相關(guān)申請

本申請要求2014年9月24日提交的美國臨時申請?zhí)?2/054,924的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益，該申請通過引用以其全文結(jié)合在此。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及人工組織的3d生物打印，并且更具體地涉及使用3d生物打印生產(chǎn)的人工角膜。

發(fā)明背景

角膜的一層或多層的疾病或損傷可導(dǎo)致失明，通常通過角膜移植來進行治療。在美國每年約40,000名患者接受角膜移植手術(shù)。這些人中絕大多數(shù)接受來自人類供體的替換角膜。盡管手術(shù)具有高的成功率，但是供體組織的供給有限，并且等候名單可能很長。在發(fā)展中國家，獲得供體組織甚至更加困難。而且，雖然人類供體移植是角膜性失明的標準治療，但是其中固有的并發(fā)癥和限制已經(jīng)促使合成的角膜替代物的發(fā)展?，F(xiàn)有的合成角膜可以分為：1)完全合成的假體(例如角膜假體(keratoprostheses))和2)允許宿主組織再生的水凝膠。

角膜假體(keratoprostheses)或kpro是最知名的人工角膜，執(zhí)行角膜的屈光功能。盡管kpro已經(jīng)以多種形式存在多年了，但是制造具有人類供體角膜的透明性、生物力學(xué)和再生能力的合成的基質(zhì)等效物仍然是一個艱難的挑戰(zhàn)。而且，角膜假體的應(yīng)用受到復(fù)雜的植入程序和主要的手術(shù)后并發(fā)癥(包括感染、鈣化、假體膜(retroprostheticmembrane)形成和青光眼)的阻礙。在一些情況下，由于其感染傾向，患者必須終生服用抗生素。因此，在反復(fù)拒絕天然供體組織或原本沒有資格進行此類移植手術(shù)的患者中，人工角膜僅用作最后手段。

第二類型的工程化角膜是基于合成水凝膠的無細胞植入物，其被設(shè)計為復(fù)原宿主細胞以在植入物表面上生長上皮層并恢復(fù)功能。這些水凝膠植入物中的許多類似于有機組織并且具有所希望的光學(xué)性質(zhì)的高彈性模量。然而，在大多數(shù)情況下，機械固定或生物固定是有問題的-植入的支架與宿主組織的整合是極其耗時的過程。這種緩慢的時間過程由于年長和/或嚴重受傷的患者中有限的細胞再生活性而進一步加劇。此外，據(jù)報道，這些水凝膠植入物中的一些在長期植入后部分被生物降解，導(dǎo)致透明性喪失和移植失敗。處理無細胞植入物的一些問題的嘗試包括在水凝膠基質(zhì)中摻入葡糖胺聚糖，這些葡糖胺聚糖被認為對于細胞粘附和調(diào)節(jié)降解性是必需的。

生物納米技術(shù)的變革性應(yīng)用之一是為人類組織和器官的重建和再生創(chuàng)造革命性的方法。這一承諾是基于納米技術(shù)在生物學(xué)背景下提供的強大能力：在納米尺度上控制細胞機器的獨特模式。由于它們特殊的表面特性、亞細胞長度尺度和精確定向的模塊化架構(gòu)，納米結(jié)構(gòu)及其在組織工程構(gòu)建體中的摻入為再生醫(yī)學(xué)提供了新的范例。3d生物打印-其使用生物材料、細胞、蛋白質(zhì)和其他生物化合物作為構(gòu)建模塊通過加成制造工藝來制造3d結(jié)構(gòu)-提供可以加速用于移植的解剖學(xué)上正確的組織構(gòu)建體的實現(xiàn)的新穎方法。這些新興技術(shù)及其協(xié)同整合的集合-通過提供模仿正常生理學(xué)和病理生理學(xué)的納米技術(shù)啟用的3d組織模型-不僅可以重新定義再生醫(yī)學(xué)的臨床能力，而且還改變可用于藥物發(fā)現(xiàn)和生物科學(xué)基礎(chǔ)研究的工具箱。

克服現(xiàn)有人工角膜技術(shù)所經(jīng)歷的弊端的方法是提供一種抵抗排斥并且容易與宿主組織整合的組織工程化的基于細胞的角膜替代物。本發(fā)明涉及這樣的方法。

簡要概述

在示例性實施例中，提供了一種使用3d生物打印平臺制造負載細胞的角膜替代物的方法和系統(tǒng)。這樣的人工角膜提供了一種避免在治療角膜上皮疾病的現(xiàn)有方法中涉及的許多并發(fā)癥的新方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，3d生物打印機允許在打印網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的細胞封裝，這使得能夠進行具有微米和納米級分辨率的組織結(jié)構(gòu)的生物打印。承載細胞的角膜替代物可以縮短移植物與宿主組織整合的時間。而且，3d打印的數(shù)字(即，可定制的)性質(zhì)允許人們開發(fā)具有設(shè)計的形狀和曲率的患者特異性組織模型。此類3d打印的角膜組織將在臨床移植、人類眼表面疾病建模(例如，用于干眼病)、替代或減少對動物測試的需要的早期藥物篩選中、以及在用于傷口愈合的藥物功效測試中具有及時應(yīng)用。

根據(jù)示例性實施例，通過單獨培養(yǎng)活的基質(zhì)細胞、活的角膜內(nèi)皮細胞(cec)和活的角膜上皮細胞(cepc)，并且3d生物打印單獨的基質(zhì)層、cec層和cepc層以將細胞包封進單獨的水凝膠納米網(wǎng)格中來制造人工角膜。將cec層附著到基質(zhì)層的第一側(cè)并且將cepc層附著到基質(zhì)層的第二側(cè)以限定人工角膜。

在本發(fā)明的一個方面，用于制造人工角膜的方法包括培養(yǎng)活的基質(zhì)細胞；3d生物打印將活的基質(zhì)細胞包封到第一水凝膠納米網(wǎng)格中的基質(zhì)層；培養(yǎng)活的角膜內(nèi)皮細胞(cec)；3d生物打印將活的cec包封到第二水凝膠納米網(wǎng)格中的cec層；培養(yǎng)活的角膜上皮細胞(cepc)；3d生物打印將活的cepc包封到第三水凝膠納米網(wǎng)格中的cepc層；并且將cec層附著到基質(zhì)層的第一側(cè)并且將cepc層附著到基質(zhì)層的第二側(cè)。在一些實施例中，培養(yǎng)的步驟是平行進行的?？梢云叫羞M行3d生物打印cec層和cepc層的步驟。該cec層可以通過順序地打印基質(zhì)層和cec層而附著于基質(zhì)層的第一側(cè)?？商娲兀揷ec層可以通過在各層之間應(yīng)用水凝膠薄膜并經(jīng)由uv暴露而固化來附著到基質(zhì)層的第一側(cè)。該cepc層可以通過在各層之間應(yīng)用水凝膠薄膜并經(jīng)由uv暴露而固化來附著到基質(zhì)層的第二側(cè)。在優(yōu)選的實施例中，在3d生物打印cec層之前，將cec與丙烯?；?聚乙二醇(peg)-膠原的預(yù)聚物溶液進行混合。該預(yù)聚物溶液可以進一步包括甲基丙烯酸酯化的透明質(zhì)酸(ma-ha)。在另一個優(yōu)選的實施例中，在3d生物打印cepc層之前，將cepc與丙烯?；?peg-膠原的預(yù)聚物溶液進行混合。該預(yù)聚物溶液可以進一步包括ma-ha。在另一個優(yōu)選的實施例中，在3d生物打印基質(zhì)層之前，將基質(zhì)細胞包封在可以進一步包括ma-ha的丙烯?；?peg-膠原水凝膠中。這些基質(zhì)細胞可以按范圍為約500萬/ml至2500萬/ml基質(zhì)細胞的細胞密度進行包封。

在一些實施例中，從角膜緣干細胞(lsc)培養(yǎng)并分化活的cepc。這些lsc可以從自體組織獲得?？梢詮膩碜匀祟惞w的cec祖細胞培養(yǎng)并分化活的cec。這些cec祖細胞可以從自體組織獲得。

在本發(fā)明的另一個方面，人工角膜包括層狀結(jié)構(gòu)，該層狀結(jié)構(gòu)包括3d生物打印的基質(zhì)層(其包含包封進第一水凝膠納米網(wǎng)格中的活的基質(zhì)細胞)，該基質(zhì)層具有第一側(cè)和第二側(cè)；3d生物打印的cec層(其包含包封進第二水凝膠納米網(wǎng)格中的活的cec)；以及3d生物打印的cepc層(其包含包封進第三水凝膠納米網(wǎng)格中的活的cepc)；其中該cec層附著于該基質(zhì)層的第一側(cè)并且該cepc層附著于該基質(zhì)層的第二側(cè)。在人工角膜的一些實施例中，cec層和cepc層中的一個或多個通過在各層之間應(yīng)用并經(jīng)由uv暴露而固化的水凝膠的薄膜附接。

在生物打印基質(zhì)層之前，優(yōu)選地將活的基質(zhì)細胞包封進水凝膠中。該水凝膠可以是丙烯?；?peg-膠原，并且可以進一步包括ma-ha。在生物打印cec層之前，還將活的cec包封進水凝膠中。該水凝膠可以是丙烯?；?peg-膠原，并且可以進一步包括ma-ha。在生物打印cepc層之前，還將活的cepc包封進水凝膠中。該水凝膠可以是丙烯?；?peg-膠原，并且可以進一步包括ma-ha?；畹腸epc可以從經(jīng)培養(yǎng)和分化的lsc獲得。

通過將新興技術(shù)整合到納米技術(shù)、3d生物打印和再生醫(yī)學(xué)的多學(xué)科領(lǐng)域中，我們已經(jīng)開發(fā)了人工角膜以通過消除當(dāng)前對角膜供體組織的依賴性并且通過提供用于恢復(fù)視力(否則，具有嚴重角膜性失明的人類患者將喪失視力)的新策略來改變臨床景象。角膜的原生、多層解剖非常適合作為我們的逐層納米網(wǎng)格整合3d打印方法的初始應(yīng)用。

附圖簡要說明

圖1是3dlp打印系統(tǒng)的實施例的示意圖。

圖2是使用3d活打印而產(chǎn)生的人工角膜的實施例與人類類似物比較的示意圖。

圖3是用于制造根據(jù)本發(fā)明實施例的人工角膜的示例性工藝的流程圖。

圖4a顯示在用基于明膠甲基丙烯酸酯(gelma)的基質(zhì)上培養(yǎng)的lsc進行細胞移植后的兔角膜，該兔角膜顯示典型的角膜上皮組織學(xué)以及無上皮缺陷的平滑且透明的角膜表面，其中左小圖顯示h&e染色，并且右小圖是角膜的白光顯微照片。

圖4b顯示僅覆蓋有人類羊膜的裸露角膜，其顯示上皮組織化生的組織學(xué)和具有血管形成的不透明角膜。

圖4c顯示移植后3個月的兔角膜。

圖5a-c顯示通過3d生物打印產(chǎn)生的各種微結(jié)構(gòu)，其中圖5a顯示使用pegda的具有200μm孔徑的多層圓木樁支架；圖5b顯示gelma中3d打印的血管系統(tǒng)樣顯微結(jié)構(gòu)(比例尺＝30μm)；并且圖5c顯示包封在gelma支架中的10t1/2細胞(比例尺＝1mm)。

圖6示出gelma水凝膠的示例性合成方案。

圖7顯示使用3dlp系統(tǒng)產(chǎn)生的融合cec層。

圖8a-c示出具有不同組分的水凝膠膜的光學(xué)性質(zhì)的評估。

圖9a-9c分別顯示在移植后第5天、第10天和第15天移植角膜的清晰度和功能的逐漸恢復(fù)。

圖10是用于設(shè)計、制造和移植根據(jù)本發(fā)明的實施例的人工角膜的示例性工藝的流程圖。

發(fā)明詳細說明

通過將新興技術(shù)整合到納米技術(shù)、3d生物打印和再生醫(yī)學(xué)的多學(xué)科領(lǐng)域中，我們已經(jīng)開發(fā)了人工角膜以通過消除當(dāng)前對角膜供體組織的依賴性并且通過提供用于恢復(fù)視力(否則，具有嚴重角膜性失明的人類患者將喪失視力)的新策略來改變臨床景象。本發(fā)明的方法利用基于納米的3d打印用于角膜再生。角膜的原生、多層解剖非常適合作為我們的逐層納米網(wǎng)格整合3d打印方法的初始應(yīng)用。

3d活打印(“3dlp”)技術(shù)通過數(shù)字微鏡裝置(dmd)投影和自動化臺來利用一系列層的連續(xù)3d打印。先前已經(jīng)針對不同的應(yīng)用披露了類似的3d打印系統(tǒng)。(參見例如，國際公開號wo2014/197622和國際公開號wo2012/071477，將其通過引用結(jié)合在此)。

使用3d水凝膠基質(zhì)制造人工角膜采用數(shù)字掩模(即，“無掩?！?投影打印，其中在常規(guī)計算機投影儀中發(fā)現(xiàn)的數(shù)字微鏡裝置(dmd)使用紫外線(uv)或適合于所選聚合物的其他光源來聚合并固化光敏液體預(yù)聚物。圖1示出被稱為“動態(tài)投影光固化快速成型”(dpsl)平臺的無掩模投影打印系統(tǒng)2的示例性實現(xiàn)方式。該“無掩?！被驍?shù)字掩模方法允許使用可控且可互換的反射光圖案，而不是如在常規(guī)光刻中使用的那些靜態(tài)的、更昂貴的物理掩模。系統(tǒng)2包括uv光源6、用于指導(dǎo)圖案產(chǎn)生的片狀圖像流生成的計算機控制器10、由大約一百萬個微鏡構(gòu)成的dmd芯片12(其作為動態(tài)掩模嵌入投影儀中)、投影光學(xué)器件14、用于樣本位置控制的平移臺16以及可光固化預(yù)聚物材料13的來源。該dmd芯片12充當(dāng)安裝在微小鉸鏈上的覆鋁反射微鏡的陣列，該鉸鏈使得這些微鏡能夠朝向光源或遠離光源傾斜，在投影表面上產(chǎn)生光(“開”)或暗(“關(guān)”)像素，從而允許其重新定向兩個狀態(tài)[0,1]的光，用兩個偏壓電極傾斜以形成相對于表面的+12°或-12°角。以這種方式，dmd系統(tǒng)可以反射高達1,024種灰度的像素以生成高度詳盡的灰度圖像。

計算機控制器10可以顯示給定層的希望結(jié)構(gòu)8的圖像(如圖所示)和/或可以顯示基質(zhì)的希望參數(shù)。石英窗或其他透光材料15、間隔物18以及基底19都支撐在平移臺16上，它們限定了包含預(yù)聚物溶液13的打印體積或“翁(vat)”。可以使用注射泵(未示出)根據(jù)需要將另外的溶液13引入打印體積中?；谟煽刂破?0生成的命令，該系統(tǒng)使用dmd芯片12(1920×1080分辨率)對平行的uv光進行空間調(diào)制，以將自定義的光學(xué)圖案投影到可光固化的預(yù)聚物溶液13上。

為了產(chǎn)生3d結(jié)構(gòu)，投影光固化快速成型平臺(例如，dpsl)采用逐層制造程序。在示例性方法中，3d計算機透視圖(用cad軟件或ct掃描制成)被解構(gòu)成一系列均勻間隔的平面或?qū)?。出于說明的目的，在計算機控制器10的顯示器8上展示了表示一層所希望的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)的簡單的蜂窩圖案。每層的圖案被輸入到dmd芯片12中，從而將uv光暴露到可光固化(預(yù)聚物)材料13上以產(chǎn)生聚合物結(jié)構(gòu)17。在對一層形成圖案之后，計算機控制器10降低自動化臺16，并且顯示下一個圖案以構(gòu)建聚合物結(jié)構(gòu)17的高度。通過對計算機控制器10進行編程，用戶可以控制平臺速度、光強度和結(jié)構(gòu)17的高度，從而允許制造各種復(fù)雜結(jié)構(gòu)20。應(yīng)當(dāng)注意，雖然示出了單個蜂窩結(jié)構(gòu)，但是可以使用圖案的任何組合來構(gòu)造彼此疊加的不同圖案的多層結(jié)構(gòu)。

作為dmd芯片的一個代替方案，可以使用檢流計光學(xué)掃描儀或多邊形掃描鏡。這兩種技術(shù)均可商購獲得，它們在快速掃描共聚焦顯微鏡中的應(yīng)用是已知的。選擇一種適當(dāng)?shù)膾呙铏C制來與本發(fā)明的系統(tǒng)和方法結(jié)合使用將在本領(lǐng)域技術(shù)人員的水平之內(nèi)。

根據(jù)示例性實施例，用于制造基于細胞的人工角膜的方法遵循3步策略。參考圖3，在步驟32中，我們建立并優(yōu)化了在嵌有納米網(wǎng)格的基底膜上生長cepc(角膜上皮細胞)和cec(角膜內(nèi)皮細胞)的培養(yǎng)條件。在確定最佳培養(yǎng)條件后，按照我們的3dlp系統(tǒng)上的逐層方案，我們使用3d活打印組裝三個角膜層。在步驟34中，將基質(zhì)細胞以范圍為約500萬/ml至2500萬/ml基質(zhì)細胞的細胞密度包封在類似于原生角膜的ac-col水凝膠(7.5wt％加25wt％pegda)(丙烯?；?peg-膠原)中。用于打印該層的投影時間可以在1秒至5秒之間。在步驟36中，將經(jīng)由3d納米打印制造的納米網(wǎng)格同時嵌入基質(zhì)層中。使用來自步驟32的優(yōu)化條件，經(jīng)由兩個平行方案將cec層和cepc層與基質(zhì)組裝：在步驟38和40中，將cec與ac-col預(yù)聚物溶液(5wt％)混合并經(jīng)由光聚合30秒與納米網(wǎng)格一起打印到基質(zhì)層上。在步驟42和44中，可以使用類似的方法打印在基質(zhì)的另一側(cè)上的cepc層。cec層和cepc層不需要同時或順序地打印在基質(zhì)層的相對側(cè)上?？商娲兀A(yù)先開發(fā)的cec層和cepc層(在其各自的摻入納米網(wǎng)格的基底膜上已經(jīng)具有融合的細胞層)可以通過在各層之間應(yīng)用ac-col薄膜并經(jīng)由uv暴露而固化來“膠合”到基質(zhì)上(步驟46)。將最終打印的構(gòu)建體用鹽水緩沖液充分沖洗以消除任何殘留的未聚合的溶液(步驟未顯示)，并進一步保持在培養(yǎng)基中直到移植。最后，這些3d打印的角膜被準備好用于移植和功能評估。

以下實例提供了在本發(fā)明的實施例中使用的步驟的細節(jié)：

實例1：在基底膜上生長cepc、cec和基質(zhì)細胞

角膜上皮細胞(cec)經(jīng)歷從角膜緣干細胞或祖細胞(lsc)的連續(xù)再生、以及在lsc或角膜上皮中的缺陷，其將角膜變成不透明的角質(zhì)化皮膚樣上皮，引起導(dǎo)致失明的角膜表面疾病。lsc在健康個體中如何維持和分化為角膜上皮，以及哪些分子事件在患者中有缺陷在很大程度上是未知的。

傳統(tǒng)上，lsc生長和擴增過程需要小鼠3t3飼養(yǎng)細胞，其攜帶來自動物產(chǎn)品的污染的風(fēng)險，因此使其不適合產(chǎn)生臨床上可行的3d生物打印的角膜。為了克服這些障礙，開發(fā)了一種體外無飼養(yǎng)細胞的、化學(xué)限定的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)以生長來自兔和人類供體的lsc，以使得lsc的均質(zhì)群體能夠產(chǎn)生和擴增，并且隨后分化為角膜上皮細胞(cepc)。該培養(yǎng)系統(tǒng)基于以下測定：轉(zhuǎn)錄因子p63(腫瘤蛋白63)和pax6(成對盒蛋白pax6)一起起作用來指定lsc，并且wnt7a通過pax6控制角膜上皮分化。在角膜緣干細胞中，wnt7a作用于pax6的上游，并且經(jīng)由卷曲同源物5(fzd5)(wnt蛋白的受體)刺激其表達。wnt7a是分泌的成形素，其參與發(fā)育性和致病性wnt信號傳導(dǎo)。pax6是控制各種眼組織的命運和分化的轉(zhuǎn)錄因子。rnai介導(dǎo)的wnt7a或pax6的敲除誘導(dǎo)人角膜緣干細胞從角膜轉(zhuǎn)換到皮膚上皮形態(tài)，一種與常見的人類角膜疾病緊密相關(guān)的關(guān)鍵缺陷。wnt7a和pax6敲除細胞還具有比野生型角膜緣細胞更低的角膜角蛋白3(krt3；ck3)和krt12的表達和更大的皮膚上皮krt1和krt10的表達。

值得注意地，pax6在皮膚上皮干細胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)足以將它們轉(zhuǎn)化為lsc樣細胞，并且在移植到兔角膜損傷模型中的眼睛上時，這些重新編程的細胞能夠補充cec并修復(fù)損傷的角膜表面。該方法的進一步細節(jié)描述于以下文獻中公開的快報中：《自然》(nature)，“wnt7a和pax6限定角膜上皮體內(nèi)平衡和發(fā)病機制(wnt7aandpax6definecorneralepitheliumhomeostatisandpathogenesis)”，《自然》(2014)doi:10.1038/nature13465，于2014年7月2日在線公開，將其通過引用結(jié)合在此。增殖性lsc的特征在于p63和k19的表達，高百分比染色對有絲分裂標記ki67呈陽性。我們建立了3dlsc分化系統(tǒng)，其中分層的cepc層在類似于包曼氏(bowman’s)膜的基底膜中生長。小分子-rock抑制劑y27632用于指導(dǎo)lsc分化為cepc，如通過cepc特異性標記k3/k12的強表達所證明的。

平行地，我們開發(fā)了無飼養(yǎng)細胞的、化學(xué)限定的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，該細胞培養(yǎng)系統(tǒng)含有成纖維細胞生長因子2(fgf2)以生長來自人類供體的cec祖細胞。然后將這些cec祖細胞擴增成cec祖細胞的均質(zhì)群體，該均質(zhì)群體隨后分化為cec。我們觀察到存在于原生解剖中的六角形形態(tài)，具有典型的cec標記zo-1的強表達。

而且，我們測試了在基于明膠甲基丙烯酸酯(gelma)的基質(zhì)上培養(yǎng)的lsc可能用于治療和修復(fù)在模擬人類常見的角膜疾病狀況的兔lsc缺陷模型上的角膜上皮缺陷的潛能。在這個測試中，兔gfp標記的lsc移植物形成了具有角膜特異性k3/12的陽性染色的上皮細胞的連續(xù)薄片，并且成功修復(fù)了整個角膜表面的上皮缺陷，并且恢復(fù)和維持了角膜清晰度和透明度超過5個月。

圖4a-4c示出了這些測試的結(jié)果：圖4a顯示用在基于gelma的基質(zhì)上培養(yǎng)的gfp標記的lsc進行細胞移植后的兔角膜，該兔角膜顯示典型的角膜上皮組織學(xué)(左小圖：h&e染色)以及無上皮缺陷的光滑和透明的角膜表面(右小圖：白光顯微照片)。圖4b顯示僅覆蓋有人類羊膜的裸露角膜。左小圖顯示上皮組織化生的組織學(xué)，右小圖顯示具有血管形成的不透明角膜。圖4c顯示移植后三個月的光滑的、透明的兔角膜。將在基于gelma的基質(zhì)上生長的培養(yǎng)的gfp+lsc用于移植實驗中，其中它們用k3/12共染色以顯示其與受體角膜上皮的整合。

還在體外培養(yǎng)和擴增角膜基質(zhì)細胞。這些基質(zhì)細胞共享成纖維細胞的類似標記，例如纖連蛋白、fsp1和波形蛋白。

實例2：3d生物打印

3d生物打印平臺提供了用于構(gòu)建承載細胞的水凝膠支架的快速生物制造方法，該支架1)具有由天然來源的生物材料構(gòu)成的復(fù)雜的用戶定義的3d幾何結(jié)構(gòu)；2)允許包封在水凝膠內(nèi)的細胞的一致的3d分布；3)支持細胞活力和增殖；并且4)特征為動態(tài)的、多尺度力學(xué)的細胞-支架相互作用。重要的是，這些構(gòu)建體使得能夠控制和整合復(fù)雜的3d幾何結(jié)構(gòu)，同時提供封裝細胞的生理學(xué)相關(guān)的內(nèi)部3d分布。通過對3d支架中生物因子的空間和時間分布的這種精確控制，我們能夠評估細胞與細胞外基質(zhì)(ecm)蛋白在納米長度尺度上的相互作用，其最終目標是創(chuàng)建先進的、臨床上可轉(zhuǎn)移的仿生支架。

使用3d生物打印，使用與原生角膜相同的尺寸和曲率來制造人工角膜以復(fù)制患者的角膜。天然來源的材料可以支持構(gòu)建體內(nèi)的細胞生長并復(fù)原宿主細胞以更好地整合構(gòu)建體。由于3d打印技術(shù)的高效率，幾秒鐘就足以完成一層。因此，在每層內(nèi)保持高度均質(zhì)的細胞分布是可能的。此外，可以精確控制不同細胞類型的空間定位，這是角膜功能的關(guān)鍵。例如，我們可以制造約5微米(即，小于細胞)的小特征。利用這種分辨率，我們可以控制非常小的細胞群體，甚至單個細胞的空間定位。通過使用不同降解概況的材料，我們可以指導(dǎo)細胞遷移，從而控制其時間分布。通過在構(gòu)建體內(nèi)圖案化生長因子，我們還可以調(diào)節(jié)細胞增殖/分化，并管理細胞分布。

圖5a-c顯示通過3d生物打印產(chǎn)生的示例性顯微結(jié)構(gòu)：圖5a，使用pegda的具有200μm孔徑的多層圓木狀支架；圖5b，gelma中的3d打印的血管系統(tǒng)樣顯微結(jié)構(gòu)(比例尺＝30μm)；圖5c，包封在gelma支架中的10t1/2細胞在包封后8小時保持有活力并增殖，經(jīng)由鈣黃綠素-am/乙錠同二聚體的存活/死亡測定進行評估(比例尺＝1mm)。

實例3：用于角膜組織的生物材料

膠原已被廣泛用作角膜組織工程化的生物材料，因為它包含角膜細胞外基質(zhì)(ecm)的主要組分。作為基質(zhì)成分的膠原已被證明支持上皮細胞形成保護層并且促進通過神經(jīng)元的再神經(jīng)支配?；瘜W(xué)交聯(lián)的生物合成膠原基質(zhì)已經(jīng)在i期臨床試驗中顯示出顯著的前景。為了調(diào)節(jié)膠原基質(zhì)的降解和機械性能，大多數(shù)研究已經(jīng)使用化學(xué)交聯(lián)方法，這些化學(xué)交聯(lián)方法在很大程度上與細胞包封不相容。丙烯酰基-peg-膠原(ac-col)由于其生物相容性、光學(xué)性質(zhì)和光聚合能力而為角膜組織工程化提供了極好的替代物。已經(jīng)進行初步測試以評估由gelma(其為ac-col類似物)制成的承載基質(zhì)細胞的膜的光學(xué)性質(zhì)。圖6示出gelma水凝膠的示例性合成方案。使用3dlp系統(tǒng)將cec接種并培養(yǎng)在用gelma制造的光學(xué)透明角膜基質(zhì)上。甚至在形成融合的cec細胞薄片(顯示于圖7中)之后，保持了構(gòu)建體的透明性。

對不同的雜交水凝膠組合和暴露時間對光學(xué)透明度的影響進行了評價。圖8a-8c示出了針對每種組合比較通過所制造的結(jié)構(gòu)觀察的ucsd標志的光學(xué)清晰度的結(jié)果。圖8a展示了具有1wt％ma-ha(甲基丙烯酸酯-透明質(zhì)酸)(mw＝200kda)的7.5wt％gelma(明膠甲基丙烯酸酯)的降低的透明度，uv暴露＝1分鐘。如圖8b所示，用7.5wt％gelma、1wt％ma-ha(mw＝200kda)和2.5％pegda(聚(乙二醇)二丙烯酸酯)(mw＝700kda)實現(xiàn)了透明度的改善，uv暴露＝30秒。使用7.5wt％gelma、2.5wt％ma-ha(mw＝200kda)和2.5％pegda(mw＝700kda)與uv暴露＝30秒仍然獲得了更好的透明度。這些結(jié)果表明，隨著ma-ha濃度從1wt％增加到2.5wt％，清晰度增加。

已經(jīng)測試了幾種材料組合物，并且大多數(shù)材料選擇的光學(xué)性質(zhì)非常好。在一個實例中，用7.5wt％gelma或ac-col和25wt％pegda加0.075wt％lap(苯基-2,3,6-三甲基苯甲?；瘟姿徜?作為光引發(fā)劑，產(chǎn)生了在280nm至1000nm的范圍內(nèi)與pbs溶液展示相當(dāng)?shù)奈舛鹊耐该髂?。uv暴露時間似乎不影響該膜的透明度。就ma-ha而言，具有2.5wt％ma-ha和2.5％pegda的7.5wt％gelma在30秒的uv暴露后也提供極好的光學(xué)性質(zhì)。

如本領(lǐng)域已知的，因為大多數(shù)光引發(fā)劑是細胞毒性的。選擇光引發(fā)劑的類型和濃度以獲得所希望的膜性質(zhì)，同時保持細胞活力將在本領(lǐng)域技術(shù)水平內(nèi)。

實例4：3d打印的角膜的移植

使用如上所述的3d活打印來制造三個角膜層。具體地，將pegda納米網(wǎng)格嵌入丙烯?；?peg-膠原中以支持角膜基質(zhì)。將cepc層和cec層建立在基質(zhì)層的每一側(cè)。將所得的生物打印的角膜移植到兔受體眼睛上。

通過肌內(nèi)注射鹽酸賽拉嗪(2.5mg/ml)和鹽酸氯胺酮(37.5mg/ml)將新西蘭白兔麻醉。使用飛秒激光機(zeiss)在受體眼中產(chǎn)生具有反向紐扣樣結(jié)構(gòu)的角膜受體基質(zhì)床。將生物打印的角膜供體組織切割成紐扣形結(jié)構(gòu)以擬合到制備的受體基質(zhì)床上。然后通過人類羊膜(生物組織公司(bio-tissue))覆蓋表面，將該表面用10.0vicryl縫合線(愛惜康公司(ethicon))固定到受體結(jié)膜上。圖9a和9b分別顯示在移植后第5天和第10天清晰度和功能的逐漸恢復(fù)。在移植后第15天觀察到角膜水腫的逐漸減少和角膜清晰度的逐漸增加(如圖9c中所示)，這表明角膜內(nèi)皮的功能恢復(fù)。觀察到角膜表面上皮是光滑和完整的，這表明功能性移植的cepc。

根據(jù)本文所述的實施例，3d生物打印技術(shù)的使用允許細胞包封，使得能夠活打印具有微米和納米分辨率的組織結(jié)構(gòu)。承載細胞的角膜替代物可以減少移植物與宿主組織整合所需的時間量。此外，3d打印的數(shù)字(即，可定制的)性質(zhì)允許開發(fā)具有設(shè)計的形狀和曲率的患者特異性組織模型?？梢愿鶕?jù)患者的原生角膜設(shè)計定制的形狀和曲率。

使用本領(lǐng)域已知的程序，可以在移植程序之前為患者獲得角膜地形圖測量。例如，臨床實踐中使用的儀器最?；谄绽鞫?placido)反射圖像分析，其使用對投射在角膜上的多個同心環(huán)的反射圖像的分析來獲得角膜散光測量的屈光范圍和表面曲率。使用通過這種測試產(chǎn)生的臨床數(shù)據(jù)，計算機軟件可以用于產(chǎn)生患者特異性角膜設(shè)計，然后將使用3d打印平臺來制造該角膜設(shè)計?？梢允褂弥饘哟蛴》椒?。在一些情況下，為了產(chǎn)生高度復(fù)雜的角膜幾何結(jié)構(gòu)，可以適當(dāng)?shù)乩梅蔷€性3d打印方案，例如在2015年9月16日提交的pct申請?zhí)杙ct/us2015/050522中披露的方案，將該申請通過引用結(jié)合在此。

圖10總結(jié)了用于根據(jù)本發(fā)明的實施例的人工角膜的設(shè)計、制造和移植的示例性程序。以確定角膜的替換是醫(yī)學(xué)上必需的開始，在步驟50中，使用用于測量患者角膜的臨床儀器來產(chǎn)生數(shù)據(jù)。使用計算機輔助設(shè)計軟件，在步驟52中，開發(fā)一系列打印步驟以控制3dlp打印機將人工角膜制造為患者眼睛的正確尺寸和所希望的特征。與創(chuàng)建用于打印患者特異性角膜的計算機控制程序并行地，在步驟60至67中將基質(zhì)細胞和lsc培養(yǎng)并混合到預(yù)聚物溶液中。盡管不限于使用患者自身的細胞，但使用自體組織作為基質(zhì)細胞、祖細胞cec、和/或lsc的來源可以提供另外的優(yōu)點，即減少或消除對免疫抑制的可能需求。在步驟63和66中，分別使lsc分化為cepc，并且使來自人類供體的cec祖細胞分化為cec。在步驟61、64和67中，將培養(yǎng)的細胞各自混合到預(yù)聚物溶液中。(應(yīng)當(dāng)注意，雖然流程圖顯示在形成cec層和cepc層之前制備基質(zhì)層，但是這三層中的一個或多個可以在不同時間打印，例如提前打印，或者它們可以被平行打印，即，不是以特定的順序打印，并且如上所述地組裝。)在步驟54中，將培養(yǎng)的基質(zhì)細胞、cec和cepc如上所述地摻入其各自的層中。它們可以被順序地打印或單獨地打印，并且從單獨打印的層組裝以限定角膜的cec-基質(zhì)-cepc分層結(jié)構(gòu)。在步驟56中使用本領(lǐng)域已知的程序去除有缺陷的角膜，并且制備基質(zhì)床以接收移植物，隨后在步驟58中移植人工角膜。

根據(jù)本文所述的程序制造的3d打印的角膜組織將在臨床移植、人眼表面疾病建模(例如，用于干眼病)、替代或減少對動物測試的需要的早期藥物篩選中、以及在用于傷口愈合的藥物功效測試中具有及時應(yīng)用。這種技術(shù)為臨時或永久角膜替代品的開發(fā)提供了堅實的基礎(chǔ)。本文所述的實施例可以導(dǎo)致容易獲得的復(fù)雜的工程化組織，這些組織重現(xiàn)其天然人類對應(yīng)物的功能并且適合于臨床應(yīng)用以及新興生物醫(yī)學(xué)研究。

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