專利名稱：一種獲得rpgr 基因新的轉(zhuǎn)錄剪切形式的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種獲得RPGR基因新的轉(zhuǎn)錄剪切形式的方法。
背景技術(shù)：
X染色體連鎖遺傳性視網(wǎng)膜色素變性(XLRP)是一種常見的遺傳性致盲眼病，具有發(fā)病早，損害嚴重等特點；資料顯示，其在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率約為1/3500，且有逐年上升趨勢，是目前主要的致盲性眼病之一。RPGR基因是一個與此疾病密切相關(guān)的的基因，但RPGR基因表達的特征和機制目前尚未見深入報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種獲得RPGR基因新的轉(zhuǎn)錄剪 切形式的方法。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)一種獲得RPGR基因新的轉(zhuǎn)錄剪切形式的方法，包含以下步驟(I)從犬類組織中提取出核糖核酸；(2)設(shè)計特定的寡脫氧核糖核酸引物SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2 ；(3)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應擴增出cDNA片段，；(4)應用pGEM -3Zf(+)克隆載體將擴增的cDNA片段克隆至大腸桿菌中，獲得重組克隆菌落，(5)收集重組克隆菌落中的菌體，置于裂解液中，經(jīng)過裂解反應后，進行瓊脂糖凝膠電泳中；檢驗后篩選出所有帶有cDNA片段的克隆菌落； (6)對篩選出的克隆中的cDNA片段進行順序分析，通過與RPGR基因現(xiàn)有轉(zhuǎn)錄剪切形式比對，最終獲得一種RPGR基因新的轉(zhuǎn)錄剪切形式。其中，所述的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應的反應體系為
加入最終濃度
AMV/Tfl 5倍濃縮反應緩沖液10微升I倍
dNTP混合液(每種dNTP IOmM)I微升0.2mM
正向引物溶液50pmol 2微升ΙμΜ
反向引物溶液50pmol 2微升ΙμΜ硫酸鎂25mM 2微升ImM
AMV逆轉(zhuǎn)錄酶 I微升0.1單位/微升
TflDNA聚合酶5單位/微升，I微升0.1單位/微升
RNA樣品5微克/微升，3微升0.3微克/微升
無核酸酶的純凈水18微升 最終體積50μ1所述的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應的反應程序為45 °C , 40 50分鐘；92-95 °C I. 5-2. 5 分鐘;93_95C 30-45 秒鐘，55-60。。，I. 5-2. 5 分鐘，65-67 °C，I. 5-2. 5 分鐘，共45 55個循環(huán)；62-67°C,8-10分鐘；4°C，反應結(jié)束。
所述的裂解液配方為蔗糖100毫克/毫升，氫氧化鈉100mM，SDS O. 1% (V/V)，核糖核酸酶A 10微克/毫升。有益效果在研究工作中應用了一系列先進的分子生物學技術(shù)；其關(guān)鍵步驟首先為一組帶有特定順序的寡脫氧核糖核苷酸片段的設(shè)計，其中包括了正向和反向的引物片段；隨后采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式擴增(RT-PCR)手段，擴增出相關(guān)的cDNA片段。經(jīng)過克隆、篩選以及DNA順序分析，發(fā)現(xiàn)了一個國內(nèi)外都從未報道過的、新的RPGR基因轉(zhuǎn)錄剪切形式。這一發(fā)現(xiàn)為闡明RPGR基因的表達及功能提供了重要的信息，有及其重要的意義。


圖I寡脫氧核糖核苷酸片段引物、包括正向和反向引物在RPGR基因中的位置圖2新的RPGR基因轉(zhuǎn)錄剪切形式的示意圖。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖通過實施例對本發(fā)明特征及其它相關(guān)特征作進一步詳細說明本發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵在于從組織中提取出完整的RNA、特定的寡脫氧核糖核苷酸引物的設(shè)計以及成功的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)。以下實例分步介紹本發(fā)現(xiàn)的具體過程。實施例I本實施例以犬類大腦組織為材料，采用復合的RNA提取手段。依據(jù)GenBank(美國國立衛(wèi)生總署基因數(shù)據(jù)庫)中的RPGR基因DNA順序，應用MacVector (MacVector，Inc.)軟件，設(shè)計出本研究所需的特殊寡脫氧核糖核苷酸引物。針對本研究的特點設(shè)定逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)的反應條件。(I)從大腦組織中提取RNA 首先使用常規(guī)的組織RNA提取手段(Chomczynski方法，見參考文獻)從大腦組織中提取出RNA ;將已得到的RNA沉淀物用QIAGEN公司產(chǎn)品-RNA純化藥盒(RNeasy)的裂解緩沖液(RLT)溶解；然后按照Rneasy的標準步驟，再次純化并濃縮。以保證RNA中隨后逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)必需的mRNA的完整和RNA樣品的濃度及純度。(2)設(shè)計寡脫氧核糖核苷酸引物
首先根據(jù)目標cDNA片段的長度，確定寡脫氧核糖核苷酸引物(包括正向及反向引物)在RPGR基因中的位置；然后依據(jù)GenBank中RPGR基因的DNA順序，設(shè)計出寡脫氧核糖核苷酸引物 SEQ ID No. I 和 SEQ ID No. 2。(3)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)依據(jù)所需擴增的cDNA片段長度、寡脫氧核糖核苷酸引物的順序等因素，設(shè)定了逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)的條件；以擴增必須的cDNA片段。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應的反應體系為
加入最終濃度
AMV/Tfl 5倍濃縮反應緩沖液10微升I倍
dNTP混合液(每種dNTP IOmM)I微升0.2mM
正向引物溶液50pmol 2微升ΙμΜ
反向引物溶液50pmol 2微升ΙμΜ
硫酸鎂25mM 2微升ImM
AMV逆轉(zhuǎn)錄酶 I微升0.1單位/微升
TflDNA聚合酶5單位/微升，I微升0.1單位/微升
RNA樣品5微克/微升，3微升0.3微克/微升
無核酸酶的純凈水18微升 最終體積50μ1逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應的反應程序為45°C，40 50分鐘；92_95°C I. 5-2. 5分鐘；93-95C30-45 秒鐘，55-60°C，I. 5-2. 5 分鐘，65-67°C，I. 5-2. 5 分鐘，共 45 55 個循環(huán)；62-67°C，8-10分鐘；4°C，反應結(jié)束。(4)克隆所得的cDNA片段應用pGEM -3Zf(+)克隆載體(美國PR0MEGA公司產(chǎn)品)將擴增的cDNA片段克隆至大腸桿菌中，獲得數(shù)百個重組克隆菌落，以供后續(xù)的篩選。(5)篩選出帶有相關(guān)的cDNA片段的克隆收集每個克隆菌落中的菌體，置于裂解液中，經(jīng)過裂解反應后，加入到瓊脂糖凝膠電泳中；檢驗后篩選出所有帶有cDNA片段的克隆菌落。(6)對篩選出的克隆菌落中的cDNA片段進行順序分析，最終確認RPGR基因的一種新的轉(zhuǎn)錄剪切形式即第五至第十一個外顯子缺失，第四外顯子與第十二外顯子直接相連；基因仍保留原有的譯讀框架(見圖2)。以上所述的即為本發(fā)現(xiàn)的優(yōu)選實施方式。
權(quán)利要求
1.一種獲得RPGR基因新的轉(zhuǎn)錄剪切形式的方法，其特征在于包含以下步驟(1)從犬類組織中提取出核糖核酸；(2)設(shè)計特定的寡脫氧核糖核酸引物SEQID No. I和SEQ ID No. 2 ；(3)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應擴增出cDNA片段，；(4)應用pGEM -3Zf(+)克隆載體將擴增的cDNA片段克隆至大腸桿菌中，獲得重組克隆菌落，(5)收集重組克隆菌落中的菌體，置于裂解液中，經(jīng)過裂解反應后，進行瓊脂糖凝膠電泳中；檢驗后篩選出所有帶有cDNA片段的克隆菌落；(6)對篩選出的克隆中的cDNA片段進行順序分析，通過與RPGR基因現(xiàn)有轉(zhuǎn)錄剪切形式比對，最終獲得一種RPGR基因新的轉(zhuǎn)錄剪切形式即第五至第十一個外顯子缺失，第四外顯子與第十二外顯子直接相連；基因仍保留原有的譯讀框架。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的獲得RPGR基因新的轉(zhuǎn)錄剪切形式的方法，其特征在于所述的逆轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈式反應的反應體系為加入AMV/Tfl 5倍濃縮反應緩沖液10微升 dNTP混合液(每種dNTP I OmM) I微升正向引物溶液50pmol 2微升反向引物溶液50pmol 2微升硫酸鎂25mM 2微升 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶 I微升 Tfl DNA聚合酶5單位/微升，I微升 RNA樣品5微克/微升，3微升無核酸酶的純凈水18微升最終體積50μ1
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的獲得RPGR基因新的轉(zhuǎn)錄剪切形式的方法，其特征在于所述的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應的反應程序為45°C，40 50分鐘；92-95°C，l. 5-2. 5分鐘； 93-95°C, 30-45 秒鐘，55-60。。，I. 5-2. 5 分鐘，65-67°C，I. 5-2. 5 分鐘，共 45 55 個循環(huán)； 62-67°C，8-10分鐘；4°C，反應結(jié)束。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的獲得RPGR基因新的轉(zhuǎn)錄剪切形式的方法，其特征在于所述的裂解液配方為鹿糖100毫克/毫升，氫氧化鈉lOOmM，SDS O. 1% (V/V)，核糖核酸酶A 10 微克/暈升。最終濃度 I倍 0.2mM ΙμΜ ΙμΜ ImM·0.1單位/微升 0.1單位/微升 0.3微克/微升
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開了一種獲得RPGR基因新的轉(zhuǎn)錄剪切形式的方法。首先從組織中分離出核糖核酸；設(shè)計特定的寡脫氧核糖核酸引物片段，通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應擴增出cDNA片段。經(jīng)過克隆、篩選和順序分析，證實了存在于RPGR基因轉(zhuǎn)錄過程中的一種新的剪切形式，即第五至第十一個外顯子缺失，第四外顯子與第十二外顯子直接相連；基因仍保留原有的譯讀框架。這個剪切形式在國內(nèi)、外都從未見諸報道。這一發(fā)現(xiàn)為了解RPGR基因的表達及功能提供了重要信息。
文檔編號C12N15/12GK102925445SQ20111022542
公開日2013年2月13日 申請日期2011年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月8日
發(fā)明者顧烽, 劉軍, 王平, 顧大年, 李則孝 申請人:劉軍, 顧烽, 王平