專利名稱：一種人工組織工程化的生物角膜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于構(gòu)建組織工程化生物角膜的構(gòu)建載體。
組織工程學(xué)是一門運用工程學(xué)與生命科學(xué)的原理和方法，它通過不同的組織構(gòu)建方式使細胞與載體結(jié)合，構(gòu)成具有特定的三維結(jié)構(gòu)和生物活性的人工組織或器官，用于替代或修復(fù)人體的病損器官和組織，達到恢復(fù)組織形態(tài)與功能的目的。標(biāo)志著醫(yī)學(xué)將超越組織和器官移植的舊模式，進入人工制造組織和器官的時代，通過組織工程手段構(gòu)建人工組織工程化生物角膜將解決或緩解此供需矛盾。通過組織工程構(gòu)建組織的必需原料是構(gòu)建載體和種子細胞。
目前制約組織工程化生物角膜研究的瓶頸是構(gòu)建載體，由于角膜獨特的生理和光學(xué)特性，要求用于構(gòu)建生物角膜基質(zhì)必須具有(1)適合細胞生長和粘附的微環(huán)境；(2)穩(wěn)定的角膜厚度和角膜曲率，以維持屈光度穩(wěn)定；(3)高透明度；(4)適度地強度和彈性；(5)良好的神經(jīng)支配。否則，將影響生物角膜的臨床應(yīng)用和效果。
但是目前構(gòu)建角膜或與角膜類似的組織工程化組織的載體高分子材料和膠原均不能滿足上述要求1)以高分子材料為載體構(gòu)建的角膜不但透明差，而且不能建立角膜神經(jīng)支配，如Mimami等(1993)用人工合成基質(zhì)構(gòu)建的三維牛角膜，就是由于人工基質(zhì)的缺陷(不透明和抗拉力弱)，不能用于移植(Mimami Y，et al.Reconstruction of cornea in three-dimensionalcollagen gel matrix culture.Invest Ophthalmol Vis Sci.1993；34(7)2316.)。研究也發(fā)現(xiàn)聚羥基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)類等材料的透明度和穩(wěn)定性差，需要進一步改進，若用于構(gòu)建組織工程化生物角膜需要進一步改進(商慶新、胡曉潔、曹宜林組織工程技術(shù)構(gòu)建角膜基質(zhì)層的實驗研究，中華眼科雜志，2001，37252)。
2)膠原合成基質(zhì)載體構(gòu)建的角膜強度更差。Griffith等(1999)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立“永生化”細胞系在實驗室成功重組了功能、結(jié)構(gòu)與正常角膜相似的生物角膜，被“science”雜志譽為人類角膜生物組織工程和組織移植中的最大突破和里程碑(Griffith M，et al.Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.Science 1999；286(5447)2169-72.)，也是由于強度不夠，未能進行動物實驗，離臨床應(yīng)用的要求相差就更遠了，另外由于膠原易被膠原酶消化，因此不穩(wěn)定，進而影響角膜的光學(xué)性能和移植細胞的長期存活。
正常的角膜基質(zhì)是角膜細胞正常附著和長期存活的基礎(chǔ)，健康的角膜緣基質(zhì)形成了穩(wěn)定的細胞“龕”，支持了角膜緣干細胞正常分化和增殖，這是高分子材料和膠原載體所不具備的優(yōu)勢。Lange等(1993)用牛Descemet′s膜為載體將角膜內(nèi)皮細胞移植到新西蘭白兔，所有植片保持透明12-17天(Lange-TM，et al.Corneal endothelial celltransplantation using Descemet′s membrane as a carrier.J-Cataract-Refract-Surg.1993；19(2)232-5.)，Bohnke等(1998，1999)用Descemet′s膜為載體，也成功地將人和豬角膜內(nèi)皮細胞移植到人眼(Bohnke-M，et al.Detection of neurone-specific enolase in long-termcultures of human corneal endothelium.Graefes Arch Clin ExpOphthalmol.1998；236(7)522-6.及Bohnke-M，et al.Transplantation ofcultured adult human or porcine corneal endothelial cells onto humanrecipients in vitro.Part IIEvaluation in the scanning electron microscope.Cornea.1999；18(2)207-13.)。自1994年開始，我們對異種角膜基質(zhì)免疫原性、移植后角膜神經(jīng)恢復(fù)、植床組織學(xué)變化、移植后不同時期角膜透明度、屈光度和厚度變化等方面進行了系列研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)角膜基質(zhì)的免疫原性很低，異種移植后角膜基質(zhì)的厚度、屈光度保持不變，自體神經(jīng)可以長入，角膜知覺大部恢復(fù)，上皮細胞粘附牢固，細胞間和細胞與基質(zhì)問生理連接正常，將猴角膜基質(zhì)植入人角膜層間，已維持透明近10年，表明利用異種角膜基質(zhì)是目前最理想的構(gòu)建角膜載體。
構(gòu)建技術(shù)方面，目前國內(nèi)外構(gòu)建組織工程化生物角膜的主要方法是氣-液界面和三維立體培養(yǎng)，Zieske等(1994)報道重組的三維角膜移植后，細胞有半橋粒、錨纖維和連續(xù)的基底膜形成，α烯醇酶和K3的分布與正常角膜緣完全相同(Zieske JD，et al.Basement membraneassembly and differentiation of cultured corneal cellsimportance ofculture environment and endothelial cell interaction.Exp Cell Res.1994；214621-33.)。Engelmann等(1999)分別取得豬和人內(nèi)皮細胞達3,450/mm2和1,850/mm2的最大終密度(Engelmann K，et al.Transplantation of adult human or porcine comeal endothelial cells ontohuman recipients in vitro.Part ICell culturing and transplantationprocedure.Cornea.1999；18199-206.)。
本發(fā)明所述的人工組織工程化生物角膜，按照以下方法制備取新鮮、脫細胞處理或保存后的異種角膜基質(zhì)，除去角膜內(nèi)皮細胞和角膜上皮細胞后，在其表面分別種植相應(yīng)細胞，構(gòu)建成為具有正常角膜結(jié)構(gòu)的人工組織工程化生物角膜。另外，使用顯微板層角膜切削刀、微型角膜車床或激光切削加工上述異種角膜基質(zhì)可以制作成為具有不同屈光度的角膜基質(zhì)片，用作構(gòu)建生物角膜的載體。
本發(fā)明的主要發(fā)明點在于以角膜基質(zhì)為載體，制得的人工組織工程化生物角膜，免疫原性很低，可以用于異種移植，移植后角膜基質(zhì)的厚度、屈光度保持不變，自體神經(jīng)可以長入，角膜知覺大部恢復(fù)，上皮細胞貼附牢固，細胞間和細胞與基底膜間生理連接正常。
利用新鮮、脫細胞處理或保存后的異種角膜基質(zhì)，如豬、羊、貓、猴、牛、馬、驢等動物類或魚類的角膜基質(zhì)，除去角膜內(nèi)皮細胞和角膜上皮細胞后，在其表面分別種植相應(yīng)細胞，構(gòu)建成為具有正常角膜結(jié)構(gòu)的人工組織工程化生物角膜。加工上述異種角膜基質(zhì)，使其具有不同的外部形狀(根據(jù)臨床需要的角膜形狀加工)和獲得不同的屈光度(屈光度可從-40D～+40D)后，可用于構(gòu)建人工組織工程化生物角膜。下面是本發(fā)明專利的最佳實施例子實施例子1取新鮮異種角膜，利用Dispase II消化法除去其前后表面的上皮細胞和內(nèi)皮細胞，以此異種角膜基質(zhì)片為載體，以同種異體角膜緣細胞和“永生化”內(nèi)皮細胞為種子細胞，利用微重力聯(lián)合氣液界面法使種子細胞與異種角膜基質(zhì)載體緊密附著，形成前表面為5～7層上皮細胞，后表面為單層內(nèi)皮細胞的生物角膜，進行動物實驗，根據(jù)移植后免疫、組織學(xué)恢復(fù)、視光學(xué)改變、手術(shù)方法等方面的研究觀察結(jié)果，改進和完善構(gòu)建和移植方法。
實施例子2取干燥或冷凍保存的異種角膜，用激光消融除去異種角膜前后表面的上皮細胞和內(nèi)皮細胞，然后使用顯微板層角膜切削刀、激光或微型角膜車床加工，使其具有一定的屈光度，以此異種角膜基質(zhì)片為載體，以誘導(dǎo)分化的胚胎干細胞源性角膜上皮細胞、角膜內(nèi)皮細胞為種子細胞，利用微重力和氣液界面法構(gòu)建生物角膜。
新構(gòu)建出的生物角膜內(nèi)皮細胞的密度達到2000個細胞/mm2以上，角膜上皮細胞達到5~7層。具有免疫原性低、細胞結(jié)構(gòu)和功能正常，移植后厚度、屈光度保持不變，自體神經(jīng)可以長入、角膜知覺大部恢復(fù)，上皮細胞貼附牢固，細胞間和細胞與基底膜間生理連接正常。
實施例子3用激光消融除去異種角膜前后表面的上皮細胞和內(nèi)皮細胞，使用顯微板層角膜切削刀、激光或微型角膜車床加工，使其具有一定的屈光度，同時或單純在其前后表面涂布隔水材料(如交聯(lián)的硅化合物等，要求材料與角膜基質(zhì)表面粘附性好、涂層透明度高，特別是具有與眼球良好的組織相容性和穩(wěn)定性)，使隔水材料在角膜基質(zhì)表面交聯(lián)，用于活體移植。
權(quán)利要求
1.一種人工組織工程化的生物角膜，按照以下方法制備取新鮮、脫細胞處理或保存后的同種異體或異種角膜基質(zhì)，除去角膜內(nèi)皮細胞和角膜上皮細胞后作為載體，在其表面分別種植相應(yīng)細胞，構(gòu)建成為具有正常角膜結(jié)構(gòu)的人工組織工程化生物角膜。
2.按照權(quán)利要求1所述的人工組織工程化生物角膜，其特征在于所述的同種異體或異種角膜經(jīng)酶消化法或激光消融法處理，除去角膜內(nèi)皮細胞和角膜上皮細胞，成為單純含有顯微膠原板層的角膜基質(zhì)載體。
3.按照權(quán)利要求1所述的人工組織工程化生物角膜，其特征在于制做角膜基質(zhì)載體的角膜可以是含有基質(zhì)細胞的新鮮角膜，也可以是經(jīng)過保存處理過的不含角膜基質(zhì)細胞的角膜。
4.按照權(quán)利要求1所述的人工組織工程化生物角膜，其特征在于角膜基質(zhì)經(jīng)顯微板層角膜切削刀和微型角膜車床加工制作成為具有不同屈光度的角膜基質(zhì)鏡片，用作構(gòu)建生物角膜的載體。
5.按權(quán)利要求1所述的人工組織工程化生物角膜，其特征在于在載體表面種植的細胞是同種異體角膜緣細胞、角膜內(nèi)皮細胞和誘導(dǎo)分化的胚胎干細胞源性角膜細胞。
6.按照權(quán)利要求1所述的人工組織工程化生物角膜，其特征在于細胞種植的方法采用微重力、氣液界面法、三微構(gòu)建法或聯(lián)合構(gòu)建法。
7.按照權(quán)利要求1所述的人工組織工程化生物角膜，其特征在于可以同時或單純在制做的角膜基質(zhì)載體前后表面涂布隔水材料。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人工組織工程化的生物角膜。本發(fā)明利用同種異體或異種角膜基質(zhì)為載體，在其上面種植培養(yǎng)細胞后構(gòu)建組織工程化生物角膜。該載體可以不加工或預(yù)加工后使用。使用該載體構(gòu)建角膜具有免疫原性很低，移植后厚度、屈光度保持不變，自體神經(jīng)可以長入、角膜知覺大部恢復(fù)，上皮細胞貼附牢固，細胞間和細胞與基底膜間生理連接正常的特點。
文檔編號A61F2/14GK1473551SQ0314011
公開日2004年2月11日 申請日期2003年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月7日
發(fā)明者王智崇, 葛堅, 陳冬 申請人:中山大學(xué)中山眼科中心