩個(gè)批次的人臍帶組織衍生的細(xì)胞中均未表達(dá)端粒酶，而畸胎瘤細(xì)胞系顯示出高水平的表達(dá)(表18-2)。因此，可得出如下結(jié)論：本發(fā)明的人臍帶組織衍生的細(xì)胞不表達(dá)端粒酶。貫穿整個(gè)說明書參考了各種專利和其它出版物。這些出版物各自全文以引用方式并入本文。盡管上文已結(jié)合實(shí)施例和優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明的各個(gè)方面，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的范圍不受以上描述內(nèi)容的限定，而受以下在專利法原則下恰當(dāng)理解的權(quán)利要求書的限定。當(dāng)前第1頁(yè)12